Болезнь Гиршпрунга (Hirschsprung disease - HSCR) - врожденная аномалия развития энтеральной нервной системы (enteric nervous system – ENS) и наиболее частая причина врожденной кишечной непроходимости. HSCR характеризуется дистальным кишечным аганглиогенезом и лечение заболевания включает резекцию аганглиозного сегмента кишечника. HSCR поражен каждый из 5000 новорожденных во всем мире и заболевание ассоциируется с другими врожденными аномалиями и синдромами. После резекции больные сталкиваются с такими проблемами как энтероколиты, диарея, запоры или энкопрез (недержанием кала). В редких случаях длина аганглиозного участка кишечника настолько велика, что в результате резекции остается небольшой участок, которые недостаточен для всасывания питательных веществ. Заболеваемость и смертность от этого заболевания остаются высокими даже в развитых странах (1).

Все нейроны и глия ENS происходят из нервного гребня ( neural crest – NC) (Нервный гребень). Подавляющее большинство энтерических ганглиев берет начало из клеток вагусного отдела NC, заселяющих развивающийся кишечник в краниально-каудальном направлении. HSCR возникает в том случае, когда вагусные клетки NC не завершают колонизации дистальной части кишечника. В настоящее время получено несколько экспериментально-биологических моделей этого заболевания. Эксперименты на животных показали, что развитие данной аномалии у млекопитающих ассоциируется с мутациями в 8 разных генах. По меньшей мере, 10 % HSCR у человека вызвано дефектом передачи сигналов через endothelin-B receptor (ETB) (2). ETB –null крысы – естественная модель болезни Гиршпрунга с тотальным поражением кишечника (3, 4) и 90 % этих животных не имеют ганглиев после илеоцекального соединения (область соединения подвздошной и слепой кишок) (3).

Недавно был разработан метод, с помощью которого можно изолировать и культивировать мультипотентные ENS предшественники (5, 6). Bixby et al. (6) разработали метод для проспективной идентификации и изоляции энтерических NC стволовых клеток ( NC stem cells – NCSCs) используя fluorescence-activated cell sorting (FACS) по высокой экспрессии p75, рецептора нейротрофина (neurotrophin receptor) и α4 интегрина (integrin). Эти самообновляющиеся клетки составляют несколько процентов от всех клеток кишечника плода (6) и могут быть идентифицированы в проксимальном кишечнике HSCR крыс постнатально. Кроме того, они способны развиваться по нейральному пути после их инъекции в эмбриональный дистальный кишечник HSCR крыс в органной культуре (7). И хотя установлено, что NCSCs в кишечнике дикого типа ( wild-type – WT) экспрессируют ET B, а мезенхима развивающегося кишечника экспрессирует его лиганд эндотелин-3 (endothelin-3), роль (ETB) в развитии ENS на клеточном уровне остается достаточно противоречивой. Отсутствие ETB сигналов может вести к первичному дефекту миграции клеток, происходящих из нервного гребня (NC-derived cells) (7,9) или к вторичному редуцированию пула предшественников ENS из-за преждевременной дифференцировки или отсутствия пролиферации (10-12).

На заселение NC-derived клеток влияют внутренние факторы – молекулы, экспрессируемые мезенхимой кишечника, и взаимодействия между NC клетками. Природа и необходимость NC межклеточных взаимодействий при кишечной колонизации только сейчас начинают активно привлекать внимание исследователей. Недавно Young et al. (13) показали, что при изолировании небольшой популяции наиболее дистальных NC-derived клеток из популяции, лежащей позади них, они мигрировали медленнее. Эти результаты свидетельствуют в пользу гипотезы о том, что популяция, оказывающая давление после волны миграции может стимулировать дистальную миграцию предшественников ENS (14, 15). Авторы провели серию экспериментов для изучения локализации и динамики популяции NCSC у WT и HSCR крыс.

Результаты исследования

1.Localization of NCSCs correlates with vagal NC colonization of the WT rat intestine. Авторы использовали whole-mount иммунохимичекие реакции на p75 для идентификации NCSCs, предшественников нейронов и зрелых нейронов, а также для оценки волны колонизации у WT и HSCR крыс. Плотность и интенсивность окраски определяли по 6-балльной шкале на зашифрованных препаратах. Whole-mount (полное) окрашивание показало, что цекальная (относящаяся к слепой кишке) колонизация вагальными клетками NC удовлетворительна до стадии Е14.5 у WT и ET-B гетерозиготных крыс и только самый проксимальный участок толстой (colon) кишки содержит NC-derived клетки в этой временной точке ( РИС.1А). Более слабое окрашивание наблюдали в дистальной части тонкого кишечника (small intestine) эмбрионов HSCR в сравнении с WT, и низкий уровень окрашивания наблюдали только в наиболее дистальной части даже на стадии E18.5 (РИС.1В). Окрашивание дистального отдела толстого кишечника у HSCR было затруднено из-за прохождения крупных нервов (РИС.2).

Затем авторы исследовали NCSC колонизацию развивающегося кишечника крыс посредством изоляции p75/α4 high клеток. У эмбрионов WT найдено краниально-каудальное продвижение этих клеток, что хорошо коррелирует с оценкой методом whole-mount окрашивания. На стадии Е13.5 наблюдали резкое увеличение числа p75/α4 high клеток в цекальном сегменте. Число p75/α4 high клеток начинало увеличиваться в дистальном сегменте на стадии E14.5 и достигало пика к E16.5. При этом в проксимальном сегменте число p75/α4 high клеток увеличивалось после E13.5, т.е. шло после волны колонизации p75/α4 high и пик приходился на E15.5 (РИС.3А).

Ретроспективная идентификация NCSCs методом культивирования неселектированных, разобщенных клеток кишечника WT крыс, имела сходный паттерн. Большое число NCSCs имело тенденцию направляться в проксимальный сегмент после E13.5. После этой стадии наблюдали увеличение числа NCSCs в цекальном сегменте. Этим методом не было выявлено резкого увеличения NCSCs в дистальном сегменте до стадии E16.5 ( РИС.3В).

Культура селектированных p75/α4 high клеток показала, что высокая доля (50-80 %) образовавшихся колоний была мультипотентной – т.е. содержала клетки, которые окрашивались маркерами для нейронов, глии и гладкой мускулатуры. Проксимальные p75/α high популяции не только увеличивались в числе со стадии E13.5 до E15.5, но становились все более мультипотентными колониями ( РИС.3С).

2.NCSCs do not colonize the cecum or distal gut of HSCR embryos. Проспективная сортировка с gate set, применяемая для сбора 1% клеток экспрессирующих p75 и α4 в WT проксимальном кишечнике, не обнаружила изменений в числе p75/α4 high клеток в проксимальном кишечнике у крыс на стадиях E13.5 - E17.5 ( РИС.4А). Небольшое число к p75/α4 high клеток идентифицировано в цекальном и дистальном сегментах кишечника на этих стадиях. Однако в культуре неселектированных клеток не определялось значимого числа NCSC (РИС.4В).

Культура p75/α4 high клеток также не давала мультипотентных колоний РИС.4С). Эти клетки были селектированы с использованием restrictive gate (set to collect the top 1% of p75- and α4-expressing cells in the proximal section of the same embryo) для выявления возможности того, что ET-B дефицит нарушает экспрессию p75 или α4.

3.The NCSC pool in the WT but not the HSCR proximal gut increases behind the NC colonization wavefront. . Авторы сравнивали число NCSCs у WT и HSCR эмбрионов в различные временные точки в желудке и тонком кишечнике. Число клеток в желудке и тонком кишечнике, экспрессирующих высокие уровни p75 и α4, оказалось сниженным у HSCR эмбрионов по сравнению с WT после E14.5, наиболее выраженные различия наблюдали на стадиях E14.5 и E15.5 (РИС.5А). Не было выявлено значимых различий между двумя генотипами в долях p75 –позитивных клеток в p75/α4 high gate. Точно также число NCSCs в проксимальном кишечнике WT крыс оказалось более высоким, чем у HSCR крыс после E13.5 при unselected culture (РИС.5В) Культура селектированных клеток не обнаруживала таких различий до E14.5 (РИС.5С). Такие различия в долях полипотентных колоний не имели отношения к снижению способности HSCR p75/α4 high клеток к выживанию и формированию колоний в культуре, т.к. различия наблюдали даже в плашках с высокой способностью к формированию колоний и эффективность колониеобразования не отличалась между двумя генотипами.

4.Culture does not identify altered developmental pathway of cells that express high levels of p75 and 4 in the HSCR intestine.. Предполагается, что HSCR появляется в отсутствии ET B сигнальной системы, т.е. является результатом усиленной и преждевременной нейрональной дифференцировки полипотентных предшественников ENS. Если это так, то можно было бы наблюдать изменения развития in vitro. Кроме того, top 1% p75/α4 high gate у HSCR крыс достигал наиболее низких уровней экспрессии и, следовательно, можно выделять разные популяции клеток. Эти клетки способны формировать только более ограниченные по своей потенции колонии в культуре. Для изучения редукции мультипотентных NC-клеток в проксимальном кишечнике HSCR крыс на стадии E15.5 авторы анализировали состав всех колоний, полученных от top 1% p75/α4 high клеток обеих генотипов в культуре. Несмотря на обнаружение сниженного числа колоний, сформированных всеми тремя клеточными типами (нейроны, глия и миофибробласты), авторы не смогли идентифицировать различий между WT и HSCR крысамив числе колоний, которые формировали только один или два из этих клеточных типов. 84 ± 2% of WT p75/α4 high клеток формировало trilineage колонии, и только 54 ± 2% of HSCR p75/α4 high клеток формировало такие же колонии в культуре.

5.Reduced numbers of NCSCs in the stomach and small intestine of HSCR rats is not associated with a generalized reduction in proliferation of these cells. . Авторы анализировали распределение клеточного цикла в проксимальном сегменте развивающегося кишечника на стадиях E13.5 - E17.5. Поскольку авторов интересовал вопрос о наличии дефекта пролиферации в HSCR NCSCs, они исключили примерно 20 % тонкого кишечника из этого анализа для того чтобы сравнивать области, лежащие вне известного дефекта колонизации с ET-B дефицитом. В желудке и в проксимальной области тонкого кишечника не было найдено никаких различий в доле митотически активных клеток (РИС.6). Прогрессирующее снижение пролиферативной активности этих клеток наблюдали между E13.5 и E17.5 как у WT, так и у HSCR.

Таким образом, способность к проспективной идентификации NCSCs из развивающегося кишечника является мощным инструментом исследования и крайне важно для разработки новых терапевтических подходов лечения ENS. В данной работе авторы выявили сохранение и региональное увеличение пула NCSC после волны колонизации у WT эмбрионов крыс. Сравнение динамики NCSC пула у крыс WT и HSCR обнаружило уменьшение пула стволовых клеток у HSCR крыс в тонком кишечнике после E13.5 – т.е. в тот период когда завершается колонизация тонкого кишечника.

Ранее Ikadai et al. (3) обнаружили, что примерно 59% неонатальных ET B-дефицитных крыс имеют аганглионоз проксимальнее илеоцекального соединения. Сообщалось об аномалиях ENS тонкого кишечника у постнатальных ET B дефицитных крыс и у ET 3-дефицитных мышей (21, 22). Описана задержка эмбрионального развития ENS тонкого кишечника у HSCR крыс (23). Недавно Barlow et al. (24) измерили недифференцированные NC-derived клетки на срезах тонкого кишечника ET 3-дефицитных мышей, используя Phox2B-specific riboprobe. Они обнаружили примерно 43% снижение в числе клеток на срезах HSCR по сравнению с WT на стадии E12.5, но не на стадии E15.5. И это несмотря на тот факт, что волна колонизации уже достигает илеоцекального соединения к E12. 5 у ET 3 дефицитных мышей и что эти мыши имеют нормальное число миэнтерических нейронов в подвздошной кишке (ileum) постнатально (22). В соответствии с находками авторов данной статьи, было сделано заключение, что дефицит сигналов ET B у мышей ведет к временному снижению числа недифференцированных NC-derived клеток и задержке их каудального продвижения (24).

Используя FACS gate который селектирует top 1% of p75//α4-экспрессирующие клетки в проксимальном сегменте WT, авторы обнаружили значительное снижение этой популяции у эмбрионов HSCR крыс в тонком кишечнике после E13.5. При селекции 1% клеток, экспрессирующих p75 и α4, было обнаружено, что селектированные клетки из HSCR желудка и тонкого кишечника были в меньшей степени способны к формированию мультипотентных колоний после Е14.5. Авторы предполагают, что это результат селекции клеток с относительно низкими уровнями экспрессии р75 и α4, - клеток, которые в культуре не были мкльтипотентными. Суммируя полученные данные, авторы делают вывод о том, что снижение числа p75/α4 клеток и редуцированная способность к колониеобразованию в селектированных и неселектированных культурах подтверждают предположение, что HSCR крысы имеют пониженный NCSC пул в тонком кишечнике по сравнению с WT крысами после колонизации этой области кишечника.

NCSC пул в тонком кишечнике WT крыс значительно увеличивается между стадиями E13.5 и E15.5, когда волна колонизации движется через проксимальнуй отдел толстого кишечника (colon). Это может свидетельствовать о взаимодействии между числом недифференцированных NC-derived клеток и их способностью к миграции. В некоторых исследованиях показано, что уменьшение числа клеток вагального гребня in vivo уменьшает расстояние, которое эти клетки преодолевают в развивающемся кишечнике (13-15). Young et al. обнаружили (13), что небольшая популяция наиболее каудальных NC-derived клеток в colon мышей изолирована от популяции, расположенной позади них и клетки мигрируют более медленно. NC-derived клетки, не находящиеся в контакте с другими NC-derived клетками, были неподвижны в мезенхиме кишечника. Эти данные свидетельствуют в пользу гипотезы, что миграция может быть результатом «популяционного давления». Образование большого пула NCSC после волны колонизации у WT крыс может играть роль в успешности колонизации cecum и проксимального толстого кишечника.

У мышей условия для ET B активации ограничены временем, когда NC-derived клетки колонизируют pericecal область (25, 26). Это находится в соответствии с наблюдением выраженных аномалий поведения NC клеток, начинающихся в дистальной части тонкого кишечника ET3-дефицитных мышей (27), и с уровнями ET3 экспрессии, начинающейся в это время в мезенхиме развивающегося cecum (24). На основании наблюдения паттерна колонизации у ET3-дефицитных и WT мышей ENS предшественниками Coventry et al. (27) предположили, что экспансия пула недифференцированных NC клеток может действовать как "driving force" для колонизации проксимального толстого кишечника. Следовательно, дефекты NC колонизации ET3-дефицитного cecum могут быть результатом неспособности к увеличению пула недифференцированных клеток в- или проксимальнее этой области.

Sidebotham et al. (28) и Young et al. (29) сообщали о колонизации всего hindgut в органной культуре, когда сегменты проксимального кишечника, содержащие NC клетки были соединены с postcecal кишечником, у которого отсутствовали NC клетки. Это противоречит гипотезе о важной роли экспансии NCSC популяции в pericecal области в завершении колонизации hindgut, за исключением того, что колонизация hindgut в органной ко-культуре значительно отличается от колонизации in vivo. Sidebotham et al. (28) сообщали, что проксимальные NC клетки кишечника «имели равные способности к миграции и к дифференцировке в терминальной части прямой кишки». Однако ими было отмечено, что паттерн колонизации толстого кишечника в экспериментах с прикладыванием кусочков кишечника отличался от паттерна в целом кишечнике in vivo и in vitro – число клеток было намного меньше, NC клетки ограничивались половиной толстого кишечника, находящейся рядом с местом аппликации, а NC-derived клетки преимущественно мигрировали неглубоко около поверхности терминальной прямой кишки и с небольшим числом клеток проникающих в мезенхиму (28). Young et al. (29) также обнаружили различия между in vivo колонизацией hindgut NC клетками и колонизацией в экспериментах по кокультивированию. Они отмечали разные паттерны экспрессии маркеров ENS предшественников in vitro по сравнению с in vivo. Т.о., NC клетки, которые не завершают колонизацию кишечника in vitro могут колонизировать hindgut в кокультуре, поскольку у них меньшие расстояния для миграции и более короткий участок кишечника для колонизации по сравнению с тем же процессом in vivo (29).

Снижение NCSCs у HSCR крыс по сравнению с WT крысами может быть обусловлено ограничением их developmental potential/premature differentiation, нарушениями пролиферации, или повышенным апоптозом. Сходный процент p75-позитивных клеток селектированных как p75/α4 подтверждает, что снижение числа NCSCs у HSCR крыс ассоциируется со снижением числа р75-позитивных клеток. Это может быть результатом утраты р75 экспрессии или отсутствия пролиферации NC клеток. Предварительные исследования показали неизмененное развитие NCSCs с E14.5 всего кишечника HSCR крыс по сравнению с WT в культуре (7). Авторы получили сходные результаты анализируя проксимальный кишечник на стадии Е15.5. In vitro условия дифференцировки несомненно резко отличаются от условий in vivo и вследствие этого могут не отражать события, происходящие в кишечнике HSCR крыс.

Авторы наблюдали слабую тенденцию HSCR p75/α4 клеток к снижению колониеобразования в течение двух недель культивирования. Это косвенно подтверждает наличие дефекта пролиферации. Barlow et al. (24) изучали пролиферативную активность в недифференцированных предшественниках ENS (использовали в качестве маркера SOX 10 экспрессию, краткосрочные культуры) в изолированном тонком кишечнике ЕТ 3-null мышей на стадиях E11.5–E12, что примерно соответствует стадиям E13.5–E14 у крыс. Было найдено значительное снижение числа пролиферирующих предшественников ENS. Однако Woodward et al (9), исследуя пролиферацию in situ NC-derived клеток меченых бромдезоксиуридином, не обнаружил различий между WT и ET3-дефицитными мышами на стадии E11.5. Если результаты Barlow могли быть артефактом клеточной культуры, то Woodward мог не идентифицировать небольшую долю клеток эмбрионального кишечника, которая представляла недифференцированные предшественники ENS. Используя проточную цитометрию авторы не выявили различий в митотической активности клеток p75/α4 in vivo в желудке и проксимальной части (80%) тонкого кишечника. Данные авторов подтверждают работы, в которых было обнаружено снижение NCSCs в желудке и тонком кишечнике HCSR крыс, не связанное с изменениями в пролиферативной активности этих клеток.

Авторы не изучали уровни апоптоза NCSCs у HSCR крыс в сравнении с WT. Однако в других работах не было найдено увеличения апоптоза, связанного с аганглиогенезом и являющегося результатом дефицита сигналов ЕТ В (9). Однако исследования апоптоза после волны колонизации не проводились.

Kruger et al. (7) и авторы данного исследования использовали проспективную идентификацию клеток p75/α4 для сравнения числа NCSCs во всем кишечнике и нашли 60% снижение числа этих клеток у HSCR крыс по сравнению с WT на стадиях E12.5 и E14.5. Предположили, что до Е12.5 ETB оказывает эффект на NCSC выживаемость или самообновление, который сохраняется, но не ухудшается со временем. В изолированном тонком кишечнике на стадии Е13.5 авторы также идентифицировали снижение (около 43%) в числе p75/α4 клеток (проспективная идентификация). Однако культивирование с ретроспективной идентификацией NCSCs показало, что имеется равное число NCSCs в двух генотипах в этой временной точке. Кроме того, в настоящей работе проспективно была идентифицирована популяция клеток в HSCR cecum и дистальном толстом кишечнике, которая оказалась неспособной формировать мультипотентные колонии в культуре. Не все клетки, селектированные по высокой экспрессии p75/α4, являются NCSCs. На РИС.5 показано, что 20-50% NC-derived колоний сформированных из этих клеток не мультипотентеы. Другим возможным объяснением различий между проспективной и ретроспективной идентификацией NCSCs у крыс HSCR может быть то, что авторы рассекали hindgut, включающий клетки sacral crest, которые заселяют тазовый ганглий (pelvic ganglia) в мезенхиме, окружающей hindgut и не обнаруживаются в кишечнике до прибытия клеток вагального гребня (vagal crest) (по крайней мере у мышей) (30). Поскольку авторы нашли, что эти клетки неспособны к формированию мультипотентных колоний, было высказано предположение, что отсортированные клетки или не мультипотентны или NCSCs, которые изолированы из этой области, по разному реагируют на условия культивирования. Bixby et al. (6) нашли, что NCSCs, изолированные из кишечника этих крыс на стадии Е14.5 (в основном происходящие из вагального гребня), в большей степени реагировали на нейрогенные факторы, чем NCSCs, изолированные из седалищного нерва (sciatic nerve). Следовательно, к интерпретации полученных данных нужно относиться с большой осторожностью.

Способность определять фенотипически и изолировать проспективно популяцию энтерических NCSCs у постнатальных и взрослых млекопитающих (5, 20) подтверждает возможность альтернативного терапевтического подхода для лечения заболеваний ENS. Уже были успешно проведены инъекции недифференцированных NC клеток в стенку кишечника плода, после которых наблюдали нейрональное развитие в органной культуре (7, 31). Конечно, нейрональное и глиальное развитие несостоятельно в отсутствие функциональных связей. Такие связи образуются достаточно рано – когда недифференцированные NC-derived клетки мигрируют в цепочки вдоль скаффолдов, образуемых отростками ведущих клеток (13). Терапевтическое создание хорошо функционирующей ENS может потребовать индукции эмбрионального паттерна «поведения» в трансплантированных или персистирующих NCSC популяциях. Понимание регион-специфических паттернов «поведения» энтеральных NCSC во время нормальной колонизации – основная цель разработки этого нового терапевтического подхода.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Animals. Protocols were conducted in accordance with National Institutes of Health guidelines and approved and monitored by the University of Michigan University Committee on the Use and Care of Animals. The ETB-null mutation, ETBsl is maintained on an inbred Wistar-Kyoto genetic background. The ETBsl mutation is autosomal recessive. ETBsl/sl rats develop intestinal obstruction in the neonatal period, do not live beyond 36 d, and are referred to as HSCR rats throughout this report. ETB heterozygous rats are indistinguishable from WT rats visually, in lifespan, and in fertility. ETB genotype was determined by PCR analysis of a tail biopsy specimen or, in the case of embryos, from unused portions of the embryo as previously described (16). Embryos were obtained by timed heterozygous mating and killing of the pregnant female rat. Embryos were immediately dissected, with collection of the entire intestine from the esophagogastric junction to the rectum.

Whole-mount immunohistochemistry. Whole embryonic intestines were fixed in 4% formaldehyde for 3 h at room temperature or overnight at 4°C. After washing with PBS, guts were treated with collagenase (1 mg/mL) for 30 min. The intestines then were incubated for 1 h with 0.5% BSA, 1% DMSO, 0.2% triton-X100, and 5% goat serum in PBS. Rabbit anti-mouse p75 (Chemicon AB1554, Temecula, CA) was added directly to the blocking buffer and incubated at 4°C overnight. After washing with blocking buffer (without goat serum), the intestines were incubated with the secondary antibody, goat anti-rabbit IgG conjugated with HRP (PI-1000; Vector Lab Inc., Burlingame, CA) for 2 h at room temperature. They then were washed with acetate-imidazole buffer (17.5% 1 M sodium acetate and 5% 0.2 M imidazole) followed by Ni-DAB buffer (12.4% 1 M sodium acetate, 5% 0.2 M imidazole, 10% 1 M nickel sulfate, 3% 10 mg/mL diaminobenzidine, and 0.3% of 1% H2O2).

The stained intestines were examined and measured under a dissecting microscope. They were marked into three small intestinal segments of equal length, two cecal segments of equal length, and four large intestinal segments of equal length. The last division of the large bowel is also referred to as rectum. Each section then was individually examined and scored (0–5) for the density of staining in a genotype-blinded manner.

Flow cytometry and cell sorting. Freshly isolated whole intestines were dissected into cold Ca2+- and Mg2+-free HBSS and divided at the ileocecal junction and just distal to the cecum, forming three segments that are designated in the figures as proximal, cecal, and distal. Intestinal segments were dissociated by incubating for 2 min at 37°C in 0.5 mg/mL deoxyribonuclease I (Sigma Chemical Co.) in Ca2+- and Mg2+-free HBSS. Cells were stained with antibodies against p75 (192I clone) and 4 (Becton-Dickinson, San Jose, CA; Mr 4-1 clone, directly conjugated to phycoerythrin). After washing, cells were resuspended in staining medium that contained 2 µg/mL 7-aminoactinomycin D (7-AAD; Molecular Probes, Eugene, OR). Cell sorting and analysis were performed on a FACSVANTAGE dual-laser flow-cytometer (Becton-Dickinson). Dead cells were eliminated from sorts and analysis as 7-AAD+.

Sorts were performed using two methods for setting the gates. To compare the number of cells with defined levels of expression of p75 and 4 between the two genotypes, we set the gates to collect the top 1% of cells that expressed these markers in the proximal WT gut sections of the same age, stained and sorted on the same day, and all suspended cells were counted. These results are presented in РИС.3А, 4А, 5А. To address the possibility that ETB deficiency results in a lower level of expression of p75 or 4 without truly affecting the number of multipotent NCSCs, we performed other sorts with the gate set to collect the top 1% of cells that expressed p75 and 4 in the proximal section of that embryo, whether WT or HSCR. This gate resulted in the selection of more cells in HSCR embryos compared with the previously described gate.

Culture of NCSCs. Cells were cultured as previously described (6). Plates were sequentially coated with 150 µg/mL poly-d-lysine (Biomedical Technologies, Stoughton, MA) and 0.15 mg/mL human fibronectin (Biomedical Technologies) as described (17). Culture plates were kept in sealed plastic bags that contained 6% CO2 before and after sorting to maintain a physiologic pH of the culture medium. Cells were cultured on six-well plates at low density (<30 clones per well). The culture medium was DMEM-low (GIBCO 11885-084) with 15% chick embryo extract, 20 ng/mL recombinant human basic fibroblast growth factor (R&D Systems, Minneapolis, MN), 1% N2 supplement (GIBCO), 2% B27 supplement (GIBCO), 50 µM 2-mercaptoethanol, 110 nM retinoic acid (Sigma Chemical Co.), penicillin/streptomycin (Cambrex BioScience Rockland, Rockland, ME), and 20 ng/mL IGF-1 (R&D Systems). After 6 d, cells were switched to "differentiation" medium, which contains 1% chick embryo extract, 10 ng/mL basic fibroblast growth factor, and no IGF-1. All cultures were maintained in gas-tight chambers (Billups-Rothenberg, Del-Mar, CA) that contained decreased oxygen levels, as previously described (18).

Immunohistochemistry of cultured cells. Cultures were fixed in acid ethanol (5% glacial acetic acid, 95% ethanol) for 20 min at –20°C, washed, blocked, and triply labeled for Peripherin (Chemicon AB1530) to identify neurons, glial fibrillary acid protein (Sigma Chemical Co. G-3893) to identify glia, and -smooth muscle actin (Sigma Chemical Co. A-2547) to identify myofibroblasts.

Cell-cycle analysis. To examine whether the decreased number of NCSCs in the HSCR stomach and small intestine results from decreased proliferation of these cells in vivo, we performed cell-cycle analysis as previously described (19б 20). For this experiment, we examined the top 1% of cells that expressed p75 and 4 in the stomach and proximal four fifths of the small intestine. Dissociated gut cells were suspended in medium that contained 5 μg/mL Hoechst 33342 (Sigma Chemical Co.). Cells were incubated in this solution for 45 min at 37°C with agitation every 5–10 min. Cells were kept on ice at all times while stained for flow cytometry analysis.

Statistics. All results are presented as the mean ± SEM, and p < 0.05 is considered significant. Data were analyzed using GraphPad Prism version 3.00 for Windows (GraphPad Software, San Diego, CA). Comparisons between two groups were made using the nonparametric Mann-Whitney test. Three or more groups were compared using ANOVA.

ЛИТЕРАТУРА

1. Imseis E, Gariepy CE 2004 Hirschsprung Disease. In: Walker WA (ed) Pediatric Gastrointestinal Disease: Pathophysiology, Diagnosis, and Management. BC Decker Inc., Hamilton, pp 1032–1043