о всём биологическом царстве существует огромное разнообразие форм и этот феномен интересует физиков биологов уже долгое время (см On Growth and Form, D'Arcy W. Thompson
). Всё ещё неизвестно, как клетки диаметром 10-40 µm могут собираться и воспроизводить форму организма в соответствии с размером и мы не знаем, как клетки распознают свое пространственное положение внутри такой многоклеточной системы. Во время развития клеточный монослой изгибается и искривляется, чтобы создать сложную морфологию разных тканей. Внеклеточный матрикс и соседние с ним клетки состаляют основные сигналы, которые использует любая индивидуальная клетка чтобы установить и поддерживать свою форму. Однако, имеется удивительное разнообразие форм биологических систем, которое часто интимно связано с клеточной функцией. Следовательно, клетки д. ощущать физические аспекты своей среды и отвечать соответственно своевременно соответствующей клеточной функцией.
На базе обширного анализа физических аспектов клеточной среды, которая воспринимается клетками, выявлены силы и геометрия на nano-to-micrometre уровне. Многомерность принципов дизайна выявляется при описании механосенсорных элементов, которые интегрированы в структурные мотивы различных белков, что может механически вызывать переключения между конформациями (rev. Refs 2-8). Клеточная система механотрансдукции может затем переводить физические сигналы в биохимические реакции. Более сложные физические параметры, такие как ригидность матрикса или геометрия на микрометровом уровне, могут быть измерены с помощью интегрированных force- и geometry-зависимых процессов трансдукции (Fig. 1). Следовательно, важно дифференцировать между первичными сенсорными процессами, процессами трансдукции и нижестоящими механочувствительными (mechanoresponsive) путями, которые интегрируют множественные биохимические сигналы, которые возникают в результате события восприятия и трансдукции в пространстве и времени (Fig. 1).
Считается, что филаменты цитоскелета могут распространять стрессы на дальние расстояния9,10, для этого необходимо существование др. удаленных механосенсорных и сигнальных компонентов. Учитывая разнообразие механосенсорных белков, возможно, что переход механосенсорики в биохимические процессы активирует многие сигнальные пути, которые могут взаимодействовать, чтобы продуцировать контролируемые функциональные реакции. Так, реакции клеточной подвижности могут вызывать дополнительные механические сигналы, которые д. приводить ко второму циклу реакций. Первичные клеточные реакции на механические сигналы происходят в секунды до минуты, следовательно, сотни тысяч циклов реакций на стимулы могут происходить в течение дней, которые клетки поддерживаются в культуре.
Межклеточные, клетка-матрикс силы и силы потоков воспринимаются в разных контекстах, от высоких сил, ощущаемых хондроцитами в хрящевом матриксе до относительно слабых сил потоков, который воспринимаются почечными канальцами11-13. Силы, которые оказывают сами клетки на матрикс или клеточные контакты, также важны14. Межклеточные контакты динамичны и клетки, по-видимому, оценивают уровень сил и осуществляют корректировки, так филаменты цитоскелета и их связи с трансмембранными белками собираются, разрушаются , снова собираются в ансамбли.
Восприятие геометрии на субклеточном уровне является критическим компонентом клеточного восприятия двухмерного (2D) в противоположность 3D матриксу (Fig. 1c). Недавние исследования установили, что один и тот же матричный белок может осуществлять разные реакции, если он организован в филаменты, в зависимости от того, когда он располагается на плоской поверхности15-18, и что клетки могут ощущать топографию поверхности на нано-шкале (rev. Ref. 19). В контексте ткани, клетки нуждаются в дискриминации сформированных матричных волокон из одних и тех же матричных молекул, которые присутствуют в растворимой форме или индивидуально прикреплены к соседней клетке или чужеродному телу. Хотя имеется множество примеров локальной геометрии, которая навязывается с помощью средового окружения, соседних клеток или матрикса, но мы будем обсуждать, как изгиб волокон может вызывать изгиб мембраны и как пространственное распределение цитоплазматических адгезивных белков может конформировать эти искривленные мембраны, затрагивая тем самым возможно и адгезивные комплексы.
Перевод локальных механостимулов в биохимические сигналы происходит посредством нескольких сигнальных путей, но многие недавние примеры показывают, что переход осуществляется локально на периферии клеток, даже если силы и биохимические сигналы распространяются через всю клетку20-23. Сложные процессы переходов, такие как ригидность реакций, имеющие место на разных ступенях, которые могут быть скомбинированы с передачей сил и/или геометрии восприятия со временем (rev. Refs 24,25). Guanine nucleotide-exchange factors, Ca2+ ion channels, receptor-like protein tyrosine phosphatases, Src-family kinases и мембранные рецепторы все могут быть вовлечены в ранние ступени передачи сил или геометрии23,26-28. Нижестоящие сигналы затем могут вызывать комплекс сигнальных путей, которые перекрывают или модифицируют др. др. чтобы создать реальные клеточные реакции. Одной из интересных систем является клеточная реакция на ригидность окружающих условий24, которая, по-видимому, важна для опухолевого роста29. Недавние исследования показали, что норма силовой нагрузки на клетку может быть критической30, в дополнение к возможному приобретению жесткости матрикса, которая вызывается физической активностью клеток31,32. Интеграция разных механических сигналов в разных местах и в разное время, происходит посредством белков мишеней и сигнальных путей, которые осуществляют запрограммированную реакцию в собственно форму клеток и тканей.
Здесь будут рассмотрены возможные клеточные механизмы восприятия механических воздействий (mechanosensing) и ранних сигнальных событий, которые они индуцируют. Посредством nanofabrication и др. новейших технологий механизмы mechanosensing могут теперь исследоваться систематически (Box 1).
Conversion of force into biochemical signals
Изучение механических свойств одиночных молекул с использованием нано-инструментов33-35 выявило различные наборы структурных мотивов, которые могут изменять конформацию при преодолении границ механическими силами и могут в принципе выполнять механосенсорные функции (rev. Refs 2-8) (Fig. 2). Сюда входят силу индуцирующее воздействие некоторых загадочных пептидных последовательностей (Fig. 2a), открытие mechanosensitive ионных каналов (Fig. 2b) и взаимодействия лиганд-рецептор, которые усиливаются, если деформируются (Fig. 2c). Важно отметить, что такие силу-индуцирующие изменения эффективны только, если они вызывают изменения на биохимическом уровне. Рассмотрим некоторые избранные белки, которые являются частью физической сети, посредством которой силы передаются в двух направлениях от внешней к внутренней области клетки и vice versa.
Exposure of cryptic peptide sequences. Большинство белков extracellular matrix (ECM), также как и большинство белков, которые связывают integrins с цитоскелетом,состоят из тандемных повторов последовательностей (сюда входят члены семейтсва spectrin, такие как alpha-actinin и dystrophin,а также talin, titin, fibronectin, cadherins и др.; Fig. 2a). Силы могут вызывать распутывание (unravelling) модулей, что м. приводить к альтерациям в сайтах молекулярного распознавания или к экспозированию пептидных последовательностей, которые обычно спрятаны в складчатых (folded) модулях (rev. Ref. 8). Различия в механической стабильности между такими повторами могут предопределять последовательность, в которой они будут расправляться36-38.
Преодоление энергетических барьеров для расправления белков обычно совпадает с разрывом обладающих силой водородных связей, которые стабилизируют их четвертичную структуру39,40. Механическая стабильность модулей, следовательно, зависит от того, как часто обладающие силой водородные мостики могут быть атакованы свободными молекулами воды. Важная роль аминокислотных боковых цепочек в регуляции механической стабильности связан или с тем, что они или прикрывают или экспозируют эти мостики от электрофильных атак молекул воды36,41. Локальные заряды также влияют на эффективность прикрытия боковыми аминокислотными цепочками и, следовательно, pH и ионное напряжение (ionic strength) могут ещё больше настраивать механическую стабильность белков36,42. Наконец, многие модули оказываются механически стабилизированы с помощью дисульфидных связей, а их состояние окислительно-восстановительного потенциала (redox) может быть чувствительным к силам, если дисульфидные мостики глубоко погребены в модуле43.
Использование иерархических механических стабильностей для механосенсорики особенно эффективно, если тандемные повторы белка имеют разные сайты молекулярного распознавания, которые могут функционально переключаться в ответ на частичное расправление. Последовательное расправление м. служить сигналом о величине стресса, который действует на мультимодулярные белки. Белок клеточной адгезии fibronectin, напр., состоит из более чем 50 модулярных повторов - который представляет специальный интерес для механосенсорики - и встречается в большом количестве в сыворотке и во многих матриксах. Он физически сцепляет ECM с контрактильным цитоскелетом посредством своей трипептидной последовательности, RGD, которая распознается integrins. Клеточной контрактильности достаточно, чтобы частично расправить fibronectin в волокнах матрикса44,45 (Fig. 2a). Хотя присутствует множество сайтов молекулярного распознавания в петлевых регионах этих beta-sandwich мотивов, но множество и скрытых сайтов связывания идентифицировано, которые погребены внутри индивидуальных фибронектиновых мтодулей в упакованном (folded) состоянии (rev. Refs 8,46).
Force regulation of protein activities. Одним из способов перевода силы в биохимические сигналы является изменение ферментативной активности путем непосредственного приложения силы или к энзиму или его субстрату или к активатору/ингибитору энзима (rev. Refs 47,48). Сила является мощным регулятором ферментативной активности, т.к. многие энзимы могут подвергаться конформационным изменениям во время активности49, что также часто связано с конформационными изменениями их субстратов50. Кроме того, многие моторные белки д. испытывать уменьшение оборота (turnover) - напр., гидролиза АТФ - с возрастанием силы (rev. Refs 47,51). Как только натяжение в цитоскелете повышается, то моторная активность снижается, до тех пор, пока не будут достигнуты изометрические условия. Изометрическая активность ATPase моторов удерживает натяжение в цитоскелете постоянным, а рекрутирование дополнительных моторов д. приводить к повышению общего натяжения цитоскелета. Т.к. филаменты цитоскелета являются динамическими и подвергаются циклам сборки-разборки от сек. до мин., то натяжение филамент д. быстро теряться и д. постоянно поддерживаться с помощью активности моторов.
Возможно ли, что конформационные натяжения будут усиливать активность некоторых энзимов? Вопрос о том, может ли активность некоторых энзимов усиливаться за счет натяжения, если они или их субстраты физически интегрированы в force-bearing структуры, является относительно мало разработанным в контексте механосенсорики. Сила может открывать сайты ферментативного расщепления в результате частичного расправления. Fibronectin, напр., имеет частично скрытые disulphide-isomerase52 и скрытые metalloprotease активности53, но не известно, могут ли эти активности регулироваться с помощью силы. Titin содержит модуль, которые обнаруживает киназную активность, а компьютерные исследования показали механическое открытие его активного сайта54. Более того, хорошо известно, что энзимы вызывают натяжение своих субстратов после связывания - катализируя тем самым реакцию (rev. Ref. 7) - а натяжение ферментативного субстрата может, следовательно, в принципе регулировать активность энзима. недавние исследования показали, что Src субстрат is primed (активируется) для фосфорилирования путем механического расправления. Наконец, некоторые цитоплазматические белки, включая vinculin55,56 и Src57, аллостерически активируются, если их регуляторы соединяются с или демаскируют сайты, открывая тем самым обычно аутоингибированные конформации. Может ли сила также индуцировать сходное открытие сайтов в этих молекулах? Механизмы, с помощью которых силы могут регулировать функцию белков лишь постепенно выявляются благодаря новым инструментам и подходам.
Mechanosensitive ion channels. Структурное разнообразие механочувствительных каналов, по-видимому, вызвано физиологической потребностью детектировать механические стимулы - от термальной энергии до высокого давления - как изменение в состоянии проведения (Fig. 2b) (rev. Ref. 58). Некоторые каналы отвечают на стрессы в липидном бислое, тогда как др. могут быть физически связаны с цитоскелетом и/или внеклеточным матриксом, чтобы передавать силу каналу.
Бактериальный механочувствительный канал K+ , MscL, представляет первый случай из структурно проанализированных. Силы мембранного натяжения в основном концентрируются на interfacial полярных регионах головной группы MscL, тем самым они индуцируют спиральный крен, который открывает и увлажняет внутренность поры5,59. Бактериальные каналы относительно нечувствительны к силовому действию и открываются только при высоких натяжениях, которые приближаются к литическим натяжениям липидного бислоя. Растительные каналы, по-видимому, оперируют натяжениями, которые на порядок величин меньше, чем у бактериальных каналов, тогда как типичные мембранные натяжения в клетках в тысячу раз ниже, бактериального натяжения60.
Хотя четко продемонстрированы для бактерий, они не были показаны ни в плане натяжения мембран или сил, которые являются обычными для мембран, как первичная причина открытия каналов в клетках животных, но большинство из осмотических и др. механочувствительных реакций нуждаются в прикреплении к force-bearing филаментам4,61. В случае вне-плоскостных (out-of-plane) чувствительных к силе каналов, эффекты силы частично понятны на молекулярном уровне только в немногих специализированных случаях. В случае пучков наружных волосковых клеток в ушах архитектура сцепления известна, но молекулярные компоненты не идентифицированы62. В случае Caenorhabditis elegans тактильных сенсоров, идентифицированы молекулярные компоненты в ходе генетических скринингов, но архитектура сцепления неизвестна63. Др. каналы участвуют в регуляции механически индуцированного распостранения волн Ca2+ - возможно благодаря соединению с компонентами цитоскелета64. Сходным образом, ион-зависимые механосенсорные феномены в костях и хрящах65 возможно являются результатом действия out-of-plane силы на сцепления каналов с цитоскелетом.
Stabilizing adhesion sites against force-induced breakage. В белковых сетях, которые купируют ECM с контрактильным цитоскелетом, физические соединения, обусловливаются слабыми нековалентными связями и самые слабые связи д. разрываться первыми, если белковая сеть оказывается под натяжением. Из-за термальной активации эти связи имеют незначительную продолжительность жизни66. В случае скользящих связей, продолжительность жизни связей прогрессивно укорачивается, когда силы действуют на межбелковые и белок-лиганд комплексы, т.к силы изменяют (tilts) энергетический ландшафт, ускоряя тем самым диссоциацию комплекса. Время выживания самых сильных нековалентных связей, которые формируются между biotin и streptavidin, уменьшается от более чем день при статических условиях, до примерно 1 минуты или 0.001 сек. при стрессах на связи в 5 pN или 170 pN, соотв.67, в то время как натяжение в 5 pN может ожидаться в белковых комплексах с одиночным моторным белком. Следовательно, нековалентные связи будут распадаться при любом уровне растягивающих стрессов, если они длятся достаточный период времени67. Места адгезии, формирующиеся в ответ на растягивающие силы, действуют на мембрану и единственным следствием укорочения периода жизни связей под воздействием силы д.б. высокая скорость оборота составляющих вновь формируемых адгезивных сайтов. Скорость обмена происходит в течение сек., это наблюдалось для актиновых филамент и белков с двумя фокальными контактами, paxillin и vinculin, которые могут служить в качестве сигнальных молекул после их высвобождения из клеточных контактов68-70.
Как же тогда клетки могут формировать силы-поддерживающие адгезивные сайты? Т.к. силовое воздействие передается поперек мембраны, не посредствоам единичных интегринов, а с помощью интегриновых кластеров, которые со временем увеличиваются в размерах зависимым от силы способом22,71,72, то одиночные события разрыва связи не обязательно ведут к нарушению прикрепления. Предполагая, что N идентичных мостиков расположены параллельно и что сила распределяется равномерно среди этих связей, то сила необходимая для разрыва пучка из параллельных мостиков д. б. на фактор N выше, чем для одиночного мостика при той же самой нагрузке. И, что важно, значение нелинейно и даже с более крутой зависимостью, если могут происходить события становления повторных связей после одиночного разрыва66,73.
Чтобы противодействовать экпоненциальному снижению продолжительности связей при силовой нагрузке, имеются ли механизмы, с помощью которых возможно увеличение продолжительности связей в этих условиях? Хотя это и было теоретически предсказано
74, имеются доказательства только двух типов для комплексов рецептор-лиганд, которые под воздействием силы переключаются с коротко-живущего на долго-живующее состояния. Сюда входят адгезивные молекулы, такие как бактериальный adhesin FimH
75,76 и P- и возможно L-selectins
77-79. Пока неизвестно, могут ли др. адгезивные белки, такие как интегрины или белки, которые прикрепляют цитоскелет к интегринам, формировать так наз. защелкивающиеся (catch) связи, которые усиливаются под воздействием силы (Fig. 2c), или они имеют просто отношение к формированию множественных связывающих мостиков.
Geometry sensing
Естественный ECM из клеток является сложной трехмерной фиброзной сетью с широким распределением фибрилл и пробелов, которые обеспечивают сложные биохимические и физические сигналы, которые очень отличны от униформно покрытых двухмерных поверхностей. Клеточные реакции на трехмерный матрикс отличаются от их реакции на двухмерный матрикс из того же самого материала80. Как действуют эти разные физические и химические свойства, чтобы ко-регулировать локальную клеточную форму и в конечном итоге глобальную клеточную функцию? Большинство взаимоотношений между клеточной формой и функцией было дедуцировано из экспериментов с двухмерной клеточной культурой, но новые инструменты, разработаны недавно, чтобы воспроизводить паттерны, топографии и волокна на микро- и нано-шкале. Следовательно, можно узнать больше о дифференциальных вкладах различных физических и химических свойств, которые участвуют в регуляции клеточной функции.
Мы определяем восприятие геометрии (geometry sensing) как формирование сигнальных комплексов путем изменения в пространственном расположении сайтов молекулярного распознавания геометрической формы субстрата. Напр., уступы на поверхности в 11 nm могут приводить к контактному ведению81. Заставляя клетки распространяться по адгезивным микропаттернам различной формы, можно регулировать клеточную пролиферацию и клеточную гибель82 или направление поляризации может контролировать направление, в котором клетоки движутся83. Размер микропаттернов также регулирует, смогут ли мезенхимные стволовые клетки дифференцироваться в адипоциты или остеобласты84. Т.к. микропаттерны могут ограничивать клеточную форму, вызывая тем самым интегральную клеточную реакцию, но мы хотели бы только рассмотреть, как клетки могут воспринимать на нано-шкале свойства поверхности, включая нано-шкалу размеров волокон и топографий, а также пространственную презентацию сайтов молекулярного распознавания.
Sensing substrate curvature.
Волокна трехмерного матрикса воспринимаются клетками по-другому в отличие от тех же самых молекул в духмерном матриксе, вообще-то из-за изгибов мембраны, которые вызывают волокна (Fig. 3). Чтобы искусственно создать замену матриксов, тканевые инженеры сфабриковали множество микропоровых каркасов (scaffolds) из большого количества материалов с ограниченным успехом. Микро- и нано-фиброзные каркасы сегодня изучаются для создания искусственных заместителей кости и мягких тканей. Было показано, что астроциты преимущественно прилипают и пролиферируют на углеродных волокнах, которые имеют диаметр свыше 100 nm и низкие энергии поверхности85. Фибробласты перемещаются по коллагеновым волокнам с помощью специального способа перемещения, который используется одной изоформой миозина86. Та же самая изоформа миозина используется в in vivo-подобной организации и морфогенезе фибробластов, растущих на electrospun нано-фиброзном матриксе87. Было также установлено, что трехмерная сеть нанофибрил, представляющая neurite-promoting laminin эпитоп, обеспечивает селективную дифференцировку клеток нейральных предшественников88. Более того, расположение нано-фиборил и направление механических натяжений (strain) влияет на продукцию ECM89.
Но как могут клетки различать между вогнутым и выпуклым изгибом мембраны? Было установлено, что клетки прилипают по-разному к поверхностям, которые структуированы ноно-выпячиваниями по сравнению с поверхностями, покрытыми нано-ямками. Хотя некоторые 13-nm высоты нано-выпячивания увеличивали клеточное распространение, пролиферацию и формирование цитоскелета90, паттерн из нано-ямок, который был выделен из polymethylmethacrylate, снижал адгезию по сравнению с плоским субстратом91. Фактически, фибробласты выглядели как эндоцитозирующие nanocolumns92. Когда клетки формируют адгезии на субстратах со свойствами поверхности в микро- и нано-шкале, то мембрана стремится следовать внешним контурам мембраны.
Недавние исследование эндоцитоза показали, что BAR-доменовые (Bin, amphiphysin, Rvs domain) белки могут индуцировать или распознавать вогнутые мембранные изгибы и рекрутировать малые G белки. BAR домены arfaptins, как было установлено, связывают малую GTPases Rac, adenosine-ribosylation factor-1 (ARF1), ARF3 и ARF6, а также ARF-like protein-1 (ARL1; Refs 93-96). Др. член BAR-доменового семейства, BAP2alpha/IRSp53 (insulin-receptor substrate protein of 53 kDa) какбыло показано, связывает между собой Rac и WAVE (the Wiskott-Aldrich syndrome protein (WASP)-related protein) при регуляции мембранного сморщивания (ruffling)97. Однако, всё ещё неясно, может ли связывание GTPase и определение изогнутости мембраны и её связывание быть общими признаками для всех членов BAR-доменового семейства (Fig. 3a) (rev. Refs 98,99). Некоторые из BAR-доменовых белков оказывают эффекты на подвижность, что согласуется с их ролью в восприятии формы вогнутости мембраны, вызванной матриксом100,101. Следовательно, рекрутирование BAR белков на мембраны, которые связаны с искривленными поверхностями, могут оказывать выраженные эффекты на клеточную функцию, т.к. BAR белки, которые будут собираться на мембране с вогнутым изгибом, д. локально увеличивать активность малых G-белков.
Др. значение изгиба мембраны заключается в том, что внутренний и наружный листки мембраны, которые имеют одинаковое натяжение в планарной конфигурации, обладают разным натяжением при изгибании. Помимо влияния на локальный состав липидов и возможно перераспределение, образование пространственных кластеров или сегрегацию трансмембранных белков, это также может приводить к открытию механически открываемых ионных каналов (Fig. 3b). Некоторые K+ каналы, напр., открываются при выгнутом изгибе мембраны102.
Мы полагаем, что вогнутые и выпуклые мембранные изгибы могут восприниматься с помощью двух разных механизмов. BAR доменовые могут воспринимать вогнутые изгибы мембран, что формируется при контакте с наружными выпячиваниями и волокнами, тогда как мембранные каналы могут избирательно открываться, когда мембраны приходят в контакт с выемками поверхности. Если BAR-доменовые белки на самом деле соединятся преимущественно с вогнутыми поверхностями, такими как стойки или волокна, то локальное высвобождение Rac и её последующая активация, напр., с помощью integrin-сцепленной киназы103, может приводить к локальному усилению тянущих сил. В подтверждение этого предположения, известно, что активация Rac усиливает сборку фокальных комплексов103-106 и клетки прилипают более слабо к поверхностям с нано-ямками, чем к таковым с нано-выпячиваниями90,91.
Protein clustering and spacing. Т.к. мембраны жидкие, поэтому возможно механическое или диффузионное разделение компонентов на расстояния микронов, которые могут иметь биохимические последствия107. Наиболее драматическими примерами являются формирование иммунных синапсов108, имеются прекрасные доказательства, что физическое разделение разных трансмембранных рецепторов и формирование их пространственного паттерна регулируют активацию T клеток109,110.
Многие белковые агрегаты формируются в местах клетка-матрикс и межклеточных контактов, а размер и форма этих агрегатов испытывает влияние от пространственного распределения внеклеточных лигандов, с которыми они соединяются. Образование сайтов клеточной адгезии требует, чтобы RGD пептиды формировали кластеры111 на расстоянии не менее чем 73 nm (Ref. 112). Механизм восприятия пространственного положения показан в исследованиях на уровне одиночных молекул, которые показали, что одиночный тример из fibronectin type III domains 7-10 (с пространственным распределением в 50-60 nm) преимущественно соединяется с ведущими краями активных ламеллиподий, если присутствуют 55-nm длины димеры talin113,114. Будучи пространственно организованным с помощью поперечных связей или посредством талина или alpha-actinin115-117, эти олигомерные сайты рекрутируют и активируют др. компоненты для образования фокальных контактов14,112,118-120. Размеры таких комплексов адгезивных сайтов ограничиваются размером и формой контактов наружной поверхности121-123, а focal adhesion kinase (FAK) может регулировать их оборот124-128.
Кроме того, исследования одиночных адгезивных островков выявили, что фокальные адгезии локализуются асимметрично вдоль периферии малых островков, которые испытывают наивысшие тензионные стрессы
129.
Force-activated machanoresponses
Учитывая большое количество механосенсорных мотивов, в принципе д.б. несколько путей и инженерных парадигм, с помощью которых механические сигналы превращаются в биохимические сигналы. Во многих примерах процесс механотрандукции зависит от позиции и времени. position- and time- dependent. Здравое поведение механических аспектов развития большинства организмов дает неверное представление о сигнальной системе, которая высоко продуманна и заметно воспроизводима несмотря на тот факт, что активируются многие сигнальные пути. Финальная интегрированная реакция часто тонко приспособлена к данному важному функциональному поведению. Рассмотрим клеточные реакции на ригидные и в противовес мягким поверхностям, а также др. механочувствительные пути, которые используются в интегрированных реакциях130.
Реакция клеток на ригидность субстрата в клеточной культуре является клеточно-специфической и по-видимому, коррелирует с жесткостью нативной среды клеток, которая может варьировать существенно между разными тканями131,132. Всё ещё неясно, почему одни клетки, обычно требуют жесткой поверхности для роста, тогда как др. процветают на мягких поверхностях. На физическом уровне, трансдукция ригидности субстрата в биохимические сигналы нуждается или в измерении поддатливости наружных сцеплений или в измерении того, насколько они пространственно смещены при данном силовом воздействии.
Changing the rate-of-force increase. Ригидность субстрата может настраивать силу связывания клеток путем изменения rate-of-force, увеличивая действие на связь рецептор-лиганд. Считается, что существует зависимое от скорости увеличение времени, необходимого для рассоединения рецептор-лиганд и , следовательно, более высокая жесткость матрикса д. увеличивать продолжительность жизни связи66. Кроме того, при жестком сцеплении некоторые связи в адгезивных комплексах могут усиливаться, если под напряжением (catch связи). Следовательно, физические механизмы д.б. чувствительны к скорости увеличения силового воздействия, осуществляемого внешними лигандами, как установлено по их границам поддатливости.
Measurement of displacement for a given force. Напротив, связывание внешнего лиганда или механическая деформация могут инициировать сборку двух разных комплексов в клетках, один, зависит от силы, т.к. он сцеплен и с цитоскелетом и с внешним лигандом и второй, который только сцеплен с отдельным внеклеточным сайтом или искривленным краем мембраны (Fig. 4). Первый комплекс может транслоцироваться с помощью в тыл движущих актиновых филамент, тогда как второй комплекс остается стационарным. Если цитоскелет притягивает лиганд, то ригидность внешнего сцепления лиганда будет предопределять, насколько сцепленные с цитоскелетом комплексы будут смещены за данный период времени, прежде чем достичь изометрических условий, и будет ли достаточно силового воздействия для активации каких-либо сенсоров усилий посредством экспозиции обычно скрытых пептидных последовательностей. Для мягких субстратов, разделение между фиксированными и движущимися компонентами более значительно и может быть достаточным для предупреждения сенсоров от взаимодействия со стационарным компонентом (Fig. 4).
Др. относительные изменения в пространственном расположении могут происходить благодаря частичному расправлению белка. Базируясь на наблюдениях с лазерными пинцетами, стало ясно, что изменения в силе (of approx 10 pN) на временной шкале в 1 сек. или по длине 50-100 nm (напр., молекулярный уровень) могут двать реакции на ригидность25,133. Некоторые наблюдения показали, что временная шкала в 1 сек. важна. Напр., нормальная скорость транспорта в тыл актина (60 nm second-1; Ref. 134) может перемещать сайт на 50-100 nm приблизительно за 1 сек. Движения тела, такие как ходьба, сокращения сердца и др. активности, которые вызывают тканевые контракции, также осуществляются на временной шкале приблизительно в 1 сек. Более того, анализ реакции эндотелиальных клеток на кусочки магнита выявил драматические различия в осцилляциях в силе при частоте примерно в 1 Hz (Ref. 135). Следовательно, можно предположить, что осцилляции в силе в 1 сек. временной шкале могут продуцировать реакцию ригидности и такие осцилляции in vivo д.б. результатом нормальной сократительной активности ткани и тканевой ригидности.
Разные клетки часто имеют разные реакции на ригидность матрикса24. Напр., нейроны обнаруживают предпочтение к мягким поверхностям, тогда как фибробласты растут лучше на ригидных поверхностях132. Тирозин киназа FAK, как было установлено, участвует в пути, который воспринимает жесткость polyacrylamide поверхностей, которые покрыты коллагеном136, тогда как Src киназы участвуют в восприятии жесткости на поверхнотях, которые покрыты фибронектином30 (A. Kostic and M.P.S., unpublished observations). Более того, на важном субстрате для киназ Src-семейства, p130Cas, обнаруживается заметное увеличение фосфорилирования на клетках или натяжение цитоскелета137. Некоторые исследования показали, что тирозин киназы и фосфатазы играют критическую роль в восприятии ригидности. Extracellular signal-regulated kinases (ERKs) и Rho составляют часть интегрированного механорегуляторного циркуита, который связан с твердостью матрикса посредством образования кластеров интегрина, с натяжением цитоскелета и в конечном итоге с регуляцией тканевого фенотипа2,9,84,105,138.
Во время распространения клеток или миграции клетки постоянно сталкиваются с новыми лигандами. Когда клетки стабилизируются в ткани, они становятся менее динамичными, однако, происходит непрерывный обмен контактных и цитоскелетных белков на временной шкале в минуты или меньше
14,69,72,106,120,139. Т.к. клеточные контакты поддерживаются днями, а возможно и дольше, то новые контакты д. формироваться по мере потери старых. Эти новые контакты могут тестироваться на ригидность и, следовательно, клетки могут постоянно выбирать ригидность своего окружения. В самом деле, во время разрастания и миграции клетки генерируют периодические контракции своих ламмелиподий на ригидном, но не на мягком субстрате
134. Неожиданно, было установлено, что некоторые клетки теряют свою форму чувствительности к ригидности субстрата, как только они приходят в контакт с др. клетками
31. Межклеточное связывание может переписать передачу сигналов, индуцированную клетка-субстрат взаимодействием. В тканях, клеточный уровень механовосприятия, трансдукции и реакции может поддерживать собственно физический гомеостаз, который заметно изменен при раке
29.
Global regulation of cell function
На клеточном уровне механические сигналы м. вызывать выраженные эффекты, которые могут приводить к клеточной гибели, росту или дифференцировке. Поэтому эффекты чрезвычайно важны, клетки не только постоянно отслеживают механическую среду, но и также активно ремоделируют свою среду. Поэтому ничего удивительного в том, что попытки создания искусственных тканевых каркасов часто наталкивались на неблагоприятное клеточное поведение133,140,141. Поэтому необходимо обсудить общие процессы, от механовосприятия к экспрессии белков в терминах ассоциированной временной зависимости (Fig. 5).
События инициального взаимодействия и механовосприятия происходят за долю секунды до секунды. Ранние клеточные реакции занимают от секунд до минут и связаны с цитоскелетным перераспределением, пересмотром сцеплений и изменением клеточной подвижности. Эти изменения влекут за собой активацию рассширения актиновых филамент, рекрутирование миозиновых молекул, чтобы вызвать клеточные контракции, консолидацию адгезивных контактов путем рекрутирования др. рецепторов и цитоплазматических молекул, чтобы поддержать силы сокращений миозина, а иногда и глобальную клеточную реакцию, такую как взрыв в передаче сигналов Ca2+ или общих сокращений.
Т.к. клетки генерируют силы на белках, которые связывают ECM с цитоскелетом, то реакции механочувствительных сайтов на силы и поддатливость (compliance) или изменения в локальной искривленности будут вызывать вторичные клеточные реакции. Примеры таких повторяющихся процессов включают клеточную поляризацию и зависимый от размера фагоцитоз крупных частиц, которые используют специфический способ актин-зависимого расширения мембран, который соответствует форме фагоцитированных частиц142. В случае поляризации клеток, однонаправленные вытягивания, fluid shear или градиенты ригидности часто достаточны, чтобы вызывать поляризацию26,143,144, a внеклеточный матрикс управляет ориентацией оси клеточного деления145. Сборка актиновго цитоскелета может запускаться механически. Однонаправленные натяжения супрессируют ламмелиподии направленным способом26, причем активаци Rac зависит от направления натяжения26,106. Во время этих ранних механовоспринимающих и ответных событий часто оказывается недостаточно времени для синтеза новых белков.
Хотя физические свойства ECM предопределяют инициальную реакцию ригидности, генерируемые клетками силовые воздействия на матрикс выравнивают и ужесточают их32 и частично расправляют ECM белки в непрерывной петле обратной связи, которая регулируется с помощью клеточной контрактильности45,146,147 (M. Antia, G. Baneyx and V.V., unpublished observations). Степень, с которой матричные белки расправляются, д. регулировать экспозицию из скрытых пептидных последовательностей или менять конфигурацию экспозируемых сайтов распознавания, обусловливая тем самым способность клеток само-регулироваться посредством контракций и сигнальных процессов (rev. Refs 8,148). Механические стрессы также могут усиливать продукцию ECM белков косвенно, путем стимуляцити высвобождения паракринных ростовых факторов или непосредственно, запуская внутриклеточные сигнальные пути, которые активируют экспрессию генов149. Внешние силы или изменения в клеточной контрактильности д. ещё больше изменять конфигурацию экспозируемых сайтов. Quasi-, хотя и высоко динамичное, устойчивое состояние часто достигается тем, что используются циклы экспрессии, модификации и наконец обмена белков с дальнейшей регуляцией с помощью внешних химических и физических стимулов.
Какие эффекты, вызывающие локальную реакцию на ригидность и форму, сказываются на форме клеток и генной экспрессии? Как отмечалось выше, сила периферических контактов может продуцировать сигнальные молекулы, которые будут транслоцироваться в ядро. Напротив, плазматическая мембрана физически связана с ядерной мембраной150, и вполне возможно, что физические факторы и ядерные деформации могут регулировать экспрессию генов посредством ещё неизвестного механизма. Относительно мало обсуждается факт, что силы, действующие на периферические адгезивные комплексы и , следовательно, ассоциируют с пространственными смещениями или эффектом расправления белка, являются более высокими, чем те, что в ядерной мембране. Т.к. силы диссипируют от места локального приложения на периферии ядра, скорее всего, что механизм механовосприятия более эффективно амплифицируется на периферии и, следовательно, имеют наивысший эффект в периферических контактах.
Транскрипционные факторы, которые рекрутируются в адгезивные сайты, д. иметь важную роль в трансляции физических стимулов, которые воспринимаются на периферии, в биохимические сигналы, которые меняют экспрессию генов. Транскрипционные факторы могут быть модифицированы зависимым от силы способом и транспортированы в ядро; напр., paxillin модифицируется в местах фокальных контактов и затем транспортируется в ядро70. Этот механизм обеспечивает очевидный способ трансформировать силу на специфические сайты межклеточной адгезии, чтобы изменить экспрессию белков.
Недавние исследования микромассивов подтвердили, что изменения в клеточной форме короррелируют с некоторыми изменениями в экспрессии генов
19. Важные зависимые от формы изменения в экспрессии генов обнаруживаются для белков цитоскелета, пролиферации, транскрипции, трансляции, продукции ECM и для меж- и внутриклеточных сигнальных комплексов. Когда клетки округляются, то гены, кодирующие некоторые малые G белки, оказываются среди тех, что подавляются. Тирозин киназы, которые взаимодействуют с G белками семейства Ras, чтобы стимулировать пролиферацию и дифференцировку клеток, также подавляются, как alpha-actinin
19. Многие из таких тирозин киназ и фосфатаз, что связаны с изменениями клеточной и тканевой формы, также связаны с ранними событиями восприятия сил и ригидности (rev. Ref. 25). Эти наблюдения указывают на то, что общая форма клеток, которая является результатом локальных реакций на силовые воздействия и геометрию во времени и интеграция этих реакций, играют важную роль в регуляции генной экспрессии. Для синтетических поверхностей, однако, не только геометрия и ригидность, но и также химия их поверхности, которые в конечном итоге и контролируют состав и конформацию абсорбируемых на поверхности белков и, следовательно, обеспечиваемые интегринами клеточно-сигнальные процессы
151.
Conclusions
There is a continual feedback between cell sensing of force, rigidity or form and the cell contractility that, together with biochemical signals, coregulates cell and tissue shape and, ultimately, the shape of the organism. New nanotechnologies will enable us to test the molecular mechanisms of mechanosensing and transduction. Important questions include a further definition of the local responses to mechanical and geometrical forces and the investigation of signal propagation within the cell, including within the nucleus, to control gene expression. Tissue scaffolds that are engineered at the micro- and nanoscale will enable a better understanding of the force- and geometry-sensing mechanisms, which then must be linked with the cellular-response pathways for both short- and long-term morphological changes.
Сайт создан в системе
uCoz
