AV | EMT | GEFs | OT | ROCK |

Во время раннего кардиального морфогенеза на стадии петлеобразования сердца, некоторые из эндотелиальных клеток, составляющие области atrioventricular (AV) и outflow tract (OT) одиночной сердечной трубки меняют фенотип, чтобы стать мезенхимными клетками и мигрируют в соседний утолщенный бесклеточный внеклеточный матрикс (кардиальный гель; Davis, [1927]), чтобы образовать ткань эндокардиальных подушек, зачатки клапанов и перегородку взрослого сердца. Во время этой endothelial-mesenchymal transformation (EMT), эндотелиальные клетки обнаруживают последовательные изменения клеточного фенотипа, включая эндотелиальную гипертрофию, поляризацию аппарата Гольджи, потерю межклеточных контактов, образование миграторных придатков и инвазию в кардиальный гель (Markwald et al., [1975], [1977]). Этот эмбриональный феномен регулируется с помощью испускаемых миокардом индуктивных сигналов, которые включают bone morphogenetic protein, transforming growth factor-β и др. неизвестные индуктивные молекулы (Mjaatvedt and Markwald, [1989]; Mjaatvedt et al., [1991]; Potts et al., [1991]; Nakajima et al., [1994], [1998]; Yamagishi et al., [1999]; Sinning and Mckay, [2004]). Известно также, что pertussis toxin, специфический ингибитор или GTP-связывающих белков или малых GTP-связывающих белков (Ueda et al., [2001]), ингибирует EMT (Boyer et al., [1999]). Эта находка указывает на то, что один или более GTP-связывающих белков участвуют в путях сигнальной трансдукции во время EMT.

GTP-связывающие белки являются сигнал-передающими белками, которые купируют большое количество связанных с мембраной рецепторов, регулируя разнообразные внутриклеточные эффекторные системы. Rho является одним из малых GTP-связывающих белков, а циклы между GDP-связанными неактивными и GTP-связанными активными формами происходят как внутриклеточные молекулярные переключения (Aelst and D'Souza-Schorey, [1997]; Aelst and Symons, [2002]). Циклические процессы между GTP-Rho и GDP-Rho регулируются с помощью guanine nucleotide exchange factors (GEFs), GTPase-activating proteins (GAPs) и guanine nucleotide-dissociated inhibitors (GDIs). GTP-Rho активирует нижестоящие эффекторы, Rho-associated coiled-coil kinases (ROCKs), p160ROCK/ROCK1/ROK и Rho kinase/ROCK2/ROK (Matsui et al., [1996]; Nakagawa et al., [1996]; Bishop and Hall, [2000]). ROCKs являются serine/threonine протеин киназами, участвующими в регуляции реорганизации цитоскелета, такой как формирование стрессовых волокон в не мышечных клетках (Amano et al., [1997]). Путь Rho-ROCK регулирует также фосфорилирование myosin light chain (MLC), чтобы обеспечить контракцию актомиозиновых пучков с помощью прямого фосфорилирования MLC и путем инактивации myosin phosphatase (Amano et al., [1996]; Fukata et al., [2001]).

Во время развития позвоночных, Rho-ROCK пути важны для разных процессов, включая и кардиогенез и нейральное развитие, посредством эффектов на реорганизацию актинового цитоскелета, которая контролирует миграцию и дифференцировку клеток (Wunnenberg-Stapleton et al., [1999]; Henderson et al., [2000]; Wei et al., [2001], [2002]; Zhao and Rivkees, [2003], [2004]). Недавние эксперименты показали, что Rho-ROCK пути участвуют в раннем развитии сердца и что ROCK-ингибитор блокирует или слияние билатеральной сердечной мезодермы или формирование соотв. сердечных камер (Wei et al., [2001]; Zhao and Rivkees, [2003]; Kaarbo et al., [2003]). Zhao and Rivkees ([2004]) сообщили, что ROCKs играют роль в дифференцировке эндотелильаных клеток и миграции во время образования эндокардиальных подушек у мышей. Однако, паттерн пространственно-временной экспрессии ROCK белка во время кардиогенеза и то, как ROCKs контролируют дифференцировку и миграцию эндокардиальных клеток всё ещё неизвестно. Используя иммуногистохимическое окрашивание для ROCK1 и -2 и метод трехмерных культур в коллагеновом геле мы показали, что трансформирующиеся эндотелиальные клетки и мигрирующие мезенхимные клетки экспрессируют ROCK1 и -2 и что ROCK ингибитор, Y27632, ингибирует установление полярности эндотелиальных клеток и инвазию мезенхимных клеток во время EMT.

RESULTS

ROCK1 and -2 Are Expressed in the Developing Heart

Рис.1. | Rho-associated coiled-coil kinases (ROCKs) are expressed in the developing chick heart. Stage 14 to 23 hearts were stained with anti-ROCK1 or -2 antibody. a,b,o,p: Stage14, ROCKs are expressed in hypertrophied atrioventricular (AV) endothelial cells (arrowheads), presumably transforming cells, and in the myocardium (M). c-e,q,r: Stage 16 transforming/invading atrioventricular (AV) endothelial cells express ROCK1 and -2 (arrowheads). High-magnification view shows ROCK is distributed in the transforming endothelial cells with a cytoplasmic staining pattern (arrowheads in e). f-j,s-v: Stage 18-23 AV endocardial cushion mesenchyme expresses ROCK1 and -2 (arrowheads). Migrating mesenchymal cells express ROCK in migratory appendages as well as in the perinuclear region (arrowheads in h). Although ROCK1 is expressed in the inner myocardium adjacent to the endocardial cushion tissue (arrows in f-j), its expression in the trabeculated myocardium appears to be down-regulated. ROCK2 is expressed uniformly throughout the myocardium (arrows in s-v). m,n,x,y: There is no detectable staining for ROCKs in the ventricular endocardium (arrows). k, l, w: In addition to the heart, ROCKs are expressed in delaminating somites and migrating neural crest cells (arrows). Panels n and y are phase contrast images of m and x, respectively. CJ, cardiac jelly; E, endocardium; M, myocardium; NT, neural tube. Scale bar = 100 m in a,c,f,i,o,q,s,u, 50 m in b,d,g,j-n,p,r,t,v-y, 20 m in e,h.

Рис.2. | Western blot detection of Rho-associated coiled-coil kinases (ROCKs) in stage 14-23 hearts. Stage 14 to 23 hearts were solubilized in sample buffer and subjected to immunoblot analysis as described in experimental procedures. a: A single band with a molecular mass of 180 kDa (ROCK2) or 160 kDa (ROCK1) is detected in the staged hearts examined. -Actin is shown as an internal control. b: The relative amount of ROCK1 or ROCK2 protein is large in stage 16-18 hearts, in which EMT is extensive. Note that immunological detection was performed in the same membrane.

ROCK Inhibition Blocks Mesenchymal Invasion in Cultured AV Explants

Рис.3. | Inhibition of Rho-associated coiled-coil kinase (ROCK) perturbs mesenchymal cell invasion in atrioventricular (AV) explant cultures. Stage 14-minus AV explants were cultured on a collagen gel lattice with or without Y27632. After 48 hr incubation, cultures were assessed for endothelial-mesenchymal transformation (EMT). a,b,g: Explants cultured in CM199 show endothelial outgrowth on the collagen gel lattice (E in a) and seed many mesenchymal cells into the gel lattice (arrows in b and g). c,d: When cultures are treated with Y27632, a specific ROCK inhibitor, the number of mesenchymal cells invading the gel lattice is reduced significantly (d, * in g). e,f,h: Furthermore, explants treated with ML-9, a selective myosin light chain kinase inhibitor, seed few mesenchymal cells in comparison with control cultures (f, * in h). i: Western blotting shows that the amount of phospho-myosin light chain (MLC-P) is reduced in cultures treated with Y27632 or ML-9. Note that the expression of GAPDH is shown as a normalization control and that detection was performed in the same membrane. E, endothelial cells; EX, myocardium of AV explant; GAPDH, glyceldehyde-3-phosphate dehydrogenase; MLC, myosin light chain; MLC-P, phospho-myosin light chain; *P < 0.01 (unpaired t-test). Scale bar = 50 m.

ROCK Inhibition Does Not Suppress the Expression of Transformation Markers

Рис.4. | Rho-associated coiled-coil kinase (ROCK) inhibition does not suppress the expression of smooth muscle -actin. Stage 14-minus atrioventricular (AV) explants were cultured with or without Y27632. a,b: After 48 hr, AV endothelial cells cultured in CM199 (control culture) seed numerous mesenchymal cells that express the early endothelial-mesenchymal transformation (EMT) marker smooth muscle -actin (SMA, green fluorescence; arrowheads in b). There is no detectable staining for SMA in epithelial endocardium on the gel surface (a). Note that transforming endothelial cells on the gel surface express SMA (arrowhead in a). c,d: When explants are treated with Y27632, endothelial cells do not seed mesenchymal cells into the gel lattice (d). Some of the endothelial cells treated with Y27632 have a hypertrophied polygonal shape with thin appendages and express SMA (arrows in c). e,f: Western blot analysis shows that AV endothelial/mesenchymal cells express SMA even when treated with Y27632. Relative amounts of SMA in explants treated with Y27632 appear to be increased. Note that the expression of -actin or total actin is shown as a normalization control and that immunological detection was performed in the same membrane. Blue staining (DAPI, 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) indicates nuclei. Scale bar = 20 m in a-d.

Рис.5. | Rho-associated coiled-coil kinase (ROCK) inhibition does not suppress the expression of JB3/fibrillin-2 or M38/type I procollagen. Stage 14-minus atrioventricular (AV) explants were cultured with or without Y27632. After 48 hr, AV endothelial/mesenchymal cells were assessed immunohistochemically for expression of the early endothelial-mesenchymal transformation (EMT) marker JB3/fibrillin-2 or M38/type I procollagen. a,b: In control cultures, explants seed many mesenchymal cells that express both JB3/fibrillin-2 and M38/type I procollagen. c,d: When explants are treated with Y27632, endothelial cells do not seed mesenchymal cells into the gel lattice. However, endothelial cells treated with Y27632 express JB3/fibrillin-2 and M38/type I procollagen (c,d). e: The incidence of JB3/fibrillin-2 or M38/type I procollagen-positive cells shows that the number of cells expressing these markers is identical between control explants and explants treated with Y27632 (NS). NS, no statistical significance (Fisher's exact test). Scale bar = 50 m.

ROCK Inhibition Blocks Mesenchymal Invasion in Cultured Stage 14-18 AV Explants

Рис.6. | Rho-associated coiled-coil kinase (ROCK) inhibition perturbs mesenchymal invasion in cultured stage 14-18 atrioventricular (AV) explants. Stage 14-18 AV explants, in which endothelial cells are already committed to undergo endothelial-mesenchymal transformation (EMT), were cultured with or without Y27632. a,b: Control AV explants from stage 16 hearts seed numerous mesenchymal cells into the gel lattice (arrows in b). c,d: When stage 16 AV explants are treated with Y27632, the number of mesenchymal cells invading the gel lattice is reduced significantly. e: In cultures treated with Y27632, the number of mesenchymal cells invading the gel lattice is reduced significantly in explants obtained from stage 14, 16, or 18 hearts. E, endothelial cells; EX, myocardium of AV explant; *P < 0.01 (unpaired t-test). Scale bar = 50 m.

ROCK Inhibition in Endothelial Cells Blocks Mesenchymal Invasion

Рис.7. | Inhibition of Rho-associated coiled-coil kinase (ROCK) pathway blocks mesenchymal invasion in cultured atrioventricular (AV) endocardium. Stage 14-minus preactivated AV endocardium was cultured in embryonic cardiocyte-conditioned medium (CCM), CCM + Y27632, or CCM + ML-9. a,b,g: After 36-48 hr in culture, endothelial cells cultured in CCM show endothelial outgrowth on the gel surface (a) and seed many mesenchymal cells into the gel lattice (arrows in b,g). c-f: In contrast, endothelial cells cultured in CCM containing Y27632 (c,d) or ML-9 (e,f) fail to seed mesenchymal cells. g,h: The number of mesenchymal cells invading the collagen gel lattice is reduced significantly in cultures treated with CCM + Y27632 or CCM + ML-9 (g,h; *P < 0.01, unpaired t-test). Scale bar = 50 m.

DISCUSSION

ROCKs Are Expressed in Regions Where Epithelial-Mesenchymal Transformation Occurs

Во время образования ткани эндокардиальных подушек, эндокрдиальные клетки в OT и AV областях трансформируются в мезенхимные клетки, которые мигрируют в соседний кардиальный гель, чтобы сформировать valvuloseptal ткань эндокардиальных подушек (Markwald et al., [1975], [1977]). Вначале EMT, ROCK1 и -2 впервые экспрессируются в трансформирующихся эндотелиальных клетках и их экспрессия сохраняется в мигрирующих мезенхимных клетках. Помимо сердца ROCKs экспрессируются или в мигрирующих клетках нервного гребня или в вычленяющихся сомитах. Среди внутриклеточных сигнальных медиаторов, Rho-GTPases и их эффекторы, как было установлено, являются важными для многих аспеквтов эмбриогенеза, таких как вычленение клеток нервного гребня, эпикардиально-мезенхимная трансформация во время образования коронарных сосудов и движения convergent extension во время гаструляции (Liu and Jessell, [1998]; Lu et al., [2001]; Wei et al., [2001]; Kim and Han, [2005]). Во время эмбриогенеза мышей и rho-B и rock1 экспрессируются в тканях эндокардиальных подушек mfr;t как и в развивающемся миокарде (Henderson et al., [2000]; Wei et al., [2001]). Наша предварительная иммуногистохимия показала, что Rho-B экспрессируется в областях, где происходят экстенсивные эпителиально-мезенхимные переходы, такие как ткани эндокардиальных подушек, мигрирующие клетки нервного гребня и вычленяющиеся сомиты во время раннего эмбриогенеза кур (data not shown). Кроме того, премиграторные и вычленяющиеся клетки нервного гребня экспрессируют rho-B и zinc finger транскрипционный фактор slug во время эмбриогенеза кур (Liu and Jessel, [1998]). Эти находки подтверждают, что ROCKs нижестоящий эффектор Rho играет важную роль в регуляции valvuloseptal EMT а также в ЕМТ во время раннего органогенеза.

ROCK Is Required for Mesenchymal Invasion During the Formation of Endocardial Cushion Tissue

Хотя ингибирование ROCK с помощью Y27632 не супрессирует экспрессию ранних маркеров трансформации для мезенхимы подушек, мезенхимная инвазия из AV эндокарда нарушается. Кроме того, Y27632 нарушает приживание со ст. 16-18 AV эксплантов, в которых эндотелиальные клетки уже детерминированы к EMT. Более того, ML-9, ингибитор myosin light chain kinase, ингибирует инвазию мезенхимных клеток способом, сходным с тем, что наблюдается в AV эксплантах, обработанных Y27632. ROCKs, как полагают, вовлечены в разнообразные клеточные активности, включая реорганизацию цитоскелета, миграцию клеток, клеточную адгезию и контракции не мышечных клеток (Kawada et al., [1999]; Katoh et al., [2001]). Во время EMT, некоторые эндотелиальные клетки изменяют свой эпителиальный фенотип на мезенхимный. Эти изменения включают клеточную гипертрофию, потерю межклеточных контактов, поляризацию Гольджи, образование миграторных придатков и инвазию в кардиальный гель (Eisenberg and Markwald, [1995]). В начале этого эмбрионального феномена трансформирующиеся endothelial/mesenchymal клетки экспрессируют SMA, а пертурбации SMA-экспрессии ингибируют мезенхимную инвазию в культивируемых AV эксплантах (Nakajima et al., [1997], [1999]). Экспрессия SMA в начале EMT является важной для процесса трансформации, включая реорганизацию цитоскелета, образование миграторных придатков и клеточную инвазию (Nakajima et al., [1999]). Общепринято, что главной движущей силой клеточной миграции является испускание ведущим краем выпячиваний или lamellipodium, установление новых сайтов адгезии по фронту, контракция клеточного тела и отсоединение слипчивых соединений на заднем крае. Все эти процессы связаны со сборкой, разборкой или реорганизацией актинового цитоскелета (Ridley, [2001]; Raftopoulou and Hall, [2004]). Одной из важных мишеней для ROCK1 является фосфорилирование myosin light chain, участвующее в стимуляции сборки actin-myosin филамент и, следовательно, в контрактильности для генерации движущих сил. Lh/ эксперименты показали, что ROCKs фосфорилируют и активируют LIM-kinase, которая в свою очередь фосфорилирует и инактивирует cofilin, приводя к стабилизации актиновых филамент внутри пучков актомиозиновых филамент (Maekawa et al., [1999]; Sumi et al., [2001]). Эти находки вместе с др. результатами строго указывают на то, что ROCKs необходимы, чтобы генерировать движущие силы для инвазии/миграции мезенхимных клеток, которые происходят в позднем начале EMT.

Перед началом миграции мезенхимных клеток клетки нуждаются в установлении клеточной полярности, т.е. ведущего и заднего края. В наших экспериментах ингибирование ROCK затрагивало формирование клеточной полярности эндотелиальных клеток, которые экспрессировали маркеры ранней трансформации и обнаруживали звездо-образный фенотип с тонкими придатками. Zhao and Rivkees ([2004]) сообщили, что эндотелиальные клетки, культивируемые на покровных стеклах и обработанные Y27632 формируют тонкие отростки вместо хорошо развитых ламеллоподий. Сигнальный путь, который регулирует такую плоскостную полярность, клеточную ось перпендикулярно апикально-базальной оси клетки, пока неясен. Сообщалось, что путь Wnt/Frizzeled регулирует планарную полярность посредством Rho/ROCK, а также пути Jun kinase (названного PCP путем; Habas et al., [2001]). Во время формирования тканей эндокардиальных подушек экспрессия Wnt6 наблюдается в миокарде AV канала (Schubert et al., [2002]), а Wnt9a в AV эндотелиальных клетках (Person et al., [2005]). Более того, мыши, дефицитные по эндокардиальному β-catenin, обнаруживают отсутствие тканией эндокардиальных подушек (Liebner et al., [2004]). Следовательно, это строго подтверждает, что помимо канонического Wnt-пути (Hurlstone et al., [2003]), путь Wnt/Rho/ROCK (PCP путь) может играть важную роль в регуляции в эндокардиальной дифференцировке и инвазии.

Итак, мы показали, что Rho-ROCK путь играет важную роль в регуляции эндокардиального EMT и что ROCK, по-видимому, участвует в инвазии и миграции мезенхимных клеток, произошедших из эндотелиальных клеток, во время late onset of EMT.