Runx3 controls growth and differentiation of gastric epithelial cells in mammals | |
 Рис.1. | (A–D) Detection of Runx3 mRNA by section in situ hybridization of the stomach  Рис.2. | Fig. 2. Structure and epithelial proliferation in wild-type (WT) and Runx3/ (–/–) mouse gastric mucosae.  Рис.3. | Runx3 controls gastric epithelial growth by regulating their sensitivity to the growth-inhibitory effect of TGF-β.  Рис.4. | Distribution of apoptotic cells  Рис.5. | Gastric epithelial cells from wild-type (WT; A,B,E,F) and Runx3 (C,D,G,H) fetal mice in primary culture  Рис.6. | Mouse gastric epithelial cell lines in vitro.  Рис.7. | Light micrographs of tumors formed by GIF-3 (A), GIF-11 (B,D–F), GIF-14 (C), and GIF-5 (G–I)  Рис.8. | Differentiation of a clonal cell line (K-3) established from GIF-5 ...  Рис.9. | Possible interaction between factors regulating growth and differentiation of gastric epithelial cells in mammals. The regional specificity of the endoderm seems to be determined by the level of expression of Cdx2 and the level of Wnt signaling in the tissues. Both Barx1 and Runx3 inhibit the Wnt signaling pathway to induce stomach type differentiation. Runx3 may also suppress the function of Cdx2 to inhibit expression of intestinal-type genes. It is also possible that Runx3 directly interact with GATA factors to induce gastric-type differentiation. Табл.1 Characteristics of tumors formed by clonal cell lines isolated from GIF-5 Runx3/p53/ cells |
ЖКТ млекопитающих может быть подразделен на три части согласно морфологии и функции эпителия: (1) пищевод и передняя часть желудка, покрытые многослойным слущивающимся эпителием; (2) железистая часть желудка с простым кубовидным эпителием, секретирующим соляную кислоту и пепсиногены; и (3) кишечник с простым цилиндрическим эпителием, абсорбирующим питательные вещества. Но механизм, с помощью которого эти органы со специализированным эпителиальными клетками формируются в соотв. позиции всё ещё до конца неизвестен.
Исследования эмбрионов кур показали. что энтодерма кишечника регионально специфицируется на очень ранних стадиях, даже до того, как он формирует трубку. Matsushita et al.,(2002) сообщили, что CdxA экспрессируется в презумптивном кишечнике, тогда как cSox2 в предшественниках желудка и пищевода у 1.5 дн. эмбрионов кур. Однако, региональная спецификация кишечной трубки всё ещё довольно лабильна и границы между регионами неопределенны. Фактически, эпителий способен отвечать дифференциально на разные мезенхимные ткани, которые окружают энтодерму. Когда кишечную мезенхиму кур рекомбинировали с эпителием желудка, то энтодерма становилась кишечного типа (Yasugi & Mizuno 1978; Ishizuya-Oka & Mizuni 1984). Сходным образом, когда мезодерма передней кишки рекомбинировалась с энтодермой средней кишки, то энтодерма ре-специфицировалась и принимала морфологию энтодермы передней кишки (Kedinger et al., 1986).
Не получено четких результатов для эмбрионов млекопитающих. Fukamachi et al., (1979) и Fukamachi и Takayama (1980) сообщили, что дифференцировка эпителия желудка и кишечника зависит от рекомбинации с мезенхимами, но что их онтогенетическая судьба не ре-специфицируется ими. В случае развития панкреатического зачатка панкреатическая мезенхима необходима для пролиферации и ветвления эпителия, но гетрологические мезенхимы, происходящие от др. ветвящихся органов, могут замещать панкреатическую мезенхиму (Wessels 1977; Ahlgren et al., 1997). Напротив, регион-специфический эффект мезенхимы был описан для морфогенеза эпителия трахей (Wessels 1970). Т.о., можно с уверенностью полагать, что энтодерма приобретает позиционные качественные особенности на очень ранних стадиях, а некоторые на более поздних стадиях благодаря взаимодействию с соседней мезодермальной тканью (Cleaver & Krieg 2001).
Транскрипционные факторы с доменом runt, наз. также polyomavirus enhancer binding protein 2/core binding factors (PEBP2/CBF), играют критическую роль в развитии млекопитающих (Ito 1999; 2004). Фактор состоит из α и β субъединиц, а субъединица α является гомологом продукта гена сегментации runt и lozenge дрозофилы с законсервированной областью, наз. Runt доменом, который необходим для димеризации с субъединицей β и для распознавания родственных ДНК-связывающих последовательностей. У млекопитающих известны 3 runt-родственных гена, Runx1/Aml, Runx2/Cbfa1 и Runx3/Pebp2αC, но имеется только один ген, кодирующий субъединицу β PEBP2β, у млекопитающих, хотя у дрозофилы имеются два гена для субъединиц β , brother и big brother. Runx белки, по-видимому, постоянно синтезируются и деградируют и они стабилизируются при гетеродимеризации с β субъединицей, которая метаболически стабильна (Huang et al., 2001).
Важность транскрипционных факторов с Runt доменом четко демонстрируется в исследованиях по нарушению генов. Мышиные эмбрионы, гомозиготные по мутации Runx1 обнаруживают нормальный морфогенез и происходящий из желточного мешка гематопоз, но они лишены плодного печеночного гематопоэза, что указывает на необходимость Runx1 для дефинитивного гематопоэза (Okuda et al., 1996; Wang et al., 1996). RUNX1 является наиболее частой мишенью хромосомных транслокаций при лейкемии и является ответственным за почти 30% случаев острой лейкемии у людей (Look 1997). RUNX2 существенен для остеогенеза (Komori et al., 1997; Otto et al., 1997)? а его гаплонедостаточность вызывает у людей болезнь костей cleidocranial dysplasia (Lee et al., 1997; Mundlos et al., 1997). Функция Runx3 изучена недостаточно. Taniuchi et al., (2002) сообщили, что Runx3 необходим для установления эпигенетического молчания в цитотоксических линиях лимфоцитов, а Inoue et al., (2002) показали, что Runx3 является критическим для регулирования аксональных проекций специфической субпопуляции нейронов корешков дорсальных ганглиев. Участие Runx3 в др. процессах, однако, не было изучено.
У Runx3-/- мышей эпителиальные клети желудка обнаруживают гиперплазию и супрессию апоптоза. Установлено, что Runx3-/- эпителиальные клетки желудка являются менее чувствительными к ингибированию роста и индуцирующей апоптоз активности TGF-β , указывая тем самым, что Runx3 играет важную роль по контролю дифференцировки эпителия желудка. Введенный под кожу мышам nude Runx-/- эпителий желудка формирует опухоли, в которых некоторые клетки дифференцируются в клетки кишечного типа. Клональный анализ показал, что эпителиальные клетки желудка трансдифференцируются в клетки кишечного типа в опухолях. Предполагается, что Runx3 участвует в контроле как роста, так и дифференцировки эпителиальных клеток желудка.
Gastric epithelial cells differentiate into intestinal-type cells in absence of Runx3
Чтобы подтвердить, что клетки кишечного типа дифференцируются из эпителиальных клеток желудка были получены линии клеточных клонов от GIF-5 Runx3-/-p53-/- эпителиальных клеток и проверялась их дифференцировка у мышей nude. Как показано в Табл.1 большинство линий клонированных клеток дифференцировалось в клетки желудочного типа с PAS-позитивной АВ-негативной слизью, но примерно 30% клеток обладали кишечным фенотипом, т.к. они продуцировали АВ-позитивную слизь у мышей nude. Дифференцировка goblet клеток со всеми ультраструктурными признаками, включая накопление слизистых гранул на верхушке и сдавленное ядро в основании клетки обнаружены примерно в 205 клеточных линий.
Гистологический анализ опухолей, формируемых у мышей nude, показал, что клетки кишечного типа впервые обнаруживаются спустя 6 недель после инъекции и наиболее впечатляюще на 8 неделе. Они располагаются в центре опухоли, клетки желудочного типа по периферии. Эти результаты демонстрируют, что кишечного типа клетки трансдифференцируются из Runx3-/- клеток желудочного эпителия. Заключение, что желудочного и кишечного типа клетки формируются из одних и тех же ародышевых клеток согласуется с идеей Tatematsu et al., (2003), и подтверждают, что дифференцировка Runx3-/- желудочных эпителиальных клеток хрупко контролируется и легко нарушается факторами внешней среды. Интересно, что критическая функция Runx белков в спецификации клонов и гомеостазе была обнаружена в развивающихся лимфоцитах (Taniuchi et al., 2002). Т.о., Runx белки могут играть существенную роль в спецификации клонов не только лимфоцитов, но и эпителиальных клеток ЖКТ.
Пока невозможно сделать вывод, что потеря Runx3 вызывает трансдифференцировку клеток эпителия желудка в клетки кишечного типа, т.к. контрольным экспериментом является показ отсутствия, что Runx3+/+ p53-/- клетки эпителия желудка никогда не дифференцируются в клетки кишечного типа. Очень трудно поддерживать не-туморогенные эпителиальные клетки желудка в течение более чем 6 недель in vivo или in vitro , т.к. они обычно полностью дифференцируются в течение недели (Ichinose et al., 1997) и большинство клеток прекращает пролиферировать спустя 2-3 недели.
Известно, что дифференцировка эпителиальных клеток желудка мыши очень стабильна и трудно индуцировать кишечную метаплазию в желудке мыши. Fukamachi et al., (1979) сообщили, что онтогенетическая судьбы желудочного эпителия не меняется гетерологическими мезенхимами у плодов мыши, а Yamamoto et al., (2002) показали, что кишечная метаплазия никогда не обнаруживается в обработанном канцерогенами желудке мыши даже если в них индуцируются опухоли желудка. Имеется множество линий эпителиальных клеток в желудке, но ни одна из них не дифференцируется в клетки кишечного типа. Затем маловероятно, что Runx3+/+ p53-/- эпителиальные клетки желудка дифференцируются в клетки кишечного типа в любых культуральных условиях, поэтому удивительно, что Runx3-/- p53-/- эпителиальные клетки желудка мышей дифференцируются в клетки кишечного типа, хотя для этого необходимы недели дифференцировки и многие факторы могут участвовать в этом процессе. Сегодня может с уверенностью утверждать, что потеря Runx3 может быть связана с трансдифференцировкой эпителиальных клеток желудка в клетки кишечного типа.
Вряд ли потеря р53 затрагивает дифференцировку эпителиальных клеток желудка (Donehowe et al., 1992) и не обнаруживаются кишечные метаплазии в желудке у р53-/- мышей, даже если предопухолевые изменения и аденомы индуцируются в желудке канцерогенами (Yamamoto et al., 2000).
Мы ранее установили, что экспрессия RUNX3 существенно редуцируется в кишечных метаплазиях по сравнению с нормальными эпителиальными клетками в слизистой желудка человека (Li et al., 2002). В соответствии с этим дифференцировка клеток кишечного типа обнаруживалась только в Runx3-/- эпителиальных клетках желудка мышей.
Possible role of Runx3 in the specification of gastric epithelial cells
Как специфицируется энтодерма кишки изучено недостаточно. Однако, считается, что кишечная энтодерма специфицируется регионально на очень ранних стадиях и что спецификация детерминируется взаимодействием с окружающей мезенхимной тканью. В соответствии с передне-задней осью тела паттерн экспрессии Нох генов, как полагают, специфицирует разные органы. Эксперименты по генному таргетингу показали. что когда функция определенных Нох генов теряется, то некоторые регионально-специфичные органы вдоль передне-задней оси не способны формироваться или оказываются ре-специфицированными как др. органы (Condie & Capecchi 1994; Greer et al 2000). В кишке, напротив, хотя многие Нох гены были knocked out, обнаружены немногие изменения в фенотипе кишки, возможно из-за перекрывания этих генов. Нулевые мутации ParaHox кластера генов давали фенотипы, более четко связанные с местами эмбриональной экспрессии, чем в случае с Нох генами. Chawengsaksophak et al. (1997) описали метаплазию у мышей, гетерозиготных по Cdx2. Они пришли к заключению, что Cdx2 направляет энтодермальную дифференцировку в направлении каудального фенотипа и что гаплонедостаточные уровни экспрессии в развивающемся дистальном кишечнике ведут к гомеозисной трансформации в более ростральный энтодермальный фенотип, такой как эпителий передней части желудка, который не экспрессирует Cdx2 во время нормального развития (Beck et al. 1999). Т.о. уровень экспрессии Cdx2, по-видимому, детерминирует региональную специфичность энтодермальной ткани.
Здесь были представлены доказательства, что потеря функции Runx3 индуцирует трансдифференцировку эпителиальных клеток желудка в клетки кишечного типа. Предполагается, что дифференцировка клеток желудочного эпителия становится менее стабильной во время размножения in vitro в отсутствие Runx3 и что некоторые клетки в центре опухоли отвечают на локальный(е) фактор(ы), чтобы экспрессировать Cdx2, который индуцирует дифференцировку клеток кишечного типа. В нормальной слизистой желудка экспрессия Cdx2 может прямо или косвенно супрессироваться с помощью Runx3. Остается определить, как Runx3 контролирует экспрессию Cdx2 в эпителиальных клетках желудка.
Недавно Kim et al., (2005) сообщили, что потеря законсервированного гомеобоксного гена Barx1, который специфически экспрессируется мезенхимой желудка во время органогенеза кишки, предупреждает дифференцировку эпителиальных клеток желудка и индуцирует в нем специфичные для кишечника гены. Они также показали. что ингибирование передачи сигналов Wnt с помощью Barx1 делает возможным развитие специфичного для желудка эпителия, указывая тем самым, что кишечная дифференцировка, индуцированная с помощью передачи сигналов Wnt, представляет собой самопроизвольное (default) состояние для энтодермы кишки. Okubo и Hogan (2004) также сообщили, что усиление передачи сигналов Wnt в развивающихся легких трансгенных мышей индуцирует дифференцировку кишечного типа. Т.о., кишечный эпителий может представлять собой общее default состояние для энтодермы передней кишки, нуждающееся в Wnt ингибировании, чтобы предотвратить бронхиальную или желудочную дифференцировку. Интересно отметить, что у эмбрионов амфибий белки Wnt играют основную роль в спецификации передне-задней оси, с наивысшим уровнем передачи сигналов Wnt в задней части и отсутствием в передней (Kiecker & Niehrs 2001). Следовательно, передне-задняя ось может детерминироваться с помощью градиента в передаче сигналов Wnt как в нервной, так и кишечной ткани.
Недавние сообщения, что пути передачи сигналов Wnt участвуют в спецификации клеток эпителия желудка предоставляют новую информацию о том, .как Runx3 контролирует дифференцировку эпителия желудка. Мы недавно получили доказательства, что Runx3 непосредственно соединяется с TCF, чтобы ингибировать передачу сигналов Wnt. Kim et al (2005) показали. что Barx1-зависимое ингибирование передачи сигналов Wnt делает возможным развитие специфического эпителия желудка. Barx1 экспрессируется в ткани желудка только на ранних плодных стадиях с пиком на 13.5 день беременности. Экспрессия Runx3, напротив, наблюдается с поздних плодных стадий и до взрослого периода. Учитывая. что Barx1 и Runx3 косвенно или прямо ингибируют путь передачи сигналов Wnt и что оба гена последовательно экспрессируются в желудке, то вполне возможно, что ингибирование путей передачи сигналов Wnt обеспечивается с помощью Barx1 на ранних плодных стадиях, а затем с помощью Runx3 на поздних плодных стадиях и далее. Получены противоречивые результаты по взаимодействию между Wnt и Cdx2. Blache et al., (2004) сообщили, что SOX9 регулируется с помощью пути Wnt и он репрессирует ген CDX2 в клетках кишечного эпителия, указывая тем самым, что CDX2 негативно регулируется с помощью пути Wnt. Напротив, Chawengsaksophak et al. (2004) подтвердили, что Cdx2 оперирует как передатчик сигналов Wnt, сравнивая Cdx2 нулевых эмбрионов с Wnt нулевыми эмбрионами. Эти противоречия частично могут возникать из-за того, что Cdx гены являются объектом ингибирования с помощью петли обратной связи и перекрестно-ингибирующей регуляции. Lorentz et al. (1997) продемонстрировали, что избыточная экспрессия Cdx2 подавляет и усиливает экспрессию генов Cdx1 и АРС, соотв. in vivo, а Guo et al. (2004) показали, что экспрессия Cdx1 и Cdx2 ингибирует транскрипционную активность β-catenin/TCF в клетках рака толстой кишки. Взаимодействие Runx3, Cdx2 и Wnt сигнального пути в клетках эпителия желудка является предметом интенсивных исследований.
Хорошо известно, что др. факторы также играют важные роли в спецификации энтодермальных тканей. Jacobsen et al. (2002) сообщили, что GATA-4 необходим для собственно дифференцировки эпителия желудка и вполне возможно, что Runx3 взаимодействует с GATA факторами, т.к. описано непосредственное взаимодействие между GATA фактором (Serpent) и RUNX фактором (Lozenge) у дрозофилы (Waltzer et al., 2003). Известно, что мезенхимный транскрипционный фактор Foxl1 (Fkh6) существенен для развития и дифференцировки клеток эпителия желудка (Kaestner et al., 1997; Fukamachi et al., 2001). Наконец, кишечная метаплазия в клетках эпителия желудка индуцируется у мышей с помощью делеции различных генов, включая Sonic hedgehog, neurogenin 3 и intestinal trefoil factor (Yuasa 2003). Т.о., Runx3 может регулировать дифференцировку эпителия желудка путем взаимодействия с этими генными продуктами.
|