Посещений:
Эндотелиальные клетки → Гематопоэтические клетки

Гемангиобласты

Tracing the hemangioblast during embryogenesis: developmental relationships between endothelial and hematopoietic cells
THIERRY JAFFREDO , KARINE BOLLEROT, DAISUKE SUGIYAMA, RODOLPHE GAUTIER and CECILE DREVON
Int. J. Dev. Biol. 49: 269-277 (2005) doi: 10.1387/ijdb.041948tj

We review here the development of the hematopoietic system and its relationship to the endothelium, with a special focus on the characterisation of the hemangioblast, the putative ancestor for endothelial cells and hematopoietic cells. Using the avian model, we have traced in vivo the progeny of embryonic endothelial cells and shown that aortic-born hematopoietic cells (known to generate the definitive hematopoietic lineage) derive from endothelial cells in the floor of the aorta. During this process, endothelial cells undergo a switch from endothelial cells to hematopoietic cells characterised by a downgrading of endothelial cell-specific genes and the parallel upgrading of hematopoietic cell-specific genes. Using a similar approach, we have shown that generation of hematopoietic cells from endothelial cells also takes place during mouse embryonic development. We have thoroughly characterised the dynamics of key molecules (several of which we have cloned) specifically expressed by the yolk sac or aortic hemangioblast. The yolk sac hemangioblast is characterized by the specific expression of SCL/Tal-1 and Lmo2, whereas the aortic hemangioblast expresses Runx-1 (a runt domain transcription factor). Finally, we have demonstrated the existence of a new site for hematopoiesis, namely the allantois. Using quail/chick grafts, we show that this embryonic appendage autonomously produces endothelial cells and hematopoietic cells, these latter being endowed with the attributes of the definitive hematopoietic lineage.



Continuous single-cell imaging of blood generation from haemogenic endothelium
Hanna M. Eilken, Shin-Ichi Nishikawa & Timm Schroeder (timm.schroeder@helmholtz-muenchen.de)
Nature 457, n7231, 896-900 (12 February 2009) | doi:10.1038/nature07760


Несмотря на декады поисков, идентификация клеток, генерирующих первые гематопоэтические клетки у эмбрионов млекопитающих не удалась1. В самом деле, возникают ли кровяные клетки из мезодермальных клеток, мезенхимных предшественников, бипотентных эндотелиально-гематопоэтических предшественников или гемогенных эндотелиальных клеток, остается споным вопросом2-9. Близость эндотелиальных и кровяных клеток в местах эмбрионального гематопоэза, а также сходная у них экспрессия генов, привела к гипотезе, что эндотелий генерирует кровь. Однако из-за отсутствия технологии10 было невозможно наблюдать постоянно отделение кровяных клеток на уровне одиночных клеток, поэтому постулируемое существование гемогенных эндотелиальных клеток оставалось спорным1. Здесь, используя новые методы наблюдения и отслеживания клеток, было показано, что эмбриональные эндотелиальные клетки могут быть гемогенными. С помощью непрерывного долговременного наблюдения за одиночными клетками из мезодермальных клеток мышей, генерирующих колонии эндотелиальных и кровяных клеток, оказалось возможным определить гемогенные эндотелиальные клетки, дающие кровяные клетки. Живые эндотелиальные и гематопоэтические клетки идентифицировали с помощью одновременной детекции морфологии и множественных молекулярных и функциональных маркеров. Отсоединение возникающих кровяных клеток от эндотелия не связано напрямую с асимметричным клеточным делением, и гемогенные эндотелиальные клетки специфицируются из клеток, уже экспрессирующих эндотелиальные маркеры. Эти результаты расширяют наше понимание онтогенетического происхождения кровяных клеток млекопитающих и потенциальной генерации гематопоэтических стволовых клеток из эмбриональных стволовых клеток.


Рисунки к статье  

Developmental bases of hematopoietic cell emergence and migration, an introduction


Давно известна центральная Yolk Sac в продукции Hematopoietic Cells (HC). YS-продуцируемый гематопоэз в основном представлен эритроидными клетками. Анализируя срезы эмбрионов разных видов, др. авт. сообщали в то же самое время о присутствии клеток, возможно гематопоэтического происхождения, ассоциированных с вентральными аспектами аорты. Спустя 50 лет роль YS в продукции HC была проанализирована в серии экспериментов Moore and Owen (Moore and Owen, 1965, Moore and Owen, 1967a) Ими была предложена теория гематогенеза (Moore and Owen, 1967b). Рудименты гематопоэтических органов, т.к. плодная печень, костный мозг, селезенка, колонизируются клетками, приходящими извне. Эти заключения были подтверждены и расширены (Jotereau and Le Douarin, 1982, Le Douarin et al., 1984a, Le Douarin et al., 1984b). YS продуцирует линию HC, часть из которой дифференцируется in situ, тогда как др. колонизирует рудименты гематопоэтических органов (Moore and Owen, 1967b). Немного позднее F. Dieterlen с сотр. инициировали серию элегантных экспериментов с использованием системы перепел/курица в комбинации с доступностью и топологией эмбрионов птиц, которые распластаны на сферическом YS. Для этого трансплантировали эмбрион перепела на YS курицы, что позволяет анализировать конструкцию гематопоэтических органов на присутствие клеток перепела или курицы (Dieterlen-Lievre, 1975). Гематопоэтические органы внутри эмбриона засевались исключительно клетками перепела. В противоположность centripetal току HC, постулированному Moore and Owen, клетки от эмбриона даже засевали YS у эмбрионов на (E) 5 день (Beaupain et al., 1979a, Martin et al., 1978). На E13, 70% циркулирующих кровяных клеток были перепелиного происхождения (Beaupain et al., 1979a). Сходные эксперименты были повторены с конгенными линиями кур, отличающихся или своими половыми хромосомами (Lassila et al., 1978a, Lassila et al., 1978b), своими гаплотипами immunoglobulin (Lassila et al., 1979, Martin et al., 1979) или антигенами главного комплекса гистосовместимости (Lassila et al., 1982). Было получено сходное заключение. Клетки YS быстро уменьшаются, начиная с E5 и исчезают полностью к моменту вылупления. Т.о., HC желточного мешка не обнаруживают долговременного само-обновления, так что источник "definitive" Hematopoietic Stem Cells (HSC), колонизирующий гематопоэтические органы происходит из самого эмбриона. Эти эксперименты также показали, что YS вносит вклад в две отдельные генерации эритроцитов: примитивные, которые целиком происходят из YS, и вторичные (плодные), которые происходят как из эмбрионов, так и желточного мешка, последний способен генерировать эритроциты с фетальным глобином (Beaupain et al., 1979a, Beaupain et al., 1979b). Время- и тип-ограниченная способность дифференцировки YS HC, по-видимому, отражает влияние микроусловий YS, которые могут запускать дифференцировку HC в эритроидный и миэлоидный росток. В этой связи, когда вне-эмбриональная область E2 эмбриона перепела ассоциирует in vitro с E6 тимусом цыпленка, то перепелиные HC колонизируют рудимент тимуса и подвергаются лимфоидной дифференцировке (Jotereau and Houssaint, 1977), показывая, что потенциал присутствует, но маскируется микроусловиями. Наконец, используя обратные YS химеры (эмбрион курицы на YS перепела), в комбинации специфичных для типа клеток и для вида моноклональных антител QH1/MB1 (Pardanaud et al., 1987, Peault et al., 1983), которые распознают гематопоэтические и Endothelial Cells (EC) перепела, было показано, что YS продуцирует раннюю и небольшую популяцию HC с характеристиками примитивных макрофагов, обнаруживаемых в зоне апоптоза, которая может представлять собой первые микроглиальные клетки (Cuadros et al., 1992, Cuadros and Navascues, 2001). Такой вклад YS также недавно продемонстрирован для эмбрионов мышей (Alliot et al., 1999).
С целью идентификации внутри-эмбриональных мест, где продуцируются HSC, Dieterlen-Liеvre с сотр. сконцентрировались на кластерах клеток, ассоциированных с аортой, которые выступали в просвет аорты. Эти клетки обладали некоторыми атрибутами HC, среди который высокое соотношение ядра к цитоплазме и сродство к базофильным окраскам (Dieterlen-Lievre and Martin, 1981). Позднее их гематопоэтическая природа была подтверждена с помощью MB1/QH1. Область аорты (обозначаемая у эмбрионов мышей как PSp/AGM ('Para-aortic Splanchnopleura/Aorta-Gonad-Mesonephros') регион, т.e., аорта и окружающие ткани на двух разных стадиях развития), как было установлено содержит способные к трансплантации HSC у эмбрионов птиц (Lassila et al., 1980). У птиц аорта выполняет два разных аспекта гематопоэза; первыми появляются на третий день инкубации (E3=Hamburger and Hamilton -HH- stages 17 - 21) (Hamburger and Hamilton, 1951) и обозначаются как внутри-аортальные кластеры (Fig. 1). Второй аспект, обозначаемый как пара-аортальные фокусы, формируемый между E6.5 и E9 вне собственно аорты (Fig. 1), состоит из больших групп клеток, распределенных в рыхлой вентральной мезодерме по отношению к сосудам (Dieterlen-Lievre and Martin, 1981). В то время как немногие клетки, обладающие характеристиками HC, как сообщалось, встречаются в гомологичных сайтах эмбрионов мыши, но существование этого второго аспекта не подтверждено у млекопитающих (Godin and Peault, 2005 in this issue). Диссоциированные на индивидуальные клетки и посеянные на полутвердую среду с добавлением соотв. цитокинов, аортальные клетки цыплят давали erythroid, monocytic, myeloid или мультипотентные колонии (Cormier, 1993, Cormier et al., 1986, Cormier and Dieterlen-Lievre, 1988).

Hemangioblast and the hemogenic endothelium


Когда YS формирует BI, то HC и EC появляются в одно и то же время в тесной ассоциации. В аорте HC и EC интимно ассоциированы. Их ассоциация позволила предположить существование родоначального предшественника для EC и HC, названного hemangioblast (Murray, 1932). Эта гипотеза была подтверждена тем фактом, что 1° оба типа клеток обладают и что 2° некоторые генные мутации и делеции у эмбрионов рыбок данио и мышей затрагивают оба типа клеток. Затем существование этого типа клеток было продемонстрировано в культурах ES клеток, но такой общий родоначальник не был обнаружен пока in vivo. Некоторые данные на птицах даже говорят против этой гипотезы; птичий гомолог VEGF-R2, Quek-1, как было показано, экспрессируется в мезодермальных предшественниках, дающих YS мезодерму. С целью идентификации hemangioblast, Eichmannn и др. (Eichmann et al., 1997) отсортировали Quek-1+ клетки от очень ранних бластодисков и получили популяцию позитивных клеток для клональной дифференцировки. В отсутствие факторов роста, VEGF-R2+ клетки давали гематопоэтические колонии. Если добавлялся VEGF, то дифференцировались эндотелиальные колонии, тогда как количество гематопоэтических колоний существенно снижалось. Смешанные колонии никогда не возникали, указывая тем самым на существование общего предшественника. Недавние эксперименты по картированию на эмбрионах мышей подтвердили, что HC и EC сегрегируют отдельно во время процесса гаструляции; HC проходят через PS первыми, за ними следует популяция EC (Kinder et al., 1999).
Т.к. родственные отношения между HC и EC ещё не решены даже для YS BI, то генерация HC в области аорты анализировалась более детально. В E3 аорте птиц (HH17 to 21), HC, по-видимому, вычленяются из эндотелия дна аорты. Сходные группы клеток был описаны в том же положении у всех исследованных видов позвоночных. По примеру F. Dieterlen мы решили проанализировать происхождение внутриаортальных кластеров у птиц и paraaortic фокусов с особенным упором на их предполагаемые взаимоотношения с эндотелием. Мы сначала проанализировали характеристики клеток, выстилающих просвет аорты во время появления гематопоэтических клеток (Jaffredo et al., 1998), используя двойное окрашивание с антителами, направленными против CD45, pan leukocyte антигена, и против VEGF-R2, специфических для EC в это время. До появления кластеров аортальные EC были целиком позитивными по VEGF-R2. Когда же дифференцировались кластеры, то VEGF-R2 снижались, а CD45 увеличивались в EC вентрального эндотелия (Fig. 1E). Когда гематопоэтические клетки выпячивались в просвет аорты, то все округлые клетки становились CD45+ (Jaffredo et al., 1998).



Fig. 1. Emergence of hematopoietic clusters in the aortic endothelium.The drawings represent the different steps from the paired aortae to the paraaortic foci. (A) Route of inoculation. AcLDL-DiI and non-replicative retroviral vectors are delivered into the heart with a micropipette so that the probes are in direct contact with endothelial cells lining the vessels. (B) Cross section at the mid-trunk level. lacZ staining following non-replicative retroviral vectors. 12 hours after inoculation, a few hours after fusion of the paired aortae. Both endothelial cells in the ventral and dorsal sides of the vessel are labelled. (C,D) Cross section at the mid-trunk level. Double staining for AcLDL-DiI and CD45. 24 hours after AcLDL-DiI delivery. C: endothelial cells of the aorta are strongly positive for AcLDL-DiI. Note the presence of AcLDL-DiI + budding cells as well as cells into the mesentery (arrowheads). D: Double staining with anti-CD45 which labels the hematopoietic clusters. (E) Double staining with anti-VEGF-R2 (orange) and CD45 (green). Note the presence of green cells inserted into the endothelium and accumulating into the mesentery (arrowheads). (F) Cross section at the mid-trunk level. Six days following inoculation of non-replicative vectors carrying lacZ. Double staining for CD45 (green) and lacZ (blue). Blue cells are found inside the CD45+ population thus derive from cells stained earlier on at the level of the endothelium. Abbreviations: Ao, aorta; N, notochord; NT, neural tube.

Затем мы использовали два витальных трассера, acetylated Low Density Lipoprotein (AcLDL), купированный с флюоресцентным липофильным маркером (DiI), и не-репликативные ретровирусные вектора, несущие репортерные гены. Первый осуществлял кратковременную трассировку, тогда как второй позволял таргетинг клеток в течение более длительного времени. Оба вводили с помощью внутри-кардиальной инокуляции (Fig. 1A). Инокуляции осуществляли в начале второго дня инкубации, т.e., за день до



Fig. 2. 9-somite stage: from mesoderm to mature blood cell groups. (A-E) 9-somite stage, whole mounts. (F-J) Adjacent sections, in situ hybridization. (A) GATA-2 expression has progressed throughout the AO except for its anterior-most aspect. (B) SCL is strongly expressed by BI as well as around the posterior part of the embryo. (C) Lmo2 displays a similar pattern. (D) GATA-1, present at the level of the islands, is enhanced in lateral BI. (E) hemoglobin is now conspicuous in lateral BI. Bar, 2 mm. (F) Brachyury is restricted to mesoderm at the level of the streak proper. (G) GATA-2 is expressed by the mesoderm starting from its ingression through the streak. The signal is enhanced in nascent BI at the AP/AO frontier but decreased in lateral, mature BI. (H) SCL is expressed by single cells or groups of cells, close to the endoderm adjacent from the streak (arrowheads). Expression persists in nascent BI (solid arrow) and in mature BI (empty arrow) although expression levels vary from cell to cell. (I) Lmo2 expression resembles that of SCL. Note the enhanced expression in the external cells of the maturing BI pointed out by the solid arrow. (J) GATA-1 is found in nascent BI where GATA-2 is upregulated (compare G to J). The GATA-1 signal increases as BI mature, the highest expression level being found in the most lateral BI. Arrowheads, solid arrows and empty arrows point out the same structures on the different sections. Bar, 100 мm. Reprinted with permission from Gene Expresssion Patterns, (2003) Minko, K., Bollerot, K., Drevon, C., Hallais, M.F. and Jaffredo, T. "From mesoderm to blood islands: patterns of key molecules during yolk sac erythropoiesis." pp. 261-272.

появления первых, ассоциированных с аортой HC. Идентификация клеток достигалась использованием anti-VEGF-R2 (Eichmann et al., 1997) и anti-CD45 антител (Jeurissen and Janse, 1998) в качестве соотв. EC- и HC-специфических зондов. AcLDL-DiI имеет два основных преимущества: 1° он подвергается эндоцитозу с помощью EC и макрофагов (которые отсутствуют у эмбрионов на этой стадии) посредством специфических рецепторов. 2° Он обладает коротким периодом полу-жизни и быстро исчезает из кровообращения, даже если эндоцитоз не происходит. Спустя два ч. после инокуляции всё сосудистое древо оказывается меченным. Аорта всё ещё парная в это время целиком выстилается LDL+ EC, тогда как CD45+ отсутствуют и на уровне аорты и в кровообращении. Спустя 24 ч после инокуляции парная аорта сливается. LDL окраска обнаруживается в EC , но также в аортальных кластерах, которые обнаруживают строгий сигнал LDL (Fig. 1C). Более того, LDL+/CD45+ клетки обнаруживаются в мезенхиме вентральной части аорты (Fig.1 C, D) указывая тем самым, что субнабор HC проникает в эту область (Jaffredo et al., 1998). Т.о., внутри-аортальные кластеры происходят из клеток, локализованных в дне аорты и обладают типичным эндотелиальным фенотипом во время инокуляции, подвергаясь 'transdifferentiation'. Важно, что недавно было продемонстрировано на эмбрионах мышей и людей, что аортальные EC также могут давать HC (de Bruijn et al., 2002, Oberlin et al., 2002). В противоположность внутри-аортальным кластерам, para-aortic фокусы, развивающиеся в мезенхиме вентральнее аорты и не обнаруживают видимых взаимоотношений с аортальным эндотелием. Экспериментальный анализ показал, что среди этих клеток присутствуют HSC. Имеются ли онтогенетические взаимоотношения между двумя аспектами аортального гематопоэза или они относятся к двум независимым генерациям HSC? Этот вопрос важен, т.к. взрослые, по-видимому, больше не способны к продукции HSC из EC. Др. вопрос, генерируются ли HSC из эндотелия в качестве промежуточных образований во время раннего развития или онит генерируются de novo из мезенхимы? Чтобы ответить на этот вопрос мы использовали нерепликативные lacZ-несущие ретровирусные вектора, вводимые в кровообращение. Преимущества этой системы двояки: 1° клоны могут быть идентифицированы благодаря интеграции, происходящей только в немногих EC. 2° репортерный ген стабильно экспрессируется в потомстве инфицированных клеток и помеченные клетки могут отслеживаться в течение длительного периода. Выводы: как и в случае с AcLDL-DiI, ретровирусные вектора метят исключительно EC (Fig. 1B). На ст. E3 меченные клоны, представлены или EC или HC, но никогда не смешаны. Меченные клетки наблюдались проникающими в мезентерий вентральнее дна аорты. На ст. E7, пара-аортальные фокусы содержат многочисленные lacZ+ клетки (Fig. 1F) (Jaffredo et al., 2000). Т.о., пара-аортальные фокусы засеваются предшественниками, происходящими из дна аорты на E3, посредством уникального события возникновения HSC из эндотелия аорты.

Hemogenic endothelium in the mouse embryo


У эмбрионов мышей AGM регион также является местом, где происходит дефинитивный гематопоэз (Godin and Cumano, 2002, Ling and Dzierzak, 2002). В то же самое время, когда мы продемонстрировали эндотелиальное происхождение внутри-аортальных кластеров у эмбрионов птиц, Nishikawa and colleagues (1998) показали, что EC, выделенные из эмбрионов мышей на ст. E9.5 на базе экспрессии VE-cadherin, были способны давать кровяные клетки in vitro. Анализируя AGM, было установлено, что HSC возникают из дорсальной части аорты и окружающих тканей (de Bruijn et al., 2000). Наконец, используя трансгенных мышей, несущих ген GFP под контролем промотора Ly6-A, было показано, что первые дефинитивные HSC появляются в эндотелиальном слое (de Bruijn et al., 2002). Результаты, полученные на эмбрионах птиц, убедили нас использовать сходный подход отслеживания к эмбрионам мышей. В сотрудничестве с Daisuke Sugiyama, мы проанализировали продукцию HC эндотелием, ассоциированным с сосудами, во время эмбрионального развития мышей. Как и в эмбрионах птиц, AcLDL-DiI инъецировали внутрь сердца культивируемых эмбрионов. Спустя част после инокуляции DiI окрашивание обнаруживалось по всему эндотелиальному древу. После диссоциации FACS анализ показал, что DiI+ клетки были CD31+, CD34+, но не CD45, антиген характерный для эндотелиального клона. После культивирования клонов эти клетки давали взрослого типа эритроидные колонии, которые обладали цепочками взрослого глобина. Некоторым эмбрионам давали воозможность развиваться дополнительно 12 или 24 ч.Спустя 12 ч после инокуляции 43% DiI+ циркулирующих клеток принадлежало к дефинитивному эритроидному клону. После ст. 29-сомитов, пропорция DiI+ эритроидных клеток постепенно снижалась. Эти результаты демонстрируют впервые на эмбрионах мышей генерацию гематопоэтических клеток из эндотелиальных промежуточных образований. Т.о., получены доказательства высвобождения этих клеток в кровообращение и в пользу гипотезы, что они способны колонизировать печень плода и генерировать дефинитивные эритроциты in vivo (Sugiyama et al., 2003).

Molecular characterisation of the hemangioblast and the hemogenic endothelium


Экспериментальная демонстрация гемогенеза аортальным эндотелием подвигла нас на поиск молекул, специфически экспрессируемых гемангиобластами или гемогенным эндотелием. Используя молекулярные маркеры, некоторые из которых были клонированы нами, мы оказались способны идентифицировать ступени от закладки мезодермы для EC и HC в YS и на уровне аорты при переходе от EC к HC. Кровь-формирующая система, а именно EC и HC, дифференцируются из мезодермы во время процесса гаструляции, т.е. во время проникновения клеток из поверхностного эпибласта. Вне-эмбриональная мезодерма закладывается первой и вносит вклад в Area Opaca (AO), называемая так из-за клеток представляющих энтодермальный слой, гипобласт, которые из-за yolky выглядит непрозрачным (opaque). Мезодерма, дающая начало BI , как было показано, откладывается на ранних стадиях из клеток, расположенных в задней части первичной полоски (Schoenwolf et al., 1992). Картирование первичной полоски у эмбрионов мышей привело к сходным заключениям (Kinder et al., 1999). Клетки, отложенные первыми, подвергаются экстенсивной направленной латерально и к голове (cephalwards) миграции и достигают краёв бластодиска, тогда как клетки, проходящие через полоску, непосредственно после этого, оккупируют более медиальные и более каудальные позиции. После этого клетки постепенно заполняют более центральные и более задние позиции, т.к. первичная полоска регрессирует от цефалического к каудальному уровню. Т.о., рано заложенные клетки имеют более длинную историю жизни, чем их непосредственные соседи и подвергаются дифференцировке раньше. Кровяные островки (BI), из которых возникают первые HC дифференцируются из AO мезодермы. BI обычно состоят из наружного слоя EC и сердцевины из HC. BI прогрессивно распространяются на весь YS. Мезодерма, дающая эмбриональную область обозначается как Area Pellucida (AP), т.к. она располагается выше сегментационной полости и выглядит прозрачной. AP генерируется клетками, занимающими наиболее переднюю позицию вдоль первичной полоски



Fig. 3. Gene activity during formation of the intraaortic clusters. The drawing in the left side schematises the different steps in the formation of the clusters. The frames point out the two major aspects of cluster formation: hemogenic endothelium without any morphological sign of hematopoiesis and full cluster formation. (A-C) Beginning of the third day of development when intraaortic clusters have not appeared yet. Adjacent sections. (D-L) Middle of the third day when intraaortic clusters are fully developed. (A) SCL/Tal-1 is expressed by all aortic EC but appears strengthened in the aortic floor. Note the presence of SCL/Tal-1+ circulating cells. (B) Lmo2 stains all aortic EC. A few circulating cells are Lmo2+. (C) Runx1 expression is restricted to EC of the aortic floor. (D) SCL/Tal-1 is now vividly expressed by the clusters and expressed at low levels by aortic EC. (E) Lmo2 displays a similar signal. In addition non-aortic EC display a conspicuous Lmo2 expression. Reprinted with permission from Hematopoietic stem cells, Dr. I. Godin and A. Cumano editors; Extra and intraembryonic HSC commitment in the avian model. Jaffredo T., Bollerot K., Minko K., Gautier R., Romero S and Drevon C. Copyright 2003 with permission from Landes Biosciences.

(Schoenwolf et al., 1992). В то время, когда BI дифференцируются, AP, из которой развивается собственно эмбрион, не участвует в этой ранней кровь-формирующей фазе, однако она содержит структуры, очень сходные с YS BI (называемыми vascular islands), которые никогда не дают гематопоэз. Кровь-формирующий потенциал этой последней области выявляется два дня позднее, когда область аорты подвергается гематопоэзу. Мы исследовали эти ранние события путем изучения паттернов некоторых молекул, скорее всего участвующих в появлении HC и EC, т.e., Notch и его лиганды и транскрипционные факторы, которые участвуют в мультимерных комплексах: GATA-1, -2, -3, SCL/Tal-1 и Lmo2, (чьи птичьи ортологи мы клонировали) и VEGF-R2, регулятор гематопоэтического и эндотелиального предопределения. Передача сигналов Notch является важным эволюционно законсервированным механизмом, как известно, контролирующим выбор судьбы клетками с помощью локальных взаимодействий. Анализировали паттерны экспрессии Notch-1 и -2 генов и их лигандов, Delta-1, Serrate-1 и -2, в раннем бластодиске эмбрионов кур со стадии пред-полоски (pre-streak) до ст. первого сомита. Delta-1 выявлялся на ст. pre-streak в задней части эмбриона сразу же после Notch-1 в той же самой области стадии инициальной полоски. После чего оба строго экспрессируются в задней части первичной полоски вплоть до HH4. Notch-2 также обнаруживается на уровне полоски, хотя и на более низких уровнях. Notch-1 гомогенно экспрессируется клетками эпибласта и мезодермы, проникающими на уровень полоски, тогда как экспрессия Delta-1 проявляется в виде паттерна "salt and pepper". Активность Notch и Delta не выявляется в кровяных островках YS, указывая тем самым, что клональные ограничения м. происходить очень рано во время развития (Caprioli et al., 2002). По ходу гаструляции на ст. HH3 and HH4 (соотв. 12-13 ч и 18 ч инкубации) GATA-2 и VEGF-R2 обнаруживаются как самые ранние во всей ingressing мезодерме. Выявляются два отдельных паттерна; один низкий, ассоциированый с ingressing мезодермой, и др. высокий, специфический, ограниченный мезодермальными клетками, находящимися в непосредственном контакте с энтодермой, хотя морфологическое разделение не видно в мезодермальном компартменте. Мы интерпретировали такой паттерн как раннее событие предетерминации, возникающее в результате взаимодействий энтодерма/мезодерма. С этого момента появляется экспрессия SCL/Tal-1 и Lmo2 в группах клеток или в одиночных клетках, сходных с гемангиобластами, которые обладают общей экспрессией GATA-2 и VEGF-R2 с остальной мезодермой. Это сопровождается усилением транскрипции GATA-2 в гемангиобластных агрегатах (Fig. 2A to J). Экспрессия этих генов преимущественно обнаруживается в клетках, локализованных в вентральном аспекте мезодермы, где сопровождается появлением морфологически самостоятельных структур. На более поздних стадиях эти структуры становятся более заметными, что сопровождается экспрессией SCL/Tal1, Lmo2 и появлением GATA-1 (Minko et al., 2003).
Активности генов были также охарактеризованы на уровне аорты. Когда аорты всё ещё парные и не обнаруживается признаков гематопоэза, то аортальные EC экспрессируют молекулы, характерные для эндотелия (поверхностные молекулы VEGFR2, VE-Cadherin и низкие уровни экспрессии транскрипционных факторов Lmo2, SCL/Tal-1). Когда аорты ещё парные или начинают сливаться, то появляется экспрессия Runx1 и GATA-2, тогда как SCL/Tal-1 и Lmo2, усиливают свою активность в вентральных аспектах аорты, сохраняя в то же самое время экспрессию EC-специфических генов (Fig. 3A, B, C). Ступени после слияния были охарактеризованы в отношении утолщений вентральных EC, что сопровождается повышенной экспрессией HC-специфических генов и снижением EC's (подавляются VEGF-R2, VE-Cadherin усиливаются Runx1, SCL/Tal-1, Lmo2, GATA-2, GATA-3 ). C этого момента гематопоэтические кластеры становятся видимыми и экспрессии EC- и HC-специфических генов расходятся (Fig. 3D to L). Runx1, птичий ортолог которого был клонирован, является единственным геном, чья экспрессия кстати, как известно, ограничена вентральной областью аорты. Этот транскрипционный фактор содержит эволюционно законсервированный ДНК-связывающий домен, названный runt, который также необходим для гетеродимеризации с ко-факторам, наз. CBF. Инактивация этого гена у эмбрионов мышей предваряет появление дефинитивного гематопоэза (Wang et al., 1996). Используя knock in подход, было показано, что Runx1 специфически экспрессируется вентро-латеральными аортальными EC, внутри-аортальными кластерами (North et al., 1999) и тесно ассоциированы с фракцией HSC (North et al., 2002). У эмбрионов птиц Runx1 is экспрессируется уже на ст. E2.5 в EC вентрального дна аорты. Экспрессия начинается, когда аорта ещё парная и сохраняется после слияния сосудов. Во время продукции гематопоэтических кластеров Runx1 оказывается ограниченным HC, отпочковывающимися в просвет и проникающими в мезентерий.
Интересно, что PU-1, предполагаемый ген-мишень для Runx1, экспрессируется в предшественниках миэлоидного и лимфоидного ростка и выявляется во внутри-аортальных кластерах (Fig. 3) .

The allantois: another source for hemangioblasts?


У птиц время появления внутри-аортальных кластеров и пара-аортальный фокусов соответствует засеванию тимуса и сумки Fabricius. Клетки para-aortic фокусов, как было установлено, обладают B и T лимфоидным потенциалом. Однако колонизация костного мозга начинается на ст. E10.5 у эмбрионов кур и продолжается вплоть до вылупления. В это время активность para-aortic фокусов затихает. Возможность того, что клетки para-aortic фокусов остаются в недифференцированном состоянии где-то в эмбрионе, маловероятна. Поэтому мы обратили внимание на др. сайт, продуцирующий предшественников, идентифицированный в аллантоисе. Этот орган обладает соответствующим тканевым потенциалом продуцировать гематопоэз, т.е. энтодерму, ассоциированную с мезодермой. Этот придаток, как было показано, участвует в газовом обмене, экскреции продуктов накопления, очистке резорбированного Ca++ и конструкции костей.
Используя India ink или AcLDL-Di микроангиографию мы впервые установили, что аллантоис васкуляризуется между 75-80 ч инкубации. Он обладает настоящими эритроцитами в этом месте, даже еще до периода появления гематопоэза, независимо от остальных частей эмбриона (Caprioli et al., 1998, Caprioli et al., 2001). В аллантоисе действует программа, характеризующаяся выраженной экспрессией некоторых "hemangioblastic" генов в мезодерме, сопровождаемой др. паттерн-формирующими генами, ассоциированными с энтодермой. VEGF-R2, по крайней мере, со ст. HH17 и далее экспрессируется непосредственно вслед за транскрипцией факторов GATA-2, SCL/Tal-1 и GATA-1. Дифференцируются структуры, похожие на кровяные островки, которые содержат как CD45+ клетки, так и клетки, накапливающие гемоглобин; эти структуры выглядят в точности как кровяные островки в желточном мешке. Этот гемопоэтический процесс происходит до установления сосудистой сети, соединяющей аллантоис с эмбрионом. Как только энтодерма вовлекается в процесс, то в этой области обнаруживается мРНК GATA-3, там, где должен дифференцироваться аллантоис ещё до того как posterior instestinal portal станет анатомически различимым. Незадолго до выроста зачатка GATA-2 экспрессируется в энтодерме и в то же время инициируется гемангиобластическая программа в мезодерме. GATA-3 выявляется, по крайней мере, вплоть до E8, а GATA-2 вплоть до E3, самой поздней из исследованных для этого фактора стадии. Используя культуры in vitro, мы показали, что зачаток аллантоиса, выделяемый до установления циркуляции между зачатком и остальной частью эмбриона, продуцирует эритроциты дефинитивного ростка. Более того, используя межвидовые трансплантации между эмбрионами перепела и кур, мы продемонстрировали, что сосудистая сеть аллантоиса развивается из внутренне присущих ему предшественников (Caprioli et al., 2001). Всё это вместе с более ранними находками, указывает на предетерминацию мезодермы в эндотелиальный и гемопоэтический клоны в аллантоисе. Выявление выраженной экспрессии GATA-3, ограниченной энтодермой области пре-аллантоиса и зачатком аллантоиса, сопровождаемое экспрессией GATA-2, является интересной и новой информацией в контексте формирования органа и спецификации энтодермы в возникновении гематопоэтических клеток. Исследования на эмбрионах мышей показали. что плодная часть плаценты, которая происходит из аллантоиса является источником гематопоэтических предшественников (Dieterlen-Lievre et al., 2005 in this issue).
Сайт создан в системе uCoz