Роль Форминов

Molecular details of formin-mediated actin assembly David R Kovar Current Opinion in Cell Biology Volume 18, Issue 1 , February 2006, Pages 11-17 \| doi:10.1016/j.ceb.2005.12.011 Article
Рис.1. Structural, biochemical and mechanistic insights into mDia1 regulation. (a) Domain organization of mouse formin mDia1. G, region necessary for binding Rho GTP-ase (Rho) [38- 40]; DID, diaphanous inhibitory domain [38•]; DD, dimerization domain [39,40]; FH1 and FH2, formin homology domains; DAD, diaphanous auto-regulatory domain [42,43]. Regulatory domains flank FH1 and FH2, which mediate actin filament assembly. Association of the C-terminal DAD with the N-terminal DID inhibits the FH2. Rho-GTPase activates FH2 by associating with the G and DID, resulting in dissociation of the DAD. (b) Schematic representation of formin domain structures. Crystal structures show that both the mDia1 N-terminal G, DID and DD domains (left) [39,40] and the budding yeast Bni1p C-terminal FH2 domain (middle) [22] dimerize. A full-length formin ‘homodimer’ (right) might consist of a flexible proline-rich FH1 domain tethered at either end to dimerization domains. (c) Schematics of mDia1 regulation. Left: a typical model for autoinhibition of an mDia1 monomer via DAD–DID interaction, relieved (activated) by association of Rho-GTPase to residues within the G and DID [39]. However, the molecular details of mDia1 homodimer regulation (right) may be more complicated. Schematics of three (of many) possible models: (1) DID–DAD interaction for both halves of an intact homodimer; (2) DID–DAD interaction for both halves of a dissociated FH2 homodimer; and (3) DID–DAD interaction between two anti-parallel homodimers. Рис.2. \| Formin-mediated actin filament elongation. (a) Continual (processive) attachment of formin FH1FH2 constructs (fission yeast Cdc12, budding yeast Bni1, mouse mDia1 and mDia2) to growing barbed ends has been directly demonstrated by observing filament elongation from formin immobilized on microscope slides [6,7] (Kovar et al., unpublished) and polystyrene beads [8]. Filaments do not dissociate from formin during the incorporation of thousands of actin or profilin actin subunits. When immobilized NEM-myosin captures a filament growing from an immobilized formin, piconewton forces from polymerization buckle the filament, as observed by total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy [7]. Scale bar represents 5 µm. (b) Formins have dramatic effects on the rate of elongation. In the absence of profilin, formins reduce the elongation rate, compared to free barbed ends, variously from 100% inhibition (fission yeast Cdc12) to 0% inhibition (mouse mDia1). Profilin increases the elongation rate of all formin-associated barbed-ends [7,8]. (c) Although the rates of particular steps vary, the general mechanism is conserved between formins. Continual attachment of formin with the elongating actin filament barbed end is dependent upon the FH2 dimer, which encircles the filament end like a donut [24]. The FH2 dimer is in rapid equilibrium (K_o/c) between a ‘closed’ (left) and an ‘open’ (right) state. The equilibrium constants vary among formins, ranging from mostly capped for fission yeast Cdc12p (K_o/c = 0.01) to mostly open for mouse mDia1 (K_o/c = 1.0). Although profilin and profilin–actin can bind to the proline-rich FH1 domain in both states (pathways 4 and 5), actin or profilin–actin can add to the barbed end only when the FH2 dimer is ‘open’ (pathways 1–3). Free profilin–actin (pathway 2) adds at only a third the rate of free actin (pathway 1). Profilin–actin associated with the flexible FH1 domain can assemble up to 5–10-fold faster than free actin (pathway 3). Рис.3. \| Differential regulation allows formins to manufacture long filaments that are crosslinked into polar bundles at specific cellular locations. (a) In budding yeast, by localizing to the bud neck and bud tip, formins Bnr1 and Bni1 assemble polarized actin cables whose barbed ends are oriented for myosin-V directed delivery of vesicles and organelles to the division site and expanding bud tip (schematic based on diagrams by Tony Bretscher and colleagues, Cornell University). (b) At the leading edge of a motile cell, mouse mDia2 [17] and Dictyostelium dDia2 [19] are required for filopodium formation, suggesting that locally activated mDia2/dDia2 allow barbed end elongation of a subset of Arp2/3 complex branched actin filaments (schematic based on a similar model postulated for VASP [44 and 45]).	Formins are a large family of multi-domain polypeptides that form homodimers. The highly conserved formin homology 2 (FH2) domain and its neighboring formin homology 1 (FH1) domain, which are surrounded by regulatory domains, cooperate in rapidly assembling profilin–actin into long filaments while remaining continuously associated with the fast-growing barbed end. Recent biochemical, biophysical, theoretical and structural studies have concluded that diverse formins are mechanistically similar, but that the rates of various assembly states differ quantitatively, and have shed light on the mechanism of formin auto-regulation and activation by Rho GTPases. Клетки поддерживают большие резервы актиновых мономеров, связанных с profilin [1]. Связанные profilin–actin не могут быть добавлены к заостренному концу, а актиновые филаменты со свободными колючими (barbed) концами нуждаются в быстрой сборке. Новые филаменты создаются прежде всего за счет увеличивающегося списка механистически отличных nucleating белков. Spire соединяется и стабилизирует заостренный конец, позволяя barbed концу оставаться свободным, чтобы удлиняться [2]. Arp2/3 комплекс соединяется с боковой поверхностью материнской филаменты и инициирует ответвление путем воссоздания заостренного конца новой дочерней филаменты.Ассоциированные с заостренным концом nucleators не являются идеальными для ждя создания длинных филамент, т.к. свободные barbed концы быстро связываются с помощью capping белков, которые блокируют добавление мономеров [3]. Как же филаменты становятся длинными без того чтобы быть покрытыми шапочкой (capped), потребных для нескольких базирующихся на актине структурам? Это обеспечивается formin, которые обеспечивает закладку (nucleates) [4 and 5] и затем остается постоянно (processively) ассоциированным с удлиняющимся barbed концом [6-8]. Processive ассоциация формина с barbed концом защищает от capping белков [9-12], тогда как одновременно направляемое добавление profilin–actin к barbed концу становится в 5–10-раз быстрее чем к свободному актину [8]. Formin-mediated actin assembly Formins являются крупными мульти-доменовыми белками (Figure 1a), необходимыми для сборки актиновых филамент, обнаруживаются в цитокинетическом контрактильном конце, дрожжевых актиновых кабелях, слипчивых соединениях между эпителиальными клетками и в филоподиальных выпячиваниях [13-20]. Определяющими свойствами formin являются примерно в 400 остатков FH2 домен [21] и соседний вартьирующей длины богатый пролином FH1 домен вблиза С конца (Figure 1a), которые кооперативно обеспечивают сборку актиновых филамент. Кристаллическая структура показывает, что домен FH2 Bni1p от почкующихся дрожжей формирует стабильные, но гибкие, димерные 'donut' (Figure 1b) [22]. Домен FH2 необходим и достаточен для нуклеации сборки актиновых филамент [4,23] и соединяется с низким nM сродством [4] и остается постоянно ассоциированным (processive) с быстро растущим barbed концом (Figure 2a) [6-10]. Processive ассоциация с barbed концом объясняет общие свойства всех изученных форминовых FH2 доменов: formins не влияют на скорость элонгации/деполимеризации заостренного конца, по-разному редуцируют скорость элонгации/деполимеризации barbed конца(Figure 2b), и позволяет barbed концам удлиняться в присутствии готовых присоединиться к barbed концу capping белков. Как FH2 остаются постоянно ассоциированными с удлиняющимся barbed концом является неразрешенным вопросом. Большинство схематических моделей [8-11,22] предсказывает, что каждая половина FH2 гомодимера взаимодействует только с одной субъединицей актина (одна половинка с последней субъединицей и др. с предпоследней субъединицей) и что она 'stair steps' с удлиняющимся колючим концом. Модели, которые предполагают диссоциацию подтягиваемой FH2 половинки с предпоследней субъединицы актина, чтобы создать пространство для дополнения следующей субъединицы актина, затрудняются с объяснением, как FH2 домены удерживаются при быстрой скорости элонгации (ко крайней мере 100 субъединиц/сек)[8], как они остаются processive во время добавления десятков тысяч субъединиц [7,8], или почему они не ротируют на колючем конце удлиняющейся филаменты [7]. Удивительный ко-кристалл Bni1 FH2 ассоциирует с tetramethyl-rhodamine-меченным актином (TMR actin), демонстрируя, что гибкость FH2 димера позволяет актиновой филаменте находиться внутри 'donut hole' [24], позволяя каждой половинке FH2 димера взаимодействовать с двумя субъединицами актина на конце филаменты (всего три субъединицы связываются, т.к. предпоследняя субъединица связывается обеими FH2 молекулами). Такая конфигурация позволяет обеим FH2 половинкам сохранять постоянную связь во время добавления субъединиц, т.к. только один из двух контактов, осуществляемых каждой половинкой необходимо освободить, чтобы сделать возможным добавление нового мономера. Кроме того, было предположено, что FH2 доменовый димер ротирует в направлении противоположном направлению ротации удлиняющейся актиновой спирали [25], тем самым становится возможной элонгация длинных филамент, которые не накапливают торсионные стрессы и суперскручивание [26]. Структурные и биохимические эксперименты предоставили рабочую модель, согласно которой FH2 димер существует в равновесии между 'закрытым' состоянием. которое не позволяет добавлять субъединицу, и 'открытым' состоянием (Figure 2c) [24]. Переход от 'закрытого' к 'открытому' состоянию связан с движением запаздывающей единицы FH2 димера в направлении barbed конца, приводя к тому, что две субъединицы FH2 димера меняются ролями [24]. Такие переходы д. совершаться быстро, т.к. скорость элонгации в присутствии formin увеличивается линейно с концентрацией актина [9]. FH2 домены снижают скорость удлинения колючего конца (по сравнению со свободным barbed концом), но величина эффекта варьирует между форминами [7-11,23,24,27,28], указывая на то, что равновесие между открытым и закрытым состоянием (K_o/c) варьирует среди форминов (Figure 2b and c). Cdc12 делящихся дрожжей полностью блокирует элонгацию (K_o/c ≤ 0.01), vsibyst FRL1 b mDia2 замедляют элонгацию примерно на 80% (K_o/c = 0.2), Bni1 почкующихся дрожжей замедляет элонгацию примерно на 50% (K_o/c = 0.5), а мышиный mDia1 оказывает незначительное влияние на элонгацию (K_o/c ≥ 0.9). Кроме того, K_o/c скорость добавления актина и/или удаления с barbed конца в 'открытом' состоянии также может вность вклад в различие в скорости элонгации в присутствии разных форминовых FH2 доменов. Гибкие FH1 домены характеризуются короткими участками последовательных остатков пролина, которые связывают профилин с низким µM сродством [13], они соседствуют с FH2 доменом (Figure 1a). Как количество связывающих profilin сайтов (1-16), так и сродство каждого сайта могут существенно варьировать. Тем не менее для всех изученных формировых FH1FH2 конструкций, profilin увеличивал скорость элонгации barbed концов (Figure 2b) [7,8,27] (Kovar et al., unpublished), указывая тем самым, что profilin может взаимодействовать как с actin, так и с FH1 [5,23,27]. Величина повышения зависит как от собственно formin, так и концентрации profilin (Kovar et al., unpublished). При оптимальных концентрациях profilin скорость элонгации для всех formins выше, чем в контрольных филаментах, приблизительно в 5-10-раз выше для мышиного mDia1 [8]. Наиболее драматический эффект у Cdc12 делящихся дрожжей, т.к. скорость элонгации barbed конца увеличивается бесконечно от приблизительно 0.0µM^-1 sec^-1 в отсутствие profilin до 12.5µM^-1 sec^-1 (125-раз выше, чем на свободных barbed концах) в присутствии profilin. При высоких концентрациях profilin скорость элонгации ниже, благодаря конкуренции свободного profilin с profilin-actin за связывание FH1 сайтов. Механизмы, которые могут вносить вклад в эффекты profilin's, включают следующие: profilin-actin соединение с FH1 (по крайней мере для Cdc12p делящихся дрожжей), которое может увеличивать K_o/c (open/closed равновесие); привязывание profilin-actin к FH1, которое может увеличивать вероятность того, что actin будет ориентироваться преимущественно на связывание с barbed концом; и увеличение локальной коанцентрации profilin-actin на несколько порядков величин. Возникающая в результате модель заключается в том, что хотя параметры определенных реакций (i.e. K_o/c и величины увеличения profilin) варьируют между formins, общий механизм законсервирован (Figure 2c). Многие детали ещё предстоит разработать. Напр., механизм, с помощью которого FH2 'гуляет' вдоль barbed конца неясен в деталях. Также спорна роль actin's ATФ в formin-обеспечиваемой элонгации. В одном исследовании profilin, как было показано, ингибирует элонгацию актиновых филамент, ассоциированных с мышиным mDia1 в присутствии неспособных к гидролизу Mg-AMP-PNP, указывая тем самым, что гидролиз АТФ необходим для processivity [8], тогда как в др. исследовании с 4 formins (включая мышиный mDia1) было найдено, что они остаются processively ассоциированными с удлиняющимися ADP-actin как в отсутствие, так и в присутствии profilin (Kovar et al., unpublished). Важно также охарактеризовать дополнительные формины внутри и между организмами, чтобы протестировать механистические различия. растительный форминовый FH2 домен полностью ингибирует элонгацию barbed конца, в то время как соотв. конструкция FH1FH2 позволяет элонгацию barbed конца даже в отсутствие profilin [29]. Кроме того, nucleating активность у почкующихся дрожжей Bni1, но не Bnr1, увеличивается за счет фактора клеточной полярности Bud6/Aip3 [30]. Regulation of formins Почему большинство организмов обладают множественными (2 у почкующихся дрожжей; 6 у Drosophila; 15 млекопитающих) изоформ formin? Хотя возможно, что количественные различия в скорости элонгации актиновых филамент имеют физиологическое значение, но простейшей гипотезой является, что клетки нуждаются в форминах, который дифференциально регулируются. Напр., делящиеся дрожжи содержат 3 изоформы форминов, каждая из которых локализуется дифференциально и собирает актиновые филаменты , необходимые для самостоятельных клеточных процессов [13,15,31,32].Сходным образом две изоформы у почкующихся дрожжей Bni1 и Bnr1 (Figure 3a), также как у мышей и Dictyostelium formins mDia2 и dDia2 (Figure 3b), собирают актиновые филаменты, необходимые для уникальных актиновых структур [17,19,33-35]. FH1FH2 домены сборки актина фланкированы с каждой стороны регуляторными доменами (Figure 1a), которые менее законсервированы. Diaphanous-родственные formins регулируются с помощью ауто-ингибиции посредством взаимодействия между N и М концами (Figure 1a and c). Соединение Rho GTPase с N-терминальной областью активирует формины благодаря высвобождению FH1FH2-домен-содержащего С конца [36,37]. Интересна работа недавно пролла свет на структурные и биохимические детали механизма ауторегуляции мышиного formin mDia1 [38-40]. Diaphanous autoinhibitory domain (DAD) является участком из 20-30 аминокислот, обнаруживаемым С-терминальнее FH2 домена (Figure 1a), который соединяется с sub-µM сродством с diaphanous inhibitor domain (DID) [38], примерно в 250 остатков областью, расположенной вблизи N конца. DAD-DID взаимодействия достаточно для ауто-ингибирования. Две кристаллические структуры показали, что DID складывается в 5 повторов armadillo и что остатки, непосредственно следующие за DID доменом (dimerization domain или DD) формируют высоко стабильны гомодимер [39,40]. Rho GTPase активирует mDia1 путем соединения с низким µM сродством с областью, которая представляет как часть DID (которая перекрывается с DAD-DID взаимодействием) так и G домен (остатки выше DID, которые необходимы для связывания GTP-ase) [38-40]. Следовательно, хотя ассоциации Rho и DAD с регуляторной областью mDia1 взаимно исключающие, сайты их связывания только частично перекрываются, но они являются общей темой для аутоингибирующей регуляции Ras GTPase эффекторов [40]. Ко-кристалл RhoC в комплексе с G-DID-DD показал, что две молекулы RhoC ассоциируют с G-DID-DD гомодимером посредством Rho 'switch' областей [39]. Принимая во внимание, что полной длины formin возможно формирует стабильный димер, который спарен вблизи как N конца (DD) так и С конца (FH2) (Figure 1b), то детали регуляции mDia1 могут быть значительно сложнее, чем сегодня представляется (Figure 1c). Др. diaphanous-родственные формины, которые содержат DAD и DID последовательности и регулируются с помощью Rho GTPases [41], возможно обладают сходным с mDia1 механизмом. Однако, многие формины не содержат очевидных DAD и DID последовательностей [36 и 37], так что способ их регуляции определенно отличен. Conclusions Formins are remarkable machines that allow the rapid assembly of profilin–actin into long polarized unbranched actin filaments in a spatial and temporally regulated fashion. By employing a domain-by-domain approach, rapid progress has been made towards understanding the molecular mechanism(s) of formin regulation and formin-mediated actin assembly. We are now beginning to understand that although formins are variously regulated, their mechanism for actin assembly is conserved even though the rates of particular reactions are quantitatively different. However, we must test whether full-length formins retain the same molecular characteristics. Given their size (typically > 1000 residues) and low abundance this will not be a trivial endeavor. Additionally, many fascinating questions remain. What are the structural arrangements of the ‘open’ and ‘closed’ states on the barbed end, and what are the bases for intrinsic differences between diverse FH2 domains? How does profilin increase the rate of elongation beyond the diffusion limit? Are differences between formins in their Ko/c (equilibrium between ‘open’ and ‘closed’ states) and in the extent to which profilin enhances their barbed end elongation physiologically relevant? Finally, given that many organisms contain multiple profilin isoforms, does the particular profilin isoform affect the rate of barbed end elongation?

Formins are a large family of multi-domain polypeptides that form homodimers. The highly conserved formin homology 2 (FH2) domain and its neighboring formin homology 1 (FH1) domain, which are surrounded by regulatory domains, cooperate in rapidly assembling profilin–actin into long filaments while remaining continuously associated with the fast-growing barbed end. Recent biochemical, biophysical, theoretical and structural studies have concluded that diverse formins are mechanistically similar, but that the rates of various assembly states differ quantitatively, and have shed light on the mechanism of formin auto-regulation and activation by Rho GTPases.

Клетки поддерживают большие резервы актиновых мономеров, связанных с profilin [1]. Связанные profilin–actin не могут быть добавлены к заостренному концу, а актиновые филаменты со свободными колючими (barbed) концами нуждаются в быстрой сборке. Новые филаменты создаются прежде всего за счет увеличивающегося списка механистически отличных nucleating белков. Spire соединяется и стабилизирует заостренный конец, позволяя barbed концу оставаться свободным, чтобы удлиняться [2]. Arp2/3 комплекс соединяется с боковой поверхностью материнской филаменты и инициирует ответвление путем воссоздания заостренного конца новой дочерней филаменты.Ассоциированные с заостренным концом nucleators не являются идеальными для ждя создания длинных филамент, т.к. свободные barbed концы быстро связываются с помощью capping белков, которые блокируют добавление мономеров [3]. Как же филаменты становятся длинными без того чтобы быть покрытыми шапочкой (capped), потребных для нескольких базирующихся на актине структурам? Это обеспечивается formin, которые обеспечивает закладку (nucleates) [4 and 5] и затем остается постоянно (processively) ассоциированным с удлиняющимся barbed концом [6-8]. Processive ассоциация формина с barbed концом защищает от capping белков [9-12], тогда как одновременно направляемое добавление profilin–actin к barbed концу становится в 5–10-раз быстрее чем к свободному актину [8].

Formin-mediated actin assembly

Formins являются крупными мульти-доменовыми белками (Figure 1a), необходимыми для сборки актиновых филамент, обнаруживаются в цитокинетическом контрактильном конце, дрожжевых актиновых кабелях, слипчивых соединениях между эпителиальными клетками и в филоподиальных выпячиваниях [13-20]. Определяющими свойствами formin являются примерно в 400 остатков FH2 домен [21] и соседний вартьирующей длины богатый пролином FH1 домен вблиза С конца (Figure 1a), которые кооперативно обеспечивают сборку актиновых филамент.

Кристаллическая структура показывает, что домен FH2 Bni1p от почкующихся дрожжей формирует стабильные, но гибкие, димерные 'donut' (Figure 1b) [22]. Домен FH2 необходим и достаточен для нуклеации сборки актиновых филамент [4,23] и соединяется с низким nM сродством [4] и остается постоянно ассоциированным (processive) с быстро растущим barbed концом (Figure 2a) [6-10]. Processive ассоциация с barbed концом объясняет общие свойства всех изученных форминовых FH2 доменов: formins не влияют на скорость элонгации/деполимеризации заостренного конца, по-разному редуцируют скорость элонгации/деполимеризации barbed конца(Figure 2b), и позволяет barbed концам удлиняться в присутствии готовых присоединиться к barbed концу capping белков.

Как FH2 остаются постоянно ассоциированными с удлиняющимся barbed концом является неразрешенным вопросом. Большинство схематических моделей [8-11,22] предсказывает, что каждая половина FH2 гомодимера взаимодействует только с одной субъединицей актина (одна половинка с последней субъединицей и др. с предпоследней субъединицей) и что она 'stair steps' с удлиняющимся колючим концом. Модели, которые предполагают диссоциацию подтягиваемой FH2 половинки с предпоследней субъединицы актина, чтобы создать пространство для дополнения следующей субъединицы актина, затрудняются с объяснением, как FH2 домены удерживаются при быстрой скорости элонгации (ко крайней мере 100 субъединиц/сек)[8], как они остаются processive во время добавления десятков тысяч субъединиц [7,8], или почему они не ротируют на колючем конце удлиняющейся филаменты [7]. Удивительный ко-кристалл Bni1 FH2 ассоциирует с tetramethyl-rhodamine-меченным актином (TMR actin), демонстрируя, что гибкость FH2 димера позволяет актиновой филаменте находиться внутри 'donut hole' [24], позволяя каждой половинке FH2 димера взаимодействовать с двумя субъединицами актина на конце филаменты (всего три субъединицы связываются, т.к. предпоследняя субъединица связывается обеими FH2 молекулами). Такая конфигурация позволяет обеим FH2 половинкам сохранять постоянную связь во время добавления субъединиц, т.к. только один из двух контактов, осуществляемых каждой половинкой необходимо освободить, чтобы сделать возможным добавление нового мономера. Кроме того, было предположено, что FH2 доменовый димер ротирует в направлении противоположном направлению ротации удлиняющейся актиновой спирали [25], тем самым становится возможной элонгация длинных филамент, которые не накапливают торсионные стрессы и суперскручивание [26].

Структурные и биохимические эксперименты предоставили рабочую модель, согласно которой FH2 димер существует в равновесии между 'закрытым' состоянием. которое не позволяет добавлять субъединицу, и 'открытым' состоянием (Figure 2c) [24]. Переход от 'закрытого' к 'открытому' состоянию связан с движением запаздывающей единицы FH2 димера в направлении barbed конца, приводя к тому, что две субъединицы FH2 димера меняются ролями [24]. Такие переходы д. совершаться быстро, т.к. скорость элонгации в присутствии formin увеличивается линейно с концентрацией актина [9]. FH2 домены снижают скорость удлинения колючего конца (по сравнению со свободным barbed концом), но величина эффекта варьирует между форминами [7-11,23,24,27,28], указывая на то, что равновесие между открытым и закрытым состоянием (K_o/c) варьирует среди форминов (Figure 2b and c). Cdc12 делящихся дрожжей полностью блокирует элонгацию (K_o/c ≤ 0.01), vsibyst FRL1 b mDia2 замедляют элонгацию примерно на 80% (K_o/c = 0.2), Bni1 почкующихся дрожжей замедляет элонгацию примерно на 50% (K_o/c = 0.5), а мышиный mDia1 оказывает незначительное влияние на элонгацию (K_o/c ≥ 0.9). Кроме того, K_o/c скорость добавления актина и/или удаления с barbed конца в 'открытом' состоянии также может вность вклад в различие в скорости элонгации в присутствии разных форминовых FH2 доменов.

Гибкие FH1 домены характеризуются короткими участками последовательных остатков пролина, которые связывают профилин с низким µM сродством [13], они соседствуют с FH2 доменом (Figure 1a). Как количество связывающих profilin сайтов (1-16), так и сродство каждого сайта могут существенно варьировать. Тем не менее для всех изученных формировых FH1FH2 конструкций, profilin увеличивал скорость элонгации barbed концов (Figure 2b) [7,8,27] (Kovar et al., unpublished), указывая тем самым, что profilin может взаимодействовать как с actin, так и с FH1 [5,23,27]. Величина повышения зависит как от собственно formin, так и концентрации profilin (Kovar et al., unpublished). При оптимальных концентрациях profilin скорость элонгации для всех formins выше, чем в контрольных филаментах, приблизительно в 5-10-раз выше для мышиного mDia1 [8]. Наиболее драматический эффект у Cdc12 делящихся дрожжей, т.к. скорость элонгации barbed конца увеличивается бесконечно от приблизительно 0.0µM^-1 sec^-1 в отсутствие profilin до 12.5µM^-1 sec^-1 (125-раз выше, чем на свободных barbed концах) в присутствии profilin. При высоких концентрациях profilin скорость элонгации ниже, благодаря конкуренции свободного profilin с profilin-actin за связывание FH1 сайтов. Механизмы, которые могут вносить вклад в эффекты profilin's, включают следующие: profilin-actin соединение с FH1 (по крайней мере для Cdc12p делящихся дрожжей), которое может увеличивать K_o/c (open/closed равновесие); привязывание profilin-actin к FH1, которое может увеличивать вероятность того, что actin будет ориентироваться преимущественно на связывание с barbed концом; и увеличение локальной коанцентрации profilin-actin на несколько порядков величин.

Возникающая в результате модель заключается в том, что хотя параметры определенных реакций (i.e. K_o/c и величины увеличения profilin) варьируют между formins, общий механизм законсервирован (Figure 2c). Многие детали ещё предстоит разработать. Напр., механизм, с помощью которого FH2 'гуляет' вдоль barbed конца неясен в деталях. Также спорна роль actin's ATФ в formin-обеспечиваемой элонгации. В одном исследовании profilin, как было показано, ингибирует элонгацию актиновых филамент, ассоциированных с мышиным mDia1 в присутствии неспособных к гидролизу Mg-AMP-PNP, указывая тем самым, что гидролиз АТФ необходим для processivity [8], тогда как в др. исследовании с 4 formins (включая мышиный mDia1) было найдено, что они остаются processively ассоциированными с удлиняющимися ADP-actin как в отсутствие, так и в присутствии profilin (Kovar et al., unpublished). Важно также охарактеризовать дополнительные формины внутри и между организмами, чтобы протестировать механистические различия. растительный форминовый FH2 домен полностью ингибирует элонгацию barbed конца, в то время как соотв. конструкция FH1FH2 позволяет элонгацию barbed конца даже в отсутствие profilin [29]. Кроме того, nucleating активность у почкующихся дрожжей Bni1, но не Bnr1, увеличивается за счет фактора клеточной полярности Bud6/Aip3 [30].

Regulation of formins

Почему большинство организмов обладают множественными (2 у почкующихся дрожжей; 6 у Drosophila; 15 млекопитающих) изоформ formin? Хотя возможно, что количественные различия в скорости элонгации актиновых филамент имеют физиологическое значение, но простейшей гипотезой является, что клетки нуждаются в форминах, который дифференциально регулируются. Напр., делящиеся дрожжи содержат 3 изоформы форминов, каждая из которых локализуется дифференциально и собирает актиновые филаменты , необходимые для самостоятельных клеточных процессов [13,15,31,32].Сходным образом две изоформы у почкующихся дрожжей Bni1 и Bnr1 (Figure 3a), также как у мышей и Dictyostelium formins mDia2 и dDia2 (Figure 3b), собирают актиновые филаменты, необходимые для уникальных актиновых структур [17,19,33-35].

FH1FH2 домены сборки актина фланкированы с каждой стороны регуляторными доменами (Figure 1a), которые менее законсервированы. Diaphanous-родственные formins регулируются с помощью ауто-ингибиции посредством взаимодействия между N и М концами (Figure 1a and c). Соединение Rho GTPase с N-терминальной областью активирует формины благодаря высвобождению FH1FH2-домен-содержащего С конца [36,37].

Интересна работа недавно пролла свет на структурные и биохимические детали механизма ауторегуляции мышиного formin mDia1 [38-40]. Diaphanous autoinhibitory domain (DAD) является участком из 20-30 аминокислот, обнаруживаемым С-терминальнее FH2 домена (Figure 1a), который соединяется с sub-µM сродством с diaphanous inhibitor domain (DID) [38], примерно в 250 остатков областью, расположенной вблизи N конца. DAD-DID взаимодействия достаточно для ауто-ингибирования. Две кристаллические структуры показали, что DID складывается в 5 повторов armadillo и что остатки, непосредственно следующие за DID доменом (dimerization domain или DD) формируют высоко стабильны гомодимер [39,40]. Rho GTPase активирует mDia1 путем соединения с низким µM сродством с областью, которая представляет как часть DID (которая перекрывается с DAD-DID взаимодействием) так и G домен (остатки выше DID, которые необходимы для связывания GTP-ase) [38-40]. Следовательно, хотя ассоциации Rho и DAD с регуляторной областью mDia1 взаимно исключающие, сайты их связывания только частично перекрываются, но они являются общей темой для аутоингибирующей регуляции Ras GTPase эффекторов [40]. Ко-кристалл RhoC в комплексе с G-DID-DD показал, что две молекулы RhoC ассоциируют с G-DID-DD гомодимером посредством Rho 'switch' областей [39].

Принимая во внимание, что полной длины formin возможно формирует стабильный димер, который спарен вблизи как N конца (DD) так и С конца (FH2) (Figure 1b), то детали регуляции mDia1 могут быть значительно сложнее, чем сегодня представляется (Figure 1c). Др. diaphanous-родственные формины, которые содержат DAD и DID последовательности и регулируются с помощью Rho GTPases [41], возможно обладают сходным с mDia1 механизмом. Однако, многие формины не содержат очевидных DAD и DID последовательностей [36 и 37], так что способ их регуляции определенно отличен.

Conclusions

Formins are remarkable machines that allow the rapid assembly of profilin–actin into long polarized unbranched actin filaments in a spatial and temporally regulated fashion. By employing a domain-by-domain approach, rapid progress has been made towards understanding the molecular mechanism(s) of formin regulation and formin-mediated actin assembly. We are now beginning to understand that although formins are variously regulated, their mechanism for actin assembly is conserved even though the rates of particular reactions are quantitatively different. However, we must test whether full-length formins retain the same molecular characteristics. Given their size (typically > 1000 residues) and low abundance this will not be a trivial endeavor.

Additionally, many fascinating questions remain. What are the structural arrangements of the ‘open’ and ‘closed’ states on the barbed end, and what are the bases for intrinsic differences between diverse FH2 domains? How does profilin increase the rate of elongation beyond the diffusion limit? Are differences between formins in their Ko/c (equilibrium between ‘open’ and ‘closed’ states) and in the extent to which profilin enhances their barbed end elongation physiologically relevant? Finally, given that many organisms contain multiple profilin isoforms, does the particular profilin isoform affect the rate of barbed end elongation?

Molecular details of formin-mediated actin assemblyDavid R Kovar Current Opinion in Cell Biology Volume 18, Issue 1 , February 2006, Pages 11-17 | doi:10.1016/j.ceb.2005.12.011 Article

Molecular details of formin-mediated actin assembly
David R Kovar
Current Opinion in Cell Biology Volume 18, Issue 1 , February 2006, Pages 11-17 | doi:10.1016/j.ceb.2005.12.011 Article