Наиболее изученной функцией членов семейства белков hedgehog в нервной системе является их роль в качестве морфогенов. Каждый белок действует на определенном расстоянии от источника сигнала для детерминации клеточной идентичности в вентральном спинном мозге способом, зависимым от концентрации. Однако в последнее десятилетие стало ясно, что функции членов этого семейства белков в развитии более разнообразны и их специфическое действие меняется в зависимости от пространства и времени. Это оказалось верным и для молекулярных компонентов, модулирующих и трансдуцирующих сигналы hedgehog, а также специфицируют контролируемые ими клеточные процессы. Увеличение числа внутриклеточных и межклеточных модуляторов участвующих в передаче сигналов hedgehog, подробным образом обсуждалось в работах (1 и 2).
В данной работе авторы ограничились обсуждением роли сигналов hedgehog в нервной системе млекопитающих. Авторы впервые обсудили функции белков hedgehog в процессе приобретения клетками-предшественниками специфической клеточной идентичности. Особое внимание авторы обратили на то, каким образом члены GLI семейства транскрипционных факторов работают как эффекторы сигналов hedgehog в спинном мозге, позволяя внеклеточному градиенту концентрации hedgehog быть транслированными в различные клеточные типы. Обсуждается также вопрос о том, как интерация (повторение) этого молекулярного пути на более антериальных уровнях нервной системы ведет к индукции типов клеток свойственных коечному (telencephalon), промежуточному (diencephalon,) среднему (midbrain) и антериальному заднему мозгу (anterior hindbrain). Кроме такой их роли в паттернировании, авторы обсуждают этапы развития, которые опосредуют сигналы hedgehog, включая образование олигодендроцитов и их митогенную роль в контроле пролиферации нейральных предшественников. Обсуждается также роль сигналов hedgehog в аксональном pathfinding (нахождении правильного пути аксонов) и поддержании стволовых клеток у взрослого организма.
Молекулярный механизм передачи сигналов hedgehog
Молекулярный механизм, посредством которого принимаются, интерпретируются и трансформируются внеклеточные hedgehog сигналы для принятия решения о дальнейшей внутриклеточной судьбе, привлекают все большее внимание исследователей (3, 4). Работы, выполненные на позвоночных и беспозвоночных, обрисовали канонический путь передачи сигналов hedgehog, при котором поверхностно-клеточное связывание hedgehog лигандов ведет в конечном итоге к формированию репрессорных или активаторных форм членов семейства
GLI/CI транскрипционных факторов, содержащих «цинковые пальцы» (zincfinger) (
РИС. 1 ) (5). У позвоночных функции белка кодируемого ancestral invertebrate gene cubitus interruptus (
ci) поделены между тремя GLI белками (
GLI1, GLI2 и
GLI3) (6). Hedgehog сигналы у млекопитающих инициируются одним из трех гомологов hedgehog protein дрозофилы (7) - sonic hedgehog (
SHH), indian hedgehog (
IHH) и desert hedgehog (
DHH), из которых первые два вовлечены в невральное развитие (8,9).
Трансдукция сигналов hedgehog в клетках опосредуется взаимодействиями двух белков - twelve-pass membrane hedgehog receptor patched (
PTC1) (10,11) и seven-pass G-protein-coupled receptor smoothened (
SMO) (2,12). Генетические и биохимические данные указывают, что в отсутствии hedgehog лиганда белок PTC1 постоянно репрессирует SMO активность (120). Такая репрессия не является стехиометрической, указывая на то, что PTC1 действует через каталитический механизм (13). Детали такого взаимодействия неизвестны, хотя гомология PTC1 с бактериальными proton-driven трансмембранными транспортерами предполагает интригующую возможность того, что PTC1 регулирует распределение небольших молекул, которые изменяют активность SMO (14). Hedgehog лиганд, связывающийся с PTC1, облегчает такое ингибирование, однако этот механизм также пока плохо понят.
У
Drosophila путь от
SMO активации к процессингу, активации и транслокализации CI транскрипционного медиатора предполагает активность крупного белкового комплекса, включающего kinesin-like protein costal 2 (
COS2), serine/threonine protein kinase fused (
FU) и suppressor of fused (
SUFU) (1,15). Однако работы, проведенные на рыбах и мышах, показали, что эти компоненты могут не использоваться в опосредовании внутриклеточных сигналов hedgehog, даже между этими относительно близкими видами. Например, функции COS2 как негативного регулятора сигналов hedgehog в отсутствии лиганда hedgehog консервативны у рыб (16), но не у мышей (17, см. также обзор 1).
Кроме того, многочисленные ранее неизвестные внутриклеточные компоненты, модифицирующие сигналы hedgehog, были обнаружены во время генетического скрининга. У позвоночных мутации в трех отдельных intraflagellar транспортных белках – wimple (IFT172), flexo (hypomorphic allele of polaris, IFT88) и intraflagellar transport
motor protein KIF3a – приводят к сходным невральным фенотипам у мышей с признаками недостатка и избытка сигналов hedgehog (18, 19). Другая связь между нейральными сигналами hedgehog и внутриклеточным везикулярным транспортом обнаружилась благодаря
open-brain mouse mutant с loss-of-function
Rab23 аллеля, члена Rab семейства GTPases (20). Интересно то, что многие из белков, упомянутых выше, ассоциируются с цилиарной функцией, предполагающей роль этой структуры в передаче сигналов hedgehog (19, 21). Мутации, которые приводят к утрате ресничек (см
реснички), такие как ассоциированные с
oral-facial-digital syndrome 1 (
OFD1) loss-of-function и
Bardet-Biedl syndrome, имеют дефекты в паттернировании, напоминающие дефекты при сниженной передаче сигналов hedgehog (22). В соответствии с этой гипотезой, недавнее исследование показало, что SMO может локализоваться в ресничках в ответ на стимулирование hedgehog пути (23).
Более того, мутации аминокислотных остатков в SMO, предотвращающие такую локализацию, ведут к функционально неактивной форме SMO. В связи с тем, что три GLI белка и негативный регулятор SUFU локализуются не только в ядре, но и в дистальном участке реснички, вполне возможно, что реснички функционируют как локализованные медиаторы распространения сигналов hedgehog (24). Определенно, что присутствие первичных неподвижных ресничек в большинстве нейронов ЦНС свидетельствует о том, что сигналы hedgehog используют эту рудиментарую структуру (25).
Patterning the ventral spinal cord
Большинство накопленных к настоящему времени знаний о функциях сигналов hedgehog как морфогенов в нервной системе позвоночных исходит из анализа мышиного и куриного спинного мозга, где SHH экспрессируется наиболее вентральными клетками пластинки дна (РИС.2). В этих случаях SHH имеет все признаки морфогена – действует на расстоянии от источника способом зависимым от концентрации и непосредственно на реципиентную клетку без какого-либо передаточного механизма (9, 26, 29).
Первое исследование, подтверждающее роль SHH в качестве морфогена, исходит из анализа
in vitro культивирования определенных областей спинного мозга куриного эмбриона до образования дорсо-вентральных признаков. Когда такие эксплантанты были обработаны рекомбинантным SHH, то было обнаружено, что определенные признаки спинного мозга могут быть индуцированы в зависимости от концентрации SHH (27). Интересно то, что разных концентраций SHH было достаточно для индукции специфических популяций нейронов вентрального спинного мозга. Например, если низкие уровни SHH могли индуцировать промежуточные вентральные признаки, такие как V0, V1 и V2 интернейроны (РИС.2), то более высокие концентрации были необходимы для индукции двигательных нейронов, а еще более высокие концентрации были нужны для индукции наиболее вентральных типов нейронов – V3 интернейронов и пластинки дна.
Доказательства работы SHH in vivo в качестве морфогена во время развития нервной системы были получены в двух исследованиях, в которых применялись cell-autonomous методы, с помощью которых можно было компенсировать отсутствие реакции на SHH у мышей и цыплят (9,28). В этих экспериментах SHH чувствительность была устранена либо посредством экспрессии delta-loop делеции мутации PTC1, которая компенсирует клетки, экспрессирующие этот мутантный белок нечувствительный к эндогенному лиганду, либо посредством создания Smo-null химер, у которых присутствовали и SHH нереагирующие клетки, и клетки дикого типа в нервной трубке. При исследованиях delta-loop , кроме PTC1 cell-autonomous эффектов, ожидаемых в вентральных предшественниках с отсутствием SHH сигнализирования, было также отмечено non-cell-autonomous репаттернирование вокруг мутантной группы клеток Это явление, вероятно, обусловлено локальным сдвигом в градиенте SHH , т.к. он способен беспрепятственно путешествовать через клетки, экспрессирующие мутантный PTC1 рецептор.
SHH градиент в спинном мозге не является пассивным source–sink гадиентом, а сохраняется и поддерживается активными механизмами, регулирующими активность, высвобождение, транспорт и сохранение SHH белка через нейроэпителий (РИС.1). Эти модуляторы передачи сигналов SHH включают sightless/skinny hedgehog, acetyltransferase, которая модифицирует SHH при добавлении пальмитиновой кислоты к его amino
(N) terminus (30,31), а также такие белки как dispatched, You/Scube2 и tout-velu (мышиным гомологом этого гена является exostosin (EXT1)), контролирующие высвобождение и транспорт hedgehog белков у разных видов животных (32-35). Кроме того, и некоторые другие внеклеточные белки ограничивают продвижение SHH – это PTC1 hedgehog
interacting protein (HIP) (10,36) (см обзор – ссылка 2). Не так давно были обнаружены новый внеклеточный белок CDO (interference hedgehog (IHOG) у Drosophila) и родственный ему белок BOC, которые позитивно регулируют передачу сигналов hedgehog через связывание и сиквестр hedgehog лиганда, что приводит к локальному усилению передачи сигналов (37-39).
Фундаментальным вопросом процесса развития является вопрос о том как внеклеточный градиент концентрации морфогена транслируется во внутриклеточную спецификацию множества клеточных признаков (РИС.2). Сейчас известно, что все эффекты SHH в вентральном спинном мозге у млекопитающих опосредуются комбинированной активностью трех GLI транскрипционных факторов (40). В настоящее время проводятся изящные генетические исследования с частично избыточными и, главным образом, уникальными функциями каждого мышиного
Gli гена in vivo. Генетические loss-of-function и knock-in исследования, в которых
Gli гены были устранены (41-44) или генетически заменены (6, 45), показали, что, по крайней мере, в контексте спецификации вентральной нервной трубки GLI3 функционирует первоначально как транскрипционный репрессор, тогда как GLI1 и GLI2 функционируют как активаторы (6,41–47). Позитивная SHH передача сигналов индуцирует формирование GLI2 и (в меньшей степени) GLI3 активаторы, которые индуцируют транскрипцию конститутивного активатора GLI1. В отличие от этого, отсутствие лиганда допускает формирование GLI3 репрессора. Другие области нервной системы используют те же самые комбинации «активатор/репрессор» при трансформации SHH сигналов в клеточную реакцию. Изначально GLI2 активаторная функция существенна для индукции наиболее вентральных типов клеток, включая пластинку дна и V3 интернейроны (41, 43, 44), тогда как правильная регуляция уровней GLI3 репрессора контролирует число и локализацию V0, V1 и V2 предшественников (6,42). Между этими крайними положениями расположены двигательные нейроны, дифференцировка которых регулируется комбинацией GLI2 и GLI3. В отличие от позитивной активности SHH сигналов в пластинке дна и V3 интернейронах (6, 45), оказалось, что SHH первично функционирует как негативный регулятор в промежуточном паттернировании вентрального спинного мозга (42). Это, вероятно, осуществляется супрессией ориентиров, которые по иному направляют предшественники для принятия дорсальной судьбы, а не путем прямой спецификации вентральной судьбы (52).
«Даунстрим» GLI белков, передача сигналов hedgehog опосредует клеточную детерминацию посредством одновременной репрессии Class I гомеодоменных транскрипционных факторов (например,
Pax6, Pax7, Irx3 и
Dbx1/2) и индукции Class II гомеодоменных транскрипционных факторов (например,
Nkx2.2, Nkx6.1) в предшественниках вентрального спинного мозга (48-50). Cross-repressive взаимодействия между этими равноценными гомеодоменными транскрипционными факторами действуют так, чтобы очертить экспрессионные границы и впоследствии направить клетки по пути дифференцировки определенных подтипов (48). Механистическая связь между GLI транскрипционными активаторами и репрессорами и окончательный гомеодоменный паттерн еще не изучены. Кажется вероятным, что разная промоторная аффинность и специфические для определенных областей кофакторы способствуют трансляции overlying combinatorial GLI транскрипционных факторных градиентов в клеточных решениях.. Недавние исследования с применением метода электропорации у куриного эмбриона подтвердили, что GLI транскрипционные медиаторы могут быть совокупно интегрированы во времени чтобы достигнуть определенного паттернирования (51). Доказательства того, что позитивная передача сигналов SHH не требуется для образования некоторых вентральных типов клеток, исходят из исследований на компаундных мутантах
Shh или
Smo и
Gli3 (обзоры- 9,52), а также мышиных эмбрионов дефицитных по всем трем GLI белкам (6, 40). У этих мутантов сохранены некоторые признаки паттернирования вентрального спинного мозга, исключая пластинку дна, V3 интернейроны и некоторые популяции двигательных нейронов. Следовательно, GLI активаторы не нужны для индукции этих промежуточных типов вентральных клеток. В отношении потенциальных сигнальных путей, ответственных за индукцию типов клеток для которых не требуются SHH сигналы, предполагают, что в этом случае определенную роль в вентральном паттернировании нервной трубки играют сигналы fibroblast growth factor (FGF) retinoid сигналы. Оказалось, что сигналы FGF регулируют время спецификации вентральных клеточных типов. Исследования с помощью электропорации и работы с эксплантантами куриных эмбрионов подтвердили, что ретиноиды обеспечивают положительную регуляцию class I гомеодоменных белков, которые комплементируют действия SHH при репрессии дорсальных нейральных признаков и индукцируют class II генную экспрессию вентрально (53).
Все эти удивительные находки указывают, что hedgehog сигнализирование может не только контролировать детерминацию вентральных предшественников, но также может действовать для сохранения правильной стратификации этих доменов-предшественников в их нейрональном пуле. Генетическое удаление сигналов hedgehog ведет к дезорганизации пулов с обширным клеточным перемешиванием, разрушающим нормальную сегрегацию предшественников в дорсовентральном пространстве нервной трубки (6, 9, 40). Это подтверждает, что кроме роли в спецификации вентральных подтипов, сигналы hedgehog через GLI транскрипционные медиаторы контролируют разделение отдельных групп предшественников, возможно, путем модулирования клеточной аффинности. Однако в настоящее время имеются лишь доказательства, полученные при исследовании in vitro нейроэпителиальных культур, которые связывают SHH сигналы с известными адгезивными механизмами, ассоциированными с гетеро- и гомотопической клеточной сортировкой (54).
Cell specification throughout the neuraxis
Кроме спинного мозга, роль сигналов hedgehog в вентральном паттернировании была изучена в некоторых областях развивающейся центральной нервной системы у позвоночных – в переднем мозге, среднем мозге и мозжечке (РИС.3).
Forebrain. Развивающийся передний мозг, в сравнении с конечным и промежуточным мозгом, имеет много источников SHH сигналов, влияющих на паттернирование и спецификацию этой области. В эмбриональном конечном мозге SHH экспрессируется в пределах mantle (мантии) медиального ганглионарного бугорка (
medial ganglionic eminence - MGE), преоптической области и амигдале, в то время как экспрессия SHH в эмбриональном промежуточном мозге была обнаружена в гипоталамусе и в
zona limitans interthalamica (ZLI) – полоске клеток около границы между вентральным и дорсальным таламусом (thalami) (7, 55). Авторы особо отмечают, что началу экспрессии
Nkx2.1, раннего маркера спецификации вентрального переднего мозга, предшествует экспрессия SHH в переднем мозге, указывая на то, что вентральная спецификация этих структур является результатом не-нейрального источника SSH сигналов (56). Работы выполненные in vitro на курином эмбрионе и работы по удалению соответствующих генов у мышей подтверждают, что SHH источники из узелка (node) и прехордальной пластинки (prechordal plate), из которых развивается telencephalic primorium, паттернируют вентральный передний мозг (57, 58). Более того, оказалось, что к этому времени SHH экспрессируется в конечном мозге, начальное паттернирование этой структуры завершается и SHH сигналы требуются для поддержания экспрессии генов наиболее вентрального конечного мозга (59). Удаление SHH сигналов после начальной стадии паттернирования ведет к снижению экспрессии Nkx2.1 в предшественниках MGE и редукции двух главных популяций кортикальных интернейронов, происходящих из этой области (60). Повторное использование SHH сигналов, которые влияют на различные функции конечного мозга, дает возможность выявить значение компетенции нейральных предшественников, получающих и интегрирующих сигналы. В конечном мозге времен’ые изменения в компетенции клеток, отвечающих на сигналы SHH, являются правилом, а не исключением. Оказалось, что при паттернировании конечного мозга время воздействия SHH является критическим фактором в детерминации судьбы медиального, а не латерального ганглионарного бугорка (61). Точно также при спецификации олигодендроцитов и образовании популяции пролиферативной ниши взрослого организма, только специфическая группа клеток, отвечающая на SHH в дискретном окне времени, следует за этими программами созревания, что будет описано ниже.
Недавно показано, что белок
Megalin, который относится к lipoprotein receptor-related с низкой плотностью, специфически действует на вентральное паттернирование конечного мозга через SHH опосредующий механизм (62). Утрата
Megalin ведет к утрате вентрально образованных интернейронов и олигодендроцитов в переднем мозге мышей. Фенотип, наблюдаемый у этих мышей напоминает фенотип мутантов, у которых SHH сигналы в конечном мозге были устранены на 9 день эмбрионального развития (Е9) путем удаления
Smo используя Cre/LoxP систему, управляемую специфическим для конечного мозга геном
Foxg1 (обзор 57).
Группа исследователей, которая впервые идентифицировала Megalin, предположила, что его роль в передаче сигналов SHH может быть связана с функцией SHH co-receptor (63). Совсем недавно другие авторы предположили, что его эффекты являются непрямыми, и что Megalin усиливает передачу сигналов bone morphogenetic protein, которые затем ослабляют передачу сигналов SHH (62). Тем не менее, независимо от того является это результатом прямого или непрямого действия, эти находки показали, что передача сигналов SHH в конечном мозге является специфичной, по крайней мере, в отношении Megalin.
Другой отличительной характеристикой передачи сигналов SHH во время развития конечного мозга – это его роль в детерминации дорсальной кортикальной средней линии (dorsal cortical midline), которая позже дает начало гиппокампальному зачатку и midline choroid plexus epithelium (64,65). Такая активность заметно контрастирует с ролью SHH в спинном мозге, где мутации loss-of-function в hedgehog пути не оказывают никаких явных эффектов на паттернирование дорсальных доменов-предшественников (45). Механизм дорсального действия SHH в конечном мозге (кроме прямого или непрямого) через модулирование других ключевых центров передачи сигналов, в настоящее время понят плохо.
Другим интересным аспектом передачи сигналов hedgehog в конечном мозге, контрастирующим с его действием в спинном мозге, является явное отсутствие GLI активаторной функции в спецификации большинства предшественников конечного мозга.
Gli1–/–;Gli2–/– double-null мутантные мыши не имеют никаких грубых дефектов (41), а большинство дефектов паттернирования
Shh-null мышей может быть восстановлено удалением репрессорной формы GLI3 (65). Это указывает на то, что градиент репрессорной формы GLI3 изначально важен для спецификации клеток конечного мозга, тогда как спинной мозг использует полный комплект GLI активаторной и репрессорной форм для спецификации вентральных и промежуточных типов клеток. Возможно, это связано с тем, что конечный мозг появляется из крыловидной пластинки (alar plate), тогда как GLI активаторы обычно связаны со спецификацией предшественников базальной пластинки (basal plate). Тот факт, что дорс-вентральное паттернирование восстанавливается у
Shh–/–;Gli3–/– и
Smo–/–;Gli3–/– компаудных мутантов, говорит о том, что позитивные независимые от SHH регуляторы должны также регулировать паттернирование вентрального спинного мозга. Оказалось, что
Fgf8 и retinoids являются вероятными кандидатами для опосредования такого паттернирования (66, 67). Недавние исследования подтвердили, что FGF сигналы могут опосредовать вентральное паттернирование независимо от сигналов hedgehog в конечном мозге (68). Особенно отмечают, что в отличие от
Shh–/– мышей, у которых утрата вентрального паттернирования может быть реверсирована компаудным удалением of
Gli3 ( 65), никакого улучшения в паттерне вентрального конечного мозга не наблюдали у fibroblast growth factor receptor 1/3 conditional мутантов, когда Gli3 генная функция была также редуцирована (т.е.
Fgfr1–/–;Fgfr3–/–;Gli3+/–) (68). В других статьях показано, что SHH косвенно регулирует
Fgf8 транскрипцию посредством модуляции GLI3 репрессора. Это подтверждает, что FGF сигналы функционируют как позитивный регулятор паттернирования вентрального конечного мозга, тогда как SHH сигналы действуют негативно для того чтобы предотвратить дорсализацию вентрального домена конечного мозга.
SHH сигналы в вентральном промежуточном мозге долгое время ассоциировались с вентральным разделением зрительных полей, что наиболее демонстративно было показано при циклопии, наблюдаемой у мутантов с SHH loss-of-function (8, 69). Многочисленные исследования указывали на роль SHH в паттернировании многих областей зрительной системы, включая сетчатку, зрительные хиазмы и зрительные стебельки ( 70-72). В отношении дорсо-вентрального паттернироания в промежуточном мозге, сигналы SHH связывали с вентральной экспрессией PAX2, а также с вентральной репрессией PAX6 – главным регулятором развития глаза, который необходим для разделения билатерально позиционированных глазных полей (73). На то, что GLI активность является медиатором паттерирования этой области указывает частичное отсутствие промежуточного мозга, наблюдаемое у
Gli1–/–;Gli2–/– двойных мутантов (41).
В отношении более дорсальных областей промежуточного мозга недавние исследования
SHH в ZLI цыплят выявили новый механизм SHH индуцированной нейральной клеточной спецификации и роль сигналов SHH в паттернировании. Отмечается, что механизм действия сигналов SHH в ZLI сходен с действием hedgehog у Drosophila в anterior–posterior компартменте имагинального диска крыла. ZLI, экспрессирующийся SHH во всем дорсовентральном пространстве, отделяет передний prethalamus от posterior thalamus. Эти пограничные области промежуточного мозга паттернируются одними и теми же ZLI SHH источниками, однако они приобретают разную направленность генной экспрессии, указывая на то, что эти две области промежуточного мозга обладают разной компетентностью. Исследования методом
in ovo электропорации у куриных эмбрионов показали, что гомеобоксный ген IRX3, экспрессируемый posterior по отношению к ZLI, приводит к состоянию thalamic competence, так что misexpression
IRX3 в преталамическом компартменте дает возможность ZLI-derived SHH индуцировать экспрессию генов дорсального таламуса эктопически (74). Разные ответы этих двух соседствующих компартментов на идентичный SHH источник показывает важность регион-специфических факторов в образовании функционального разнообразия при воздействии одного белка, широко экспрессируемого по нейрооси.
Midbrain, hindbrain, cerebellum. Хотя роль истмической молекулы FGF8 в переднее-заднем паттернировании области среднего/заднего мозга была изучена достаточно подробно, роль SHH в дорсовентральном паттернировании этого региона и его функции в развитии мозжечка начали исследовать лишь недавно. Исследования SHH и GLI функций в среднем мозге и ромбомере 1 (rhombomere 1 - r1) (сегменте заднего мозга) обнаружили необходимость сигналов SHH и показали отличающуюся дифференциальную регуляцию GLI2/3 активаторов и GLI3 репрессора в паттернировании этой области. На основании gain-of-function исследований, выполненных главным образом на цыплятах, и анализ ранних эмбриональных (до Е11) дефектов у Shh-null мутантных мышей стало ясно что, как и в спинном мозге, действие SHH через GLI2 является необходимым условием для индукции особых вентральных типов клеток в среднем мозге и r1, и достаточным для индукции определенных типов клеток, по крайней мере, в сочетании с действием FGF сигналов FGF (43, 75-79).
В недавних исследованиях использовали conditional mutagenesis Smo и Gli2 для определения репертуара SHH на разных стадиях развития среднего/ заднего мозга (80). Действие SHH сигналов через GLI2 активатор оказалось необходимым до Е11 для того чтобы индуцировать многие, но не все типы клеток. GLI1 и GLI3, вероятно, также участвуют в индукции вентральных клеточных типов. В отличие от спинного мозга, где GLI3 играет незначительную роль в паттернировании промежуточных областей, в tectum (dorsal midbrain) и мозжечке (происходящем из дорсального r1) регуляция GLI3 репрессора посредством SHH сигналов оказалась критической и это требование должно выполняться и после стадии Е11. По крайней мере, часть функционирования SHH сигналов через GLI3 в этих областях поддерживается Fgf8 экспрессией, обеспечивая, следовательно, механизм, координирующий паттернироание по anterior–posterior оси.
В развивающемся мозжечке Shh начинает экспрессироваться в клетках Пуркинье примерно на cтадии E17 и передавать сигналы в наружный гранулярный слой и близлежащую Бергмановскую глию (81). Более того, SHH необходим и достаточен для индукции пролиферации гранулярных клеток (81-86), которая является главным образом постнатальным событием необходимым для образования листков мозжечка. Было обнаружено, что GLI2 является первичным GLI белком, необходимым для этого процесса, хотя GLI1, возможно, играет и резервную роль (81, 86). В одном из недавних исследований была сконструирована аллельная серия мутантов по
Gli2 и
Smo для выявления роли SHH в регуляции морфогенеза мозжечка посредством контроля роста слоя гранулярных клеток (86). Оказалось, что мутанты с редуцированной передачей сигналов, имели сниженную фолиацию (образование листков) с паттерном, который отражал нормальную последовательность образования листков. Мутанты с избытком SHH сигналов формируют лишнюю складку, положение которой сохраняется в нормальном мозжечке крыс. Результаты указывают на то, что SHH может действовать как пермиссивный (разрешающий) фактор во время образования листков мозжечка, индуцируя пролиферацию гранулярных клеток, тогда как детерминация паттерна листков может определяться разными путями.
Additional functions of hedgehog signaling
The generation of oligodendrocytes Hedgehog сигналы участвуют в спецификации и последующем развитии олигодендроцитов (РИС.4) - глиального компонента ЦНС, ответственного за миелинизацию аксонного тракта. Было отмечено, что происхождение наиболее ранних идентифицируемых клеток – oligodendrocyte precursor cell (OPC) связано с вентральной вентрикулярной зоной в спинном мозге и переднем мозге (87-89). Эктопическая экспрессия рекомбинантного SHH белка в курином дорсальном спинном мозге индуцирует формирование эктопических OPCs (87, 89). Кроме того, используя function-blocking антитела, было выявлено «окно» развития, во время которого SHH требуется для спецификации OPC (87). Была обнаружена возможная молекулярная связь между SHH сигналами и спецификацией OPC при клонировании basic helix-loop-helix (bHLH) транскрипционных факторов
Olig1 и
Olig2 (90,91). Эти два гена были не только индуцированы SHH, но и были тесно связаны с развитием олигодендроцитов у мутантов с gain-of-function, способствуя формированию OPC (121). У
Olig1;Olig2 двойных нокаутных мышей олигодендроциты отсутствовали на Е18.5, указывая на то, что эти два SHH-индуцированных гена необходимы и достаточны для образования олигодендроцитов (92,93).
Исследования телэнцефалической регуляции олигодендроцитов добавило некоторые детали в картину действия сигналов при OPC спецификации. Мыши Nkx2.1-null, у которых отсутствовала Shh экспрессия в конечном мозге, характеризовались полной утратой ранних маркеров олигодендроцитов, за исключением амигдалы, которая продолжала экспрессировать
Shh у мутантного бэкграунда (55, 94). Эксперименты с gain-of-function с использованием Shh-экспрессируемым ретровирусом на стадии Е9.5, дали начало зрелым олигодендроцитам на 21 постнатальный день развития (Р21) (55). Сходные эксперименты, выполненные с
Nkx2.1 nulls мышами показали возможность восстановления ранних OPC маркеров, свидетельствуя о том, что
Shh конечного мозга важен для развития олигодендроцитов. Эти находки также указывают на то, что сигналы hedgehog могут работать независимо от
Nkx2.1 при спецификации олигодендроцитов, действуя, возможно, через продолжительную апрегуляцию
Olig генов.
Как и в спинном мозге, где вентральная нейрональная паттернирующая активность SHH требует присутствия дополнительных индуктивных ориентиров, FGF может оказывать положительный эффект в индукции OPCs. Два независимых исследования in vitro подтвердили роль SHH и FGF в индукции олигодендроцитов. Было показано, что SHH и FGF могут индуцировать олигодендроциты в культуре неокортекса (95). Блокирование путей hedgehog и FGF при использовании cyclopamine и PD173074 соответственно показало, что FGF путь, ведущий к образованию OPC, является hedgehog-независимым, а hedgehog путь требует базального уровня активации FGF пути. Таким же образом нейрокортикальные культуры нейросфер от Е13.5 предшественников, которые не дают начало OPCs in vivo, могут приводить к образованию этих клеток в присутствии FGF-содержащей среды (96). По крайней мере, частично этот эффект может быть результатом FGF-опосредованной апрегуляции эндогенных
Shh транскриптов в культуре нейросфер.
Control of embryonic proliferation. Исследования по сверхэкспрессии продемонстрировали способность SHH содействовать пролиферации в нервных и других тканях (97-99). Оказалось, что способность нейробластов к пролиферации в ответ на сигналы hedgehog регулируется в пространстве и времени. Transgenic-mediated эктопическая экспрессия SHH у мышей в дорсальной нервной трубке в раннем эмбриональном развитии вела к нейральной гиперплазии на Е12.5, но не была способна усиливать пролиферацию выше уровня мышей дикого типа на стадии Е18.5 (99). Сравнение соответствующих Smo мутантов с
Shh null мутантами по среднему/заднему мозгу показало, что SHH требуется в основном для пролиферации только до стадии Е9 (80). Оказалось, что реакция нейральных клеток на SHH имеет отношение к их митотическому состоянию. Воздействие hedgehog сигналов во время пика нейрогенеза у мышей усиливало далее пролиферацию предшественников, тогда как воздействие в постнейрогенезе сохраняло клетки в недифференцированном состоянии (99). Во время пренатального периода hedgehog сигналы еще могут стимулировать пролиферацию в гранулярных клетках мозжечка, ганглионарных клетках сетчатки и пролиферацию в нервной трубке. То, что эти SHH сигналы играют биологическую роль в регуляции пролиферации, подтверждается их вовлечением в такое заболевание человека как
синдром Горлина (Gorlin’s syndrome) при котором мутации в
Ptc1 ведут к неконтролируемой активности действия сигналов и предрасположенности к медуллобластоме (medulloblastomas) (10). Начаты исследования для объяснения того, каким образом hedgehog сигналы влияют на молекулярный механизм, контролирующий пролиферацию. В нескольких работах сообщалось как специфические даунстрим эффекторы модулируются SHH сигналами для регулирования клеточного цикла. В этом отношении в работу мозжечка мышей вовлечены
N-myc100, cyclin D1 (101),
E2f1 и
E2f2 (102) как возможные связующие звенья между действием SHH сигналов и регуляторами клеточного цикла. В работе с
N-myc и индукции medulloblastoma детально показан молекулярный синергизм между SHH и insulin-like growth factor (IGF) сигнальными путями, когда SHH действует индуцируя
N-myc транскрипцию через GLI белки, а phosphatidylinositol-3-kinase (PI3-K) стабилизирует
N-myс белковый продукт (103. 104).
Оказалось также, что кроме своей роли в пролиферации и дифференцировке, сигналы SHH контролируют клеточную гибель. Данные, полученные на спинном мозге, переднем мозге и среднем/заднем мозге говорят о том, что апоптоз вызванный удалением функции гена
Shh, может быть супрессирован удалением
Gli3, указывая на то, что этот репрессорный фрагмент может работать как индуктор апоптоза (52, 80). Недавно предположили, что Ptc играет роль в опосредовании клеточной гибели через SMO-независимый механизм (105).
Shh and axon guidance. Экспрессия
Shh, локализованная вентрально и охватывающая все переднее-заднее пространство нервной трубки, может свидетельствовать о том, что
Shh может опосредовать нахождение пути аксонами во время развития (РИС.4). Ранняя связь между передачей сигналов hedgehog и пересечением вентральной средней линии отмечалась для аксонов ганглионарных клеток сетчатки, которые в норме формируют зрительные хиазмы, когда пересекают среднюю линию промежуточного мозга (обзор 106). Мутации в SHH даутстрим пути нарушают нормальный перекрест зрительных хиазм. В настоящее время, однако, неясно является ли это прямым эффектом SHH (107) или результатом нарушения паттернирования вентральной срединной линии, что характерно для многих из этих мутантов. Доказательства, поддерживающие последнюю из этих гипотез, были получены в работе с полосатым данио (zebrafish), у которых Shh действует непосредственно через cd. Способность ограничивать экспрессию разных хемореппелентных Slit белков, которые препятствуют перекресту некоторых комиссуральных популяций (108). Более того, фенотип комиссурального пересечения, возникающий из-за редуцирования действия сигналов hedgehog обусловлнным утратой
yot (zebrafish homologue of
Gli2), м.б. восстановлен ослаблением экспрессии
slit с помощью morpholinos в глиальных клетках средней линии в вентральном переднем мозге (109).
В настоящее время наиболее убедительные доказательства роли SHH как хемоаттрактантов получены из результатов идентификации его функции в качестве гида floorplate-derived midline комиссуральных аксонов, работающего в соединении с сигналами netrin (110). Селективная инактивация
Smo в комиссуральных нейронах или инактивация после воздействия cyclopamine на культуру эксплантата, четко продемонстрировали, что такой эффект (в качестве гида) опосредуется
Smo-зависимым механизмом. Однако еще неясно, требуется ли для этого участие GLI белков или этот эффект опосредуется через механизм, независимый от транскрипции. Возможность фокального источника SHH переориентировать ростовой конус спинальных аксонов Xenopus in vitro уже через час, противоречит гипотезе о роли транскрипции.
В одной из последних работ показано, что немедленно после того как комиссуральные аксоны пройдут пластинку дна, SHH начинает управлять направлением движения этих аксонов антариально вдоль продольной оси (111). В этой работе впервые было показано действие SHH как хемореппелентов. Авторы предположили, что хемореппелентная активность SHH не опосредуется PTC или SMO. Они считают, что этот механизм зависит от неканонического сигнализирования, опосредованного HIP, т.к. удаление HIP РНК интерференцией при chick ‘open-book’ explant assay препятствует антериальному направлению комиссуральных аксонов. Вероятно, в скором времени появятся и другие примеры, доказывающие роль SHH в управлении направления роста аксонов.
Без ответа пока остается вопрос о том, как сигнал hedgehog ремоделирует цитоскелетную организацию ростового конуса в таком управлении (guidance). В этом отношении было бы интересно определить, является ли действие SHH как хемоаттрактанта (против хемореппелента) модуляцией только механизма трансдукции или здесь функционируют разные пути. Тот факт, что в популяции комиссуральных проекционных нейронов хемоаатракция нуждается в
SMO, а «хеморепелленция» нуждается в
HIP, поддерживает последнюю гипотезу.
SHH and adult neural stem cells. Несмотря на то, что связь между сигналами hedgehog и эмбриональной пролиферацией изучена достаточно подробно, в одной из последних работ была выявлена роль hedgehog сиганлов в регуляции пролиферации клеток-предшественников в мозге взрослого организма (РИС.4). Передний мозг млекопитающих относится к замечательным системам для анализа стволовых нервных клеток взрослого организма, поскольку имеет две локализованные области постнатального нейрогенеза – зубчатую фасцию (dentate gyrus) гиппокампа и субвентрикулярную зону (subventricular zone – SVZ) боковых желудочков. Если предшественники гиппокампа локально заселяют гиппокамп, предшественники SVZ мигрируют вдоль рострального миграционного пути для того, чтобы попасть в обонятельные луковицы. Работы на мышах показали, что такая SVZ ниша состоит из «молчащих» (с медленным циклом) предшественников, transit-amplifying клеток и мигрирующих нейробластов. Используя AraC anti-mitotic воздействие для удаления быстро делящихся клеток в линии предшественников и нейробластов, авторы показали, что астроцито-подобные клетки могут делиться для пополнения этих двух популяций. А это свидетельствует о том, что медленно делящаяся глиальная популяция служит в качестве стволовых клеток SVZ (112).
Доказательства in vivo, указывающие на важность сигналов hedgeho в этих двух постнатально пролиферирующих нишах, получены из исследований по генетической loss-of-function, вирусной gain-of-function и кртированию генетической судьбы клеток. Удаление
Smo в мозге устранило (circumvents) дефекты раннего эмбрионального паттернирования, наблюдаемого у
Shh null и позволило провести исследование эффектов SHH сигналов в субгранулярной зоне (subgranular zone-SGZ) зубчатой фасции в SVZ пролиферативной области (59). Обе области показали значительное снижение числа пролиферирующих предшественников на 2-3 неделе после рождения этих мутантов, а в SVZ обнаружена также повышенная клеточная гибель. В результате таких пертурбаций постнатальных пролиферативных ниш, популяции гранулярных клеток гиппокампа и обонятельных луковиц были сильно истощены. Похожее снижение пролиферации наблюдали в SVZ у неполовозрелых мышей, получавший недельный курс ингибитора SHH сигналов cyclopamin, а также в гиппокампе мышей, которым этот же ингибитор инъецировали непосредственно в те же самые области (113. 114).
В серии экспериментов с интересными клиническими последствиями, искусственное стимулирование сигналов hedgehog в переднем мозге грызунов вело к увеличению пролиферации предшественников нейронов и в SVZ, и в зубчатой фасции гиппокампа. Активирование сигналов hedgehog было достигнуто или через аденовирусную доставку N-терминального активного фрагмента SHH (113), либо через использование небольшой молекулы агониста hedgehog, которая апрегулировала сигнализирование в hedgehog чувствительных тканях через взаимодействие со Smo (59). Это подтверждает, что усиление hedgehog сигналов может быт эффективным средством, способствующим нейральной репарации.
И хотя ясно, что hedgehog сигналы играют важную роль в поддержании пролиферации нейральных предшественников во взрослом мозге, детали даунстрима пока не изучены. Genetic inducible fate mapping (GIFM) исследования у мышей (115) способствуют пониманию истории развития и спецификации SHH передачи сигналов в этих пролиферирующих нишах (116). Используя
Gli1 в качестве маркера клеток чувствительных к hedgehog было окончательно установлено, что покоящиеся и transit-amplifying stem cells во взрослом SVZ и SGZ в норме получают GLI активаторные сигналы. Более того, покоящиеся клетки, экспрессирующие GLI1, продолжают давать начало нейронам, заселяющим обонятельные луковицы и гиппокамп в течение года и являются мультипотентными. Кроме того, оказалось, что SVZ и SGZ ниши формируются последовательно в эмбриональном развитии переднего мозга. Что же касается клеточных медиаторов этого процесса, то было установлено, что перивентрикулярные астроциты – охарактеризованная SVZ популяция стволовых клеток – экспрессируют не только
Gli1, но также и другие компоненты hedgehog сигнального каскада (114). Анализ in vitro разобщенных слоев у
Gli2 и
Gli3 мутантов показал, что эти гены могут частично опосредовать роль hedgehog предшественников во взрослом мозге (117). Однако в будущем в экспериментах in vivo необходимо будет точно оценить функции этих генов. Было бы интересно установить и источники сигналов hedgehog, действующих в двух пролиферирующих нишах, а также «инструктивные» события в приобретающих такие инструкции клетках, которые управляются этими сигналами. Наконец, установив дихотомию между пролиферативным ответом на SHH и ее роль в поддержании ниш стволовых клеток взрослого организма, было бы интересно выявить, является ли такой дифференцированный ответ отражением разных механизмов действия SHH или разных функциональных эффектов в обособленных линиях в пределах ниши стволовых клеток.
Concluding remarks
Передача сигналов hedgehog в нервной системе млекопитающих изучается уже больше десяти лет. За это время наши механистические представления о внешних и внутренних регуляторах механизма передачи сигналов hedgehog значительно продвинулись вперед. Точно также мы продвинулись в понимании роли сигналов hedgehog во время развития – в детерминации дорсальной судьбы, регуляции олигодендрогенеза, поддержании стволовых клеток и в нахождении аксонами своего правильного пути, не считая его роли в вентральном паттернировании. Авторы предполагают, что наиболее интересные результаты будут получены в трех областях, касающихся роли hedgehog. Это: 1) дальнейшее понимание того, как уровни и продолжительность действия сигналов hedgehog модулируются клетками-реципиентами; 2) каким образом hedgehog сигналы взаимодействуют с другими сиганльными путями; и 3) как hedgehog сигналы влияют на функции мозга у взрослых животных. Установив роль этого белка как морфогена и митогена, становится неудивительным тот факт, что этот путь регулируется тонкими механизмами. Тот факт, что такая регуляция у позвоночных тесно связана с белками, контролирующими транспорт в ресничках, не был неожиданностью. Самой интересной загадкой оказался вопрос о том, что рудиментарные реснички, обнаруженные в клетках многих типов, необходимы для передачи сигналов hedgehog. Учитывая многофункциональное использование hedgehog сигнального пути, кажется вполне вероятным, что он должен взаимодействовать с другими путями. Например, уже имеются доказательства взаимодействия между hedgehog и Notch сигнальными путями в развивающемся мозжечке (118).
В нескольких исследованиях сообщалось, что экспрессия лигандов hedgehog , особенно SHH, не ограничивается процессом развития. Паттерны экспрессии hedgehog лиганда у взрослого организма весьма интригующие и могут способствовать пониманию роли этого сигнального пути у зрелых животных. Совсем недавно было показано, что у Drosophila hedgehog играет определенную роль в половом диморфизме, подтверждая тем самым, что мозг самцов и самок может отличаться по использованию сигналов hedgehog (119). В каком бы направлении ни шли исследования по hedgehog, они, несомненно, преподнесут еще много сюрпризов.
Fishell Lab
Developmental program of New York University
ЛИТЕРАТУРА
1. Huangfu, D. & Anderson, K. V. Signaling from Smo to Ci/Gli: conservation and divergence of Hedgehog pathways from Drosophila to vertebrates. Development 133, 3–14 (2006).
2. Ingham, P. W. & McMahon, A. P. Hedgehog signaling in animal development: paradigms and principles. Genes Dev. 15, 3059–3087 (2001).
3. Jessell, T. M. Neuronal specification in the spinal cord: inductive signals and transcriptional codes. Nature Rev. Genet. 1, 20–29 (2000).
4. Ashe, H. L. & Briscoe, J. The interpretation of morphogen gradients. Development 133, 385–394 (2006).
5. Aza-Blanc, P., Ramirez-Weber, F. A., Laget, M. P., Schwartz, C. & Kornberg, T. B. Proteolysis that is inhibited by hedgehog targets Cubitus interruptus protein to the nucleus and converts it to a repressor. Cell 89, 1043–1053 (1997). The first paper to recognize that hedgehog
signalling is mediated by preventing the constitutive cleavage of CI, the Drosophila homologue of the mammalian GLI proteins.
6. Bai, C. B., Stephen, D. & Joyner, A. L. All mouse ventral spinal cord patterning by hedgehog is Gli dependent and involves an activator function of Gli3. Dev. Cell 6, 103–115 (2004).
7. Echelard, Y. et al. Sonic hedgehog, a member of a family of putative signaling molecules, is implicated in the regulation of CNS polarity. Cell 75, 1417–1430 (1993).
8. Chiang, C. et al. Cyclopia and defective axial patterning in mice lacking Sonic hedgehog gene
function. Nature 383, 407–413 (1996). Reports the phenotype of the Shh–/– loss-offunction
mutant and directly validates the requirement for SHH in ventral patterning of the nervous system.
9. Wijgerde, M., McMahon, J. A., Rule, M. & McMahon, A. P. A direct requirement for
Hedgehog signaling for normal specification of all ventral progenitor domains in the presumptive mammalian spinal cord. Genes Dev. 16, 2849–2864 (2002).
10. Goodrich, L. V., Milenkovic, L., Higgins, K. M. & Scott, M. P. Altered neural cell fates and
medulloblastoma in mouse patched mutants. Science 277, 1109–1113 (1997).
11. Marigo, V., Davey, R. A., Zuo, Y., Cunningham, J. M. & Tabin, C. J. Biochemical evidence that patched is the Hedgehog receptor. Nature 384, 176–179 (1996).
12. Stone, D. M. et al. The tumour-suppressor gene patched encodes a candidate receptor for Sonic hedgehog. Nature 384, 129–134 (1996).
13. Taipale, J., Cooper, M. K., Maiti, T. & Beachy, P. A. Patched acts catalytically to suppress the activity of Smoothened. Nature 418, 892–897 (2002).
14. Chen, J. K., Taipale, J., Young, K. E., Maiti, T. & Beachy, P. A. Small molecule modulation of Smoothened activity. Proc. Natl Acad. Sci. USA 99, 14071–14076 (2002).
15. Lum, L. & Beachy, P. A. The Hedgehog response network: sensors, switches, and routers. Science 304, 1755–1759 (2004).
16. Varjosalo, M., Li, S. P. & Taipale, J. Divergence of hedgehog signal transduction mechanism between Drosophila and mammals. Dev. Cell 10, 177–186 (2006).
17. Tay, S. Y., Ingham, P. W. & Roy, S. A homologue of the Drosophila kinesin-like protein Costal2 regulates Hedgehog signal transduction in the vertebrate embryo. Development 132, 625–634 (2005).
18. Huangfu, D. et al. Hedgehog signalling in the mouse requires intraflagellar transport proteins. Nature 426, 83–87 (2003).
19. Huangfu, D. & Anderson, K. V. Cilia and Hedgehog responsiveness in the mouse. Proc. Natl Acad. Sci. USA 102, 11325–11330 (2005).
20. Eggenschwiler, J. T., Espinoza, E. & Anderson, K. V. Rab23 is an essential negative regulator of the mouse Sonic hedgehog signalling pathway. Nature 412, 194–198 (2001).
21. Liu, A., Wang, B. & Niswander, L. A. Mouse intraflagellar transport proteins regulate both the activator and repressor functions of Gli transcription factors. Development 132, 3103–3111 (2005).
22. Ferrante, M. I. et al. Oral-facial-digital type I protein is required for primary cilia formation and left–right axis specification. Nature Genet. 38, 112–117 (2006).
23. Corbit, K. C. et al. Vertebrate Smoothened functions at the primary cilium. Nature 437, 1018–1021 (2005). Complements a number of recent findings (references 20 and 21) showing that genes associated with cilia function are required for hedgehog signalling by providing the first direct evidence that components in the canonical hedgehog pathway are sequestered to cilia in a manner correlated with active hedgehog signalling.
24. Haycraft, C. J. et al. Gli2 and Gli3 localize to cilia and require the intraflagellar transport protein polaris for processing and function. PLoS Genet. 1, e53 (2005).
25. Whitfield, J. F. The neuronal primary cilium — an extrasynaptic signaling device. Cell. Signal. 16, 763–767 (2004).
26. Roelink, H. et al. Floor plate and motor neuron induction by vhh-1, a vertebrate homolog of hedgehog expressed by the notochord. Cell 76, 761–775 (1994).
The first study to provide compelling evidence that SHH could induce different neuronal cell types based on concentration alone, strongly supporting the idea that SHH acted as a morphogen in the patterning of the ventral nervous system.
27. Roelink, H. et al. Floor plate and motor neuron induction by different concentrations of the aminoterminal cleavage product of sonic hedgehog autoproteolysis. Cell 81, 445–455 (1995).
28. Briscoe, J., Chen, Y., Jessell, T. M. & Struhl, G. A hedgehog-insensitive form of patched provides evidence for direct long-range morphogen activity of sonic hedgehog in the neural tube. Mol. Cell 7, 1279–1291 (2001).
29. Hynes, M. et al. The seven-transmembrane receptor smoothened cell-autonomously induces multiple ventral cell types. Nature Neurosci. 3, 41–46 (2000).
30. Chamoun, Z. et al. Skinny hedgehog, an acyltransferase required for palmitoylation and activity of the hedgehog signal. Science 293, 2080–2084 (2001).
31. Lee, J. D. et al. An acylatable residue of Hedgehog is differentially required in Drosophila and mouse limb development. Dev. Biol. 233, 122–136 (2001).
32. Ma, Y. et al. Hedgehog-mediated patterning of the mammalian embryo requires transporter-like function of dispatched. Cell 111, 63–75 (2002).
33. Bellaiche, Y., The, I. & Perrimon, N. Tout-velu is a Drosophila homologue of the putative tumour suppressor EXT-1 and is needed for Hh diffusion. Nature 394, 85–88 (1998).
34. Kawakami, A. et al. The zebrafish-secreted matrix protein you/scube2 is implicated in long-range regulation of hedgehog signaling. Curr. Biol. 15, 480–488 (2005).
35. Woods, I. G. & Talbot, W. S. The you gene encodes an EGF-CUB protein essential for Hedgehog signaling in zebrafish. PLoS Biol. 3, e66 (2005).
36. Chuang, P. T. & McMahon, A. P. Vertebrate Hedgehog signalling modulated by induction of a Hedgehogbinding protein. Nature 397, 617–621 (1999).
37. Tenzen, T. et al. The cell surface membrane proteins Cdo and Boc are components and targets of the Hedgehog signaling pathway and feedback network in mice. Dev. Cell 10, 647–656 (2006).
38. Yao, S., Lum, L. & Beachy, P. The ihog cell-surface proteins bind Hedgehog and mediate pathway activation. Cell 125, 343–357 (2006).
39. Zhang, W., Kang, J. S., Cole, F., Yi, M. J. & Krauss, R. S. Cdo functions at multiple points in the Sonic Hedgehog pathway, and Cdo-deficient mice accurately model human holoprosencephaly. Dev. Cell 10, 657–665 (2006).
40. Lei, Q., Zelman, A. K., Kuang, E., Li, S. & Matise, M. P. Transduction of graded Hedgehog signaling by a combination of Gli2 and Gli3 activator functions in the developing spinal cord. Development 131, 3593–3604 (2004).
41. Park, H. L. et al. Mouse Gli1 mutants are viable but have defects in SHH signaling in combination with a Gli2 mutation. Development 127, 1593–1605 (2000).
42. Persson, M. et al. Dorsal–ventral patterning of the spinal cord requires Gli3 transcriptional repressor activity. Genes Dev. 16, 2865–2878 (2002).
43. Matise, M. P., Epstein, D. J., Park, H. L., Platt, K. A. & Joyner, A. L. Gli2 is required for induction of floor plate and adjacent cells, but not most ventral neurons in the mouse central nervous system. Development 125, 2759–2770 (1998)
44. Ding, Q. et al. Diminished Sonic hedgehog signaling and lack of floor plate differentiation in Gli2 mutant mice. Development 125, 2533–2543 (1998).
45. Bai, C. B. & Joyner, A. L. Gli1 can rescue the in vivo function of Gli2. Development 128, 5161–5172 (2001).
46. Bai, C. B., Auerbach, W., Lee, J. S., Stephen, D. & Joyner, A. L. Gli2, but not Gli1, is required for initial Shh signaling and ectopic activation of the Shh pathway. Development 129, 4753–4761 (2002).
47. Pan, Y., Bai, C. B., Joyner, A. L. & Wang, B. Sonic hedgehog signaling regulates Gli2 transcriptional activity by suppressing its processing and degradation. Mol. Cell Biol. 26, 3365–3377 (2006).
48. Briscoe, J., Pierani, A., Jessell, T. M. & Ericson, J. A homeodomain protein code specifies progenitor cell identity and neuronal fate in the ventral neural tube. Cell 101, 435–445 (2000).
49. Briscoe, J. et al. Homeobox gene Nkx2.2 and specification of neuronal identity by graded Sonic hedgehog signalling. Nature 398, 622–627 (1999).
50. Ericson, J. et al. Pax6 controls progenitor cell identity and neuronal fate in response to graded Shh signaling. Cell 90, 169–180 (1997).
51. Stamataki, D., Ulloa, F., Tsoni, S. V., Mynett, A. & Briscoe, J. A gradient of Gli activity mediates graded Sonic Hedgehog signaling in the neural tube. Genes Dev. 19, 626–641 (2005).
52. Litingtung, Y. & Chiang, C. Specification of ventral neuron types is mediated by an antagonistic interaction between Shh and Gli3. Nature Neurosci. 3, 979–985 (2000).
Revealed that, rather than being simply an instructive factor, much of SHH’s role in establishing ventral pattern in the spinal cord is conducted using its ability to prevent dorsalization of the spinal cord through the removal the GLI repressor GLI3.
53. Novitch, B. G., Wichterle, H., Jessell, T. M. & Sockanathan, S. A requirement for retinoic acidmediated transcriptional activation in ventral neural patterning and motor neuron specification. Neuron 40, 81–95 (2003).
54. Jarov, A. et al. A dual role for Sonic hedgehog in regulating adhesion and differentiation of
neuroepithelial cells. Dev. Biol. 261, 520–536 (2003)
55. Nery, S., Wichterle, H. & Fishell, G. Sonic hedgehog contributes to oligodendrocyte specification in the mammalian forebrain. Development 128, 527–540 (2001).
56. Shimamura, K., Hartigan, D. J., Martinez, S., Puelles, L. & Rubenstein, J. L. Longitudinal organization of the anterior neural plate and neural tube. Development 121, 3923–3933 (1995).
57. Fuccillo, M., Rallu, M., McMahon, A. P. & Fishell, G. Temporal requirement for hedgehog signaling in ventral telencephalic patterning. Development 131, 5031–5040 (2004).
58. Gunhaga, L., Jessell, T. M. & Edlund, T. Sonic hedgehog signaling at gastrula stages specifies ventral telencephalic cells in the chick embryo. Development 127, 3283–3293 (2000).
59. Machold, R. et al. Sonic hedgehog is required for progenitor cell maintenance in telencephalic stem cell niches. Neuron 39, 937–950 (2003). Directly demonstrated that the adult stem cell niche requires hedgehog signalling for its maintenance. In complementary fashion, two other papers (references 113 and 114) showed that SHH was mitogenic for cells in the adult stem cell niche.
60. Xu, Q., Wonders, C. P. & Anderson, S. A. Sonic hedgehog maintains the identity of cortical
interneuron progenitors in the ventral telencephalon. Development 132, 4987–4998 (2005).
61. Kohtz, J. D., Baker, D. P., Corte, G. & Fishell, G. Regionalization within the mammalian telencephalon is mediated by changes in responsiveness to Sonic Hedgehog. Development 125, 5079–5089 (1998).
62. Spoelgen, R. et al. LRP2/megalin is required for patterning of the ventral telencephalon. Development 132, 405–414 (2005).
63. McCarthy, R. A., Barth, J. L., Chintalapudi, M. R., Knaak, C. & Argraves, W. S. Megalin functions as an endocytic sonic hedgehog receptor. J. Biol. Chem. 277, 25660–25667 (2002).
64. Yoshida, M. et al. Emx1 and Emx2 functions in development of dorsal telencephalon. Development 124, 101–111 (1997).
65. Rallu, M. et al. Dorsoventral patterning is established in the telencephalon of mutants lacking both Gli3 and Hedgehog signaling. Development 129, 4963–4974 (2002).
66. Storm, E. E. et al. Dose-dependent functions of Fgf8 in regulating telencephalic patterning centers. Development 133, 1831–1844 (2006).
67. Ribes, V., Wang, Z., Dolle, P. & Niederreither, K. Retinaldehyde dehydrogenase 2 (RALDH2)-mediated retinoic acid synthesis regulates early mouse embryonic forebrain development by controlling FGF and sonic hedgehog signaling. Development 133, 351–361 (2006).
68. Gutin, G. et al. FGF signalling generates ventral telencephalic cells independently of SHH.Development 133, 2937–2946 (2006).
69. Schell-Apacik, C. et al. SONIC HEDGEHOG mutations causing human holoprosencephaly impair neural patterning activity. Hum. Genet. 113, 170–177 (2003).
70. Huh, S., Hatini, V., Marcus, R. C., Li, S. C. & Lai, E. Dorsal–ventral patterning defects in the eye of BF-1-deficient mice associated with a restricted loss of shh expression. Dev. Biol. 211, 53–63 (1999).
71. Barth, K. A. & Wilson, S. W. Expression of zebrafish nk2.2 is influenced by sonic hedgehog/vertebrate hedgehog-1 and demarcates a zone of neuronal differentiation in the embryonic forebrain. Development 121, 1755–1768 (1995).
72. Dakubo, G. D. et al. Retinal ganglion cell-derived sonic hedgehog signaling is required for optic disc and stalk neuroepithelial cell development. Development 130, 2967–2980 (2003).
73. Macdonald, R. et al. Midline signalling is required for Pax gene regulation and patterning of the eyes. Development 121, 3267–3278 (1995).
74. Kiecker, C. & Lumsden, A. Hedgehog signaling from the ZLI regulates diencephalic regional identity. Nature Neurosci. 7, 1242–1249 (2004).
Showed that the expression of SHH in the diencephalon controls anterior–posterior patterning.
This is particularly intriguing because, akin to these findings, hedgehog signalling in Drosophila is required for the establishment of posterior segment identity.
75. Agarwala, S., Aglyamova, G. V., Marma, A. K., Fallon, J. F. & Ragsdale, C. W. Differential susceptibility of midbrain and spinal cord patterning to floor plate defects in the talpid2 mutant. Dev. Biol. 288, 206–220 (2005).
76. Agarwala, S. & Ragsdale, C. W. A role for midbrain arcs in nucleogenesis. Development 129, 5779–5788 (2002).
77. Fedtsova, N. & Turner, E. E. Signals from the ventral midline and isthmus regulate the development of Brn3.0-expressing neurons in the midbrain. Mech. Dev. 105, 129–144 (2001).
78. Ishibashi, M. & McMahon, A. P. A sonic hedgehogdependent signaling relay regulates growth of diencephalic and mesencephalic primordia in the early mouse embryo. Development 129, 4807–4819 (2002).
79. Ye, W., Shimamura, K., Rubenstein, J. L., Hynes, M. A. & Rosenthal, A. FGF and Shh signals control dopaminergic and serotonergic cell fate in the anterior neural plate. Cell 93, 755–766 (1998).
80. Blaess, S., Corrales, J. D. & Joyner, A. L. Sonic hedgehog regulates Gli activator and repressor functions with spatial and temporal precision in the mid/hindbrain region. Development 133, 1799–1809 (2006).
81. Corrales, J. D., Rocco, G. L., Blaess, S., Guo, Q. & Joyner, A. L. Spatial pattern of sonic hedgehog signaling through Gli genes during cerebellum development. Development 131, 5581–5590 (2004).
82. Dahmane, N. & Ruiz-i-Altaba, A. Sonic hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum. Development 126, 3089–3100 (1999).
83. Lewis, P. M., Gritli-Linde, A., Smeyne, R., Kottmann, A. & McMahon, A. P. Sonic hedgehog signaling is required for expansion of granule neuron precursors and patterning of the mouse cerebellum. Dev. Biol. 270, 393–410 (2004).
84. Wallace, V. A. Purkinje-cell-derived Sonic hedgehog regulates granule neuron precursor cell proliferation in the developing mouse cerebellum. Curr. Biol. 9, 445–448 (1999).
85. Wechsler-Reya, R. J. & Scott, M. P. Control of neuronal precursor proliferation in the cerebellum by Sonic Hedgehog. Neuron 22, 103–114 (1999).
86. Corrales, J. D., Blaess, S., Mahoney, E. M. & Joyner, A. L. The level of sonic hedgehog signaling regulates the complexity of cerebellar foliation. Development 133, 1811–1821 (2006).
87. Orentas, D. M., Hayes, J. E., Dyer, K. L. & Miller, R. H. Sonic hedgehog signaling is required during the appearance of spinal cord oligodendrocyte precursors. Development 126, 2419–2429 (1999).
88. Pringle, N. P. et al. Determination of neuroepithelial cell fate: induction of the oligodendrocyte lineage by ventral midline cells and sonic hedgehog. Dev. Biol. 177, 30–42 (1996).
89. Poncet, C. et al. Induction of oligodendrocyte progenitors in the trunk neural tube by ventralizing signals: effects of notochord and floor plate grafts, and of sonic hedgehog. Mech. Dev. 60, 13–32 (1996).
The first study, along with references 87 and 88, to show that SHH signalling could directly mediate the generation of oligodendrocytes in the spinal cord.
90. Lu, Q. R. et al. Sonic hedgehog-regulated oligodendrocyte lineage genes encoding bHLH proteins in the mammalian central nervous system. Neuron 25, 317–329 (2000).
91. Zhou, Q., Wang, S. & Anderson, D. J. Identification of a novel family of oligodendrocyte lineage-specific basic helix-loop-helix transcription factors. Neuron 25, 331–343 (2000).
92. Lu, Q. R. et al. Common developmental requirement for Olig function indicates a motor neuron/oligodendrocyte connection. Cell 109, 75–86 (2002).
93. Zhou, Q. & Anderson, D. J. The bHLH transcription factors OLIG2 and OLIG1 couple neuronal and glial subtype specification. Cell 109, 61–73 (2002).
94. Tekki-Kessaris, N. et al. Hedgehog-dependent oligodendrocyte lineage specification in the telencephalon. Development 128, 2545–2554 (2001).
95. Kessaris, N., Jamen, F., Rubin, L. L. & Richardson, W. D. Cooperation between sonic hedgehog and fibroblast growth factor/MAPK signalling pathways in neocortical precursors. Development 131, 1289–1298 (2004).
96. Gabay, L., Lowell, S., Rubin, L. L. & Anderson, D. J. Deregulation of dorsoventral patterning by FGF confers trilineage differentiation capacity on CNS stem cells in vitro. Neuron 40, 485–499 (2003).
97. Lee, J., Platt, K. A., Censullo, P. & Ruiz i Altaba, A. Gli1 is a target of Sonic hedgehog that induces ventral neural tube development. Development 124, 2537–2552 (1997).
98. Liu, A., Joyner, A. L. & Turnbull, D. H. Alteration of limb and brain patterning in early mouse embryos by ultrasound-guided injection of Shh-expressing cells. Mech. Dev. 75, 107–115 (1998).
99. Rowitch, D. H. et al. Sonic hedgehog regulates proliferation and inhibits differentiation of CNS precursor cells. J. Neurosci. 19, 8954–8965 (1999).
100. Kenney, A. M., Cole, M. D. & Rowitch, D. H. Nmyc upregulation by sonic hedgehog signaling promotes proliferation in developing cerebellar granule neuron precursors. Development 130, 15–28 (2003).
101. Kenney, A. M. & Rowitch, D. H. Sonic hedgehog promotes G1 cyclin expression and sustained cell cycle progression in mammalian neuronal precursors. Mol. Cell Biol. 20, 9055–9067 (2000).
102. Oliver, T. G. et al. Transcriptional profiling of the Sonic hedgehog response: a critical role for N-myc in proliferation of neuronal precursors. Proc. Natl Acad. Sci. USA 100, 7331–7336 (2003).
103. Kenney, A. M., Widlund, H. R. & Rowitch, D. H. Hedgehog and PI-3 kinase signaling converge on Nmyc1 to promote cell cycle progression in cerebellar neuronal precursors. Development 131, 217–228 (2004).
104. Sjostrom, S. K., Finn, G., Hahn, W. C., Rowitch, D. H. & Kenney, A. M. The Cdk1 complex plays a prime role in regulating N-myc phosphorylation and turnover in neural precursors. Dev. Cell 9, 327–338 (2005).
105. Thibert, C. et al. Inhibition of neuroepithelial patchedinduced apoptosis by sonic hedgehog. Science 301, 843–846 (2003).
106. Culverwell, J. & Karlstrom, R. O. Making the connection: retinal axon guidance in the zebrafish. Semin. Cell Dev. Biol. 13, 497–506 (2002).
107. Trousse, F., Marti, E., Gruss, P., Torres, M. & Bovolenta, P. Control of retinal ganglion cell axon growth: a new role for Sonic hedgehog. Development 128, 3927–3936 (2001).
108. Strahle, U., Fischer, N. & Blader, P. Expression and regulation of a netrin homologue in the zebrafish embryo. Mech. Dev. 62, 147–160 (1997).
109. Barresi, M. J., Hutson, L. D., Chien, C. B. & Karlstrom, R. O. Hedgehog regulated Slit expression determines commissure and glial cell position in the zebrafish forebrain. Development 132, 3643–3656 (2005).
110. Charron, F., Stein, E., Jeong, J., McMahon, A. P. & Tessier-Lavigne, M. The morphogen sonic hedgehog is an axonal chemoattractant that collaborates with netrin-1 in midline axon guidance. Cell 113, 11–23 (2003).
Provides compelling genetic evidence that hedgehog signalling mediates axonal pathfinding
across the ventral midline. This was the first study to show that SHH has a role as a
chemoattractant.
111. Bourikas, D. et al. Sonic hedgehog guides commissural axons along the longitudinal axis of the spinal cord. Nature Neurosci. 8, 297–304 (2005).
112. Doetsch, F ., Caille, I., Lim, D. A., Garcia-Verdugo, J. M.& Alvarez-Buylla, A. Subventricular zone astrocytes are neural stem cells in the adult mammalian brain. Cell 97, 703–716 (1999).
113. Lai, K., Kaspar, B. K., Gage, F. H. & Schaffer, D. V. Sonic hedgehog regulates adult neural progenitor proliferation in vitro and in vivo. Nature Neurosci. 6, 21–27 (2003).
114. Palma, V. et al. Sonic hedgehog controls stem cell behavior in the postnatal and adult brain. Development 132, 335–344 (2005).
115. Joyner, A. L. & Zervas, M. Genetic inducible fate mapping in mouse: establishing genetic lineages and defining genetic neuroanatomy in the nervous system. Dev. Dyn. 235, 2376–2385 (2006).
116. Ahn, S. & Joyner, A. L. In vivo analysis of quiescent adult neural stem cells responding to Sonic hedgehog. Nature 437, 894–897 (2005). Used genetic fate mapping of the hedgehog reporter gene Gli1 to demonstrate that adult neural stem cells respond directly to hedgehog signalling.
117. Palma, V. & Ruiz i Altaba, A. Hedgehog-GLI signaling regulates the behavior of cells with stem cell properties in the developing neocortex. Development 131, 337–345 (2004).
118. Solecki, D. J., Liu, X. L., Tomoda, T., Fang, Y. & Hatten, M. E. Activated Notch2 signaling inhibits differentiation of cerebellar granule neuron precursors by maintaining proliferation. Neuron 31, 557–568 (2001).
119. Horabin, J. I. Splitting the Hedgehog signal: sex and patterning in Drosophila. Development 132, 4801–4810 (2005).
120. Chen, Y. & Struhl, G. Dual roles for patched in sequestering and transducing Hedgehog. Cell 87, 553–563 (1996).
121. Lu, Q. R., Cai, L., Rowitch, D., Cepko, C. L. & Stiles, C.D. Ectopic expression of Olig1 promotes oligodendrocyte formation and reduces neuronal survival in developing mouse cortex. Nature Neurosci. 4, 973–974 (2001).
FURTHER INFORMATION
Fishell’s laboratory:
http://saturn.med.nyu.edu/research/dg/fishelllab/index.html
Joyner’s laboratory:
http://saturn.med.nyu.edu/research/dg/joynerlab/
Access to this links box is available online.