Секвенирование целых геномов внесло существенные изменения в биологию, продвинул нас с изучения отдельных генов и белков в направлении исследований путей и систем. Подобные геномные подходы сегодня необходимы для понимания механизмов, которые регулируют экспрессию генов. Индивидуальный ген и его регуляторные элементы не д. больше рассматриваться в изоляции, а в контексте из эффекта на соседние гены и vice versa. Расположение генов в геномах эукариот не случайно, описана ко-экспрессия кластеров генов для некоторых организмов, включая дрожжи, Drosophila melanogaster и Caenorhabditis elegans¹. Т.к. размеры генов и геномов отличаются у разных организмов, а эти параметры влияют на формирование кластеров генов, поэтому мы предприняли попытку анализа генов и генных кластеров у млекопитающих.

Были проведены обширные исследования того, как структура хроматина может контролировать экспрессию индивидуальных генов. Однако, структура хроматина д. играть роль и в одновременной регуляции множественных генов. Мы рассмотрим, как дальнодействующие регуляторные элементы, гистоновые модификации и структуры хроматина высшего порядка, каждый может координировать экспрессию генов в кластерах. Недавно разработанные широко-масштабные и в масштабах всего генома подходы для детального изучения этих признаков хроматина, делают их особенно уместными для изучения влияния структуры хроматина в геномных областях.

Уже давно установлено, что некоторые гены, которые являются родственными своими первичными последовательностями и/или функцией, могут находиться по соседству др. с др. в геноме млекопитающих. Однако, только секвенирование генома и описание генных функций сделало понятным эволюционное происхождение и биологические функции кластеров генов.

Temporally regulated clusters of structurally related genes. The β-globin и homeobox (Hox) локусы являются моделями для скординированной регуляции кластеров генов, которые занимают 50-250 kb. Оба кластера возникли в результате тандемных удвоений исходных генов. Отбор, по-видимому, затем удержал гены паралоги вместе, это указывает на то, что имеется функциональная связь между образованием кластеров этих генов в геноме и механизмами. которые регулируют их экспрессию.

Образование кластеров globin генов на одной хромосоме не существенно для гарантии их экспрессии в соотв. типах клеток. У млекопитающих α-globin и β-globin гены располагаются на разных хромосомах, но оба д. ко-экспрессироваться на необходимых уровнях в одних и тех же эритроидных клетках, чтобы гарантировать правильную продукцию гемоглобина. Считается, что локус родоначального глобина был α-β локусом и сто последующие геномные дупликации сделали возможной их раздельную эволюцию в α- и β-кластерах. Существуют реликты таких α-β кластеров у сумчатых² и рыб³. Однако, с α- и β-кластерами, которые в целом остались неизменными, обнаруживается COLLINEARITY в последовательности генов и во временной последовательности активации генов: эмбриональные, плодные (в случае β-globin) и взрослые. Интересно, что организация у кур локуса β-globin иная. Первые гены (ρ, β^H, β^A) после вышестоящего DNaseI hypersensitive sites (DHSs) экспрессируются последовательно в и развитии (в раннем эмбриогенезе, при вылуплении и у взрослых), тогда как последний ген кластера (&epsilon:) экспрессируется только у ранних эмбрионов. Эта разная регуляция может быть результатом нового регуляторного энхансера , которые помещается между β^A и ε генами⁴.

Сходным образом, кажется, что образование кластеров Hox-генов является еще боле важным для временной регуляции экспрессии во время развития, чем для пространственного паттерна экспрессии вдоль передне-задней оси эмбриона. Hox трансгены, которые вставляются в эктопические места генома часто обнаруживают корректный пространственный паттерн экспрессии, но теряют свою временную регуляцию⁵. Эти наблюдения подтверждены также анализом образования кластеров Hox-генов у двух UROCHORDATES. Hox частично диспергирован в геноме Ciona intestinalis; хотя передне-задняя экспрессия Hox генов пространственно контролируется вдоль личиночной нервной трубки, а временная координация, по-видимому, потеряна⁶. Toq более поразительно у Oikopleura dioica Hox гены полностью диспергированы по геному. В то время как временная последовательность их активации утеряна ^7,8, передне-задний паттерн Hox экспрессии сохранён.

И для Hox и для globin локусов все гены транскрибируются с одной и той же нити. Хотя функциональное значение этого неясно, но это может подчеркивать роль нить-специфической межгенной транскрипции во временной регуляции этих кластеров^9,10.

Superclusters of different co-regulated gene families. Существуют также крупные суперкластеры генов млекопитающих, которые занимают более нескольких megabases. Примерами могут служить major histocompatibility complex (MHC) (Box 1) и epidermal differentiation complex (EDC) (Box 2). Хотя гены в этих кластерах не обязательно все структурно сходны др. с др., но они скоординировано регулируются. Помимо транскрипционной ко-регуляции, др. селективное давление на формирование кластера MHC заключается в поддержании гаплотипов приLINKAGE DISEQUILIBRIUM¹¹. Однако, довольно трудно понять, как это может быть фактором поддержания EDC, т.к. он не обладает иммунными функциями.

MHC, как полагают, возникает из родоначальной области, которая появляется у хордовых¹², но расщепление на class I и II MHC генов в геноме TELEOSTS говорит против абсолютной потребности в их сцеплении в cis¹³. С др. стороны, выявлен огромный (extended) MHC млекопитающих; его протяженность выходит за пределы классических MHC и включает кластеры olfactory receptor (OR), tRNA и histone-кодирующие гены, функции которых не обнаруживают очевидной связи с функциями иммунной системы¹⁴ (Рис. 1). Возможно эта область генома особенно склонна к удвоениям генов, что создает условия для размножения, при которых могут возникать кластеры генов, или имеются некие селективные преимущества для поддержания этой увеличенной хромосомной области из кластеров генов. Одинаково с классическим MHC, tRNA и и гены, кодирующие гистоны, представляют собой области высокой транскрипционной активности. Имеется также пространственная близость обоих MHC и гистоновых кластеров к PML NUCLEAR BODIES, но функциональное значение этого остаётся неясным, т.к. разрушение PML bodies (с помощью нокдауна PML белка) не вызывает существенных последствий на транскрипцию MHC генов¹⁵. Напротив, OR гены являются транскрипционно молчащими в большинстве типов клеток и, даже в обонятельных клетках, только один аллель одного гена из всего семейства OR генов экспрессируется в определенной клетке¹⁶. Следовательно, довольно трудно постулировать, как может осуществляться общая транскрипционная связь между OR генами и MHC. Интересно, что локус β-globin также вставлен в кластер OR генов, a class II MHC и OR гены взаимно перемешаны у мышей¹⁷.

MHC был удвоен несколько раз во время эволюции, давая паралогичные области на др. хромосомах человека¹⁴, включая 1q21-1q25 - местоположение EDC¹⁸. Как и при увеличенном (extended) MHC, эта область также содержит кластеры гистонов, OR и tRNA-кодирующие гены (Рис. 1). Однако, EDC сам по себе является, по-видимому, недавним приобретением у млекопитающих. Хотя фланкирующие области законсервированы у кур, лягушек и рыб, не выявлено обнаружимого эквивалента EDC в недавно описанных геномах этих видов. Однако, балки, которые сходны с LORICRIN и FILAGGRIN, присутствуют в эпидермисе птиц¹⁹. Т.к. гены EDC не связаны ни структурно, ни функционально с этим классическим MHC, то EDC д. был возникнуть независимо благодаря новому раунду дупликаций генов внутри хромосомной области, которая удаленно родственна увеличенному (extended) MHC.

Даже паралогичные, ко-экспрессируемые гены внутри MHC и EDC не обязательно транскрибируются с одной и той же нити и, кстати, нет доказательства временной последовательности активации MHC генов во время развития. Имеется. однако, некоторая временная регуляция между семействами генов EDC. S100A гены, которые кодируют calcium-связывающие регуляторные белки, экспрессируются первыми - в базальном клеточном слое эпидермиса. В SUPRABASAL LAYERS кожи имеется прогрессивная экспрессия генов, которые кодируют структурные компоненты CORNIFIED ENVELOPE; включая loricrin, INVOLUCRIN, small proline-rich (SPRR) белки, т.наз. 'слитые' белки и, наконец, поздние оболочечные белки.

General clustering of unrelated genes. Хотя большинство генов млекопитающих не организовано в кластеры и суперкластеры из родственных генов, которые описаны выше, они все же распределяются не случайно вдоль хромосом. Ещё до секвенирования генома человека было ясно, что большинство генов 'домашнего хозяйства' организованы в кластеры в специфических доменах хромосом человека²¹. Этот вопрос теперь решается с помощью биоинформационного анализа геномных последовательностей и с помощью изучения паттернов генной экспрессии¹. Ранее предполагалось, что имеются кластеры генов, экспрессирующиеся в специфических тканях, или кластеры генов с высокими скоростями транскрипции^22,23. Однако, сегодня ясно, что общим признаком генов, которые собраны в кластер в большинстве регионов, богатых генами, является их экспрессия в широком спектре тканей и типов клеток^1,24. Из-за их превалирования в базах данных по экспрессии, широко экспрессирующиеся гены обнаруживают также тенденцию относиться к категории высоко экспрессируемых.

Могут ли эт эффекты просто совпадать? Гены могут быть включены благодаря своей близости к активным генам. Такой эффект соседства ('bystander effect') продемонстрирован для CD79B гена, который локализован между кластером гормонов роста и его locus control region (LCR) на хромосоме 17 человека (Ref. 25). Ген CD79B экспрессируется в гипофизе, хотя его функция ограничена В клетками. Если это общее свойство кластерных генов, то не д. быть причин a priori, почему кластерные гены консервируются. Однако, изучение разрывов SYNTENY между мышами и людьми показало, что кластеры, богатые широко экспрессирующимися генами, назодятся под действием функционального отбора²⁶.

Следовательно, может сделать вывод, что некоторые дально-действующие признаки структуры хроматина или хромосом зависят от экспрессии кластерных генов. Что же может быть механической основой такой регуляции?

Sharing regulatory elements. Одной из причин удерживания вместе генов, образовавших кластер в хромосоме, может быть то, что имеют общий регуляторный элемент. Эффективная транскрипция β-globin нуждается в LCR, расположенном ~10 kb выше первого гена в кластере - эмбрионального ε-globin, и в DHSs, котрые расположены в LCR, и больше к 5' и 3' концу локуса, которые являются физически близкими др. к др. в ядре²⁷ и могут быть взаимосвязаны др. с др.²⁸. Это, как полагают формирует основу петлеобразного домена, на который глобиновые гены затем последовательно рекрутируются, когда они экспрессируются. Такая архитектура хроматина является эритроид-специфичной и зависит от эритроидных транскрипционных факторов^29,30. Очень важно, что это устанавливается во время развития еще до транскрипции генов β-globin. У мышей в предшественниках эритроцитов, которые детерминированы, но ещё не инициированы, экспрессия глобина находится в пространственной ассоциации с некоторыми из DHSs и частью LCR, но не с самими глобиновыми генами. Гены затем последовательно помещаются на средину петли (loop hub) как только начинаю экспрессироваться - эмбриональные гены в первичных эмбриональных эритроцитах, и взрослые β-globin гены в дефинитивных эритроидных клетках, начиная с печени плода³¹.

Оперирует ли сходный механизм в Hox локусах? Имеются локальные контролирующие элементы и энхансеры внутри кластера Hox, функция которых распространяется на небольшое количество соседних генов, но только в случае гомеобоксного D кластера, Hoxd, имеются также доказательства существования глобальных регуляторных элементов, которые располагаются вне кластеров. Global control region (GCR), которая располагается на 5' конце кластера Hoxd регулирует экспрессию 5' Hoxd генов в дистальных частях почки конечности³², но способ его действия всё ещё неизвестен. В отличие от β-globin LCR и DHSs, он кроме того регулирует гены (even-skipped homeobox homologue 2, Evx2, и lunapark, limb and neural patterns, Lnp), которые не являются родственными генам Hox. Предполагается, что эта область, GCR, является недавним эволюционным обновлением, которое ко-оптировано локусом Hoxd в то же самое время, как появились конечности³². Следовательно, нет a priori причины ожидать, что сходный элемент необходим для колинеарной экспрессии Hox вдоль основной передене-задней оси эмбриона или для ранней временной collinearity экспрессии. Недавно было предположено, что существует early limb control region (ELCR) на 3' конце кластера Hoxd и что она контролирует передне-заднюю колинеарную экспрессию³³.

Дальнодействующие регуляторные элементы, которые оказывают свое влияние на суперкластеры или даже кластеры из семейств генов внутри суперкластеров, не были обнаружены. DHSs, которые занимают до 9 kb выше MHC, class II, DRα (HLA-DRA) промотора были классифицированы как LCR³⁴. Однако нет доказательств, что эти элементы оказывают какие-либо эффекты на др. class II генов. Гены класса II обладают общими регуляторными мотивами, которые располагаются вблизи к каждому из индивидуальных генных промоторов. Эти S-Y элементы являются связывающими сайтами для regulatory factor X complex (RFX) и для MHC class II transactivator (CIITA, известного также как MHC2TA)³⁵. CIITA является мастером регулятором экспрессии class II. Индукция его экспрессии с помощью interferon-γ (IFNG) предшествует экспрессии генов MHC class II. Однако, S-Y регуляторные элементы сами по себе не могут объяснить образование кластеров генов class II в MHC, т.к. ассоциированный с MHC class-II инвариантный цепочный ген Ii (CD74) также регулируется с помощью того же самого элемента и транскрипционных факторов, хотя он локализован на др. хромосоме³⁵.

Histone modifications. Роль структуры хроматина в модуляции экспрессии генов активно изучалась на уровне гистонов и их пост-трансляционных модификаций. Среди этих модификаций ацетилирование гистонов считается указанием на транскрипционную активность. Существует гиперацетилирование гистонов на β-globin LCR, но уровни ацетилирования гистонов на самих глобиновых генах зависят от стадии развития. В эмбриональном YOLK SAC, ацетилированные гистоны обнаруживаются на промоторах как активных эмбриональных генов, так и промоторах неактивных взрослых генов. Позднее, в печени плода, эта модификация сохраняется на промоторах взрослых генов, но теряется с теперь неактивных эмбриональных генов³⁶. Это довольно сходно с ситуацией с кластером Hoxb. Индукция временной программы экспрессии Hoxb во время дифференцировки эмбриональных стволовых клеток сопровождается ацетилированием гистонов на ранних (3') и поздних (5') генах одновременно. Это ацетилирование затем теряется с самого раннего гена, homeobox B1 (Hoxb1), как только затухает его транскрипция, но сохраняется на homeobox B9 (Hoxb9), который экспрессируется позднее во время дифференцировки³⁷. Для локусов β-globin и Hoxb ацетилирование гистонов может быть, следовательно, приравнено к потенциации транскрипции всего локуса. Последующее ген-специфичное деацетилирование может быть затем важным для последовательного замалчивания экспрессии. Несмотря на это искусственная индукция ацетилирования гистонов с помощью ингибиторов histone deacetylase (HDAC) не существенна чтобы или активировать транскрипцию или открыть хроматиновую структуру^36,37. Метилирование гистона H3 по лизину 4 (H3-K4) также ассоциирует с активацией генной экспрессии и с последующей потерей этой метки на Hoxb локусе в основном параллельно с ацетилированием гистонов³⁷.

Т.к. иммунопреципитация хроматина в небольших количествах клеток технически трудна, поэтому существует только ограниченный анализ гистоновых модификаций на Hox локусах вдоль передне-задней эмбриональной оси. Ацетилирование гистонов энхансера, но не промотора homeobox D4 (Hoxd4) предшествует активации транскрипции во время эмбриогенеза. Ацетилирование гистонов затем наблюдается на самом гене в областях спинного мозга, которые находятся позади границы экспрессии³⁸. Изучение гистоновых модификаций по всему геному выявило необычно широкий домен H3-K4 метилирования над 3' Hox генами в фибробластах, который происходили из передних областей животных³⁹.

CIITA ассоциирует с histone acetyltransferases (HATs) и обладает прирожденной HAT активностью^40,41. Домен ацетилирования гистонов, который индуцируется с помощью CIITA, соединяющегося с областью MHC class II, широк (свыше ~16 kb) (Ref. 42), но нет доказательств модификаций гистонов по всему этому локусу, что сходно с наблюдениями над Hox локусами³⁹.

Было предположено, что 'bystander activation' гена CD79B является следствием распространения ацетилирования гистонов и метилирования H3-K4 с LCR ростовых гормонов на гипофиз-специфический GH-N гормон роста (известный также как GH1) включая тем самым и CD79B (Ref. 25). Не обнаруживается активации CD79B в плаценте, где гистоновые модификации ограничены собственно генами гормонов роста плаценты и не распространяется на промежуточную область^25,43. Возникает возможность, что распространение гистоновых модификаций может быть ответственно за генерализованную активацию генов в кластерах широко экспрессируемых генов. Однако, широкие домены ацетилирования гистонов, по-видимому, являются скорее исключением, чем правилом для геномов млекопитающих. Картирование целых хромосом в отношении ацетилирования гистонов и метилирования H3-K4 показало, что за исключением необычных областей, таких как Hox кластеры, эти маркеры 'активного хроматина' в целом ограничены промоторами и регуляторными элементами генов млекопитающих, а не распределены в виде широких доменов^39,44.

Large-scale alterations in higher-order chromatin structure. Отсутствие доказательств существования всеохватывающих LCR-подобных элементов, которые координируют регуляцию Hox локусов, помимо Hoxd, и неспособность с помощью паттерна гистоновых модификаций объяснить временную регуляцию экспрессии Hox, не указыват ли на существование др. механизмов контроля collinearity? Одним из механизмов, который был предложен. по крайней мере, для инициальной последовательной активации Нох локусов, является прегрессирующее 'открывание' хроматиновой структуры, которое распространяется от 3' к 5' концу или прогрессивно избегает репрессивных условий хроматина⁵. Доказательства, которые согласуются с этим, были получены на локусе Hoxb с помощью FLUORESCENCE IN SITU HYBRIDIZATION (FISH). После индукции транскрипции локус Hoxb деконденсируется и Hoxb гены выходят за границы своих хромосомных территорий во временной последовательности, которая синхронна с их экспрессией^37,45.

Выход (Looping out) из хромосомной территории обнаруживается также в β-globin локусе в эритроидных клетках, но нет доказательств, что это координирует с последовательной активацией эмбриональных и взрослых генов во время развития. Эти изменения крупно-масштабной структуры хроматина указывают на соответствие уравновешанному состоянию скорее, чем транскрипционной активации per se⁴⁶. LCR участвует в этих изменениях архитектуры хромосомной территории, но как это соотносится с DHS-обусловленным β-globin looped доменом, рассмотренным ранее, остается неизученным.

Изучение ядерной организации MHC человека впервые вывело на свет образование петель специфических геномных областей вне хромосомных территорий. В B-LYMPHOBLASTOID CELLS классический MHC кластер обнаруживает высокую частоту образования петель из хромосомных территорий, наиболее выраженных в областях классов II и III⁴⁷. Этот феномен не обнаруживается в extended MHC (Рис. 1). Частота extra-territory петель низка в non-ANTIGEN-PRESENTING CELLS (напр., фибробластах), но может быть легко индуцирован с помощью IFNG, который индуцирует CIITA и экспрессию class II. EDC также выходит за пределы хромосомной территории в экспрессирующих клетках. таких как кератиноциты, но не в не-экспрессирующих лимфобластах²⁰ (Рис. 1).

Выпячивание MHC в петли вне своей хромосомной территории подтверждено наличием цитологического проявления в виде широкой деконденсации хроматина⁴⁷. Сходным образом, во время индукции экспрессии Hoxb, ядерная реорганизация генов Hoxb наружу от хромосомной территории также сопровождается цитологически обнаружимыми уровнями деконденсации хроматина^37,45. Мы игнорируем пока механизм, как хроматин укладывается в сложные уровни организации хроматина помимо нуклеосом, но биофизическая компактизация 30-nm хроматиновых волокон, очищенных из B-lymphoblastoid клеток, измерена по всему геному человека с помощью SUCROSE GRADIENT SEDIMENTATION⁴⁸. Данные этого анализа для MHC и EDC согласуются со степенью extra-territory образования петель: MHC выглядит более 'открытой' структурой хроматиновых волокон в лимфобластах, тогда как хроматиновая структура EDC является 'компактной' (Рис. 1).

Эти открытые хроматиновые волокна не случайно разбросаны в остальной чати генома человека; они образуют кластеры. Более того, эти домены со структурой открытого хроматина соответствуют кластерам с плотным расположением широко экспрессируемых генов^48,49. FISH анализ также показывает, что эти домены содержат деконденсированные структуры высшего порядка, которые часто образуют петли вне соотв. хромосомных территорий⁴⁸. Следовательно, существуют структуры хроматина высшего порядка этих кластеров генов, которые выглядят довольно сходно с активированными состояниями Hoxb и MHC суперкластера.

Анализ экспрессии показал, что внутри доменов с открытой структурой хроматинового волокна индивидуальные гены могут быть неактивными и активными (Рис. 2). Следовательно, отсутствует 'bystander effect' открытой структуры хроматинового волокна на экспрессию генов. Вместо этого, как мы полагаем, домены конституитивно открытого хроматинового создают условия, которые permissive или уравновешены для генной экспрессии. Действительная экспрессия индивидуальных генов внутри этих областей затем определяется с помощью присутствия или отсутствия специфических транскрипционных факторов. Напр., экспрессия α-globin остается в основном эритроид-специфичной, хотя он находится в открытом богатом генами кластере⁴⁸, который дает петли вне своей хромосомной территории в разных тканях⁵⁰.

Хотя не все гены в доменах с открытой структурой д. экспрессироваться в любом типе клеток, мы полагаем, что д. быть критический порог для пропорции активных генов в области, которая нуждается в поддержании структуры открытого хроматина и в увеличении её вдоль области. Действительно, тот факт, что гены в кластерах, богатых генами, имеют паттерны широкой экспрессии^1,24, гарантирует, что в большинстве клеток эти домены будут оставаться 'открытыми'. Напротив, потребность этих областей в постоянном открытии д. функционировать как селективное давление для поддержания кластеров широко экспрессирующихся генов в геноме.

Следствием этой модели является то, что экспрессия генов внутри доменов открытого хроматина д.б. готовой к индукции, когда добавляются соотв. транскрипционные факторы, не только в соотв. время (напр., во время развития), но и также в несоотвествующее время. Такая ситуация может возникать в состоянии болезни, таких ка рак, когда экспрессия генов в целом разрегулирована. Предварительный анализ показал, что в самом деле имеется тенденция для генов, которые в целом усиливают свою активность при разных раках, происходить из кластеров, богатых генами, с открытой структурой хроматиновой нити в геноме человека ⁵¹ (Рис. 3).