Передача сигналов с помощью мембранных рецепторов является существенной для регуляции нескольких клеточных функций, но как каждое взаимодействие лиганд-рецептор продуцирует свой собственный специфический паттерн регулируемой клеточной функции является фундаментальным вопросом биологии. Идентификация специфических рецепторов и системы вторичных мессенджеров, таких как cyclic AMP (cAMP), привело к классической точке зрения на передачу сигнала в виде линейного каскада (Fig. 1a). Со временем эти линейные каскады стали отражать расхождения, которые наблюдались на некоторых ступенях в сигнальных путях и взаимодействия между сигнальными путями (Fig. 1b,c). Сегодня очевидно, что даже 'f модель может быть не удовлетворительной для объяснения передачи клеточных сигналов и интегрированного контроля клеточных функций.

Сегодня очень важно в системе лиганд-рецептор идентифицировать компоненты или узлы внутри сети, которые являются существенными медиаторами или модификаторами сигналов от лигандов¹²⁵. Некоторые группы предприняли количественные подходы, чтобы интегрировать биохимические и компьютерные данные для идентификации важных узлов в сигнальных путях, а также для описания, как эти узлы могут взаимодействовать с др. сигнальными каскадами. Мы полагаем, что комплементарный подход к описанию клеточных сигнальных сетей с использованием данных, которые были получены в исследованиях по нокауту генов in vitro и in vivo, может предоставить удобные критерии для интеграции растущего количества знаний в данной области.

Мы полагаем, что важные медиаторы или 'critical nodes', любой сигнальной сети (Fig. 1d) могут быть идентифицированы с помощью трех критериев: во-первых, узел д. состоять из группы родственных белков (напр., изоформ гена), которые существенны для сигнала, передаваемого рецептором и в которой два или более из этих родственных белков могут выполнять уникальные биологические роли внутри сигнальной сети и, следовательно, служить источником дивергенции внутри сигнальной системы; во-вторых, узел д.быть высоко регулируемым и позитивно и негативно; и в третьих, узел д.быть соединением для потенциального общения с др. сигнальными системами. Мы проиллюстрируем эту концепцию с помощью анализа инсулиновой сигнальной сети, в которой определены некоторые критические узлы и показана важная роль их в нормлаьной физиологии и в болезненных состояниях, таких как диабет и метаболический синдром.

Передача сигналов обеспечивается сложной, высоко интегрированной сетью, которая контролирует несколько процессов. В присутствии insulin, insulin receptor (IR) фосфорилирует insulin receptor substrate proteins (IRS proteins), которые связаны с активацией двух главных сигнальных путей: phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)-AKT/protein kinase B (PKB) путем, который ответственен за метаболическое действие инсулина, и Ras-mitogen-activated protein kinase (MAPK) путь, который регулирует экспрессию некоторых генов и кооперирует с PI3K путем, чтобы контролировать рост и дифференцировку клеток (rev. Ref. 1) (Fig. 2).

Хотя простая схема дивергентных путей выглядит достаточной для объяснения пердачи сигналов инсулина, концепция критических узлов становится очевидной, если посмотреть на абсолютные количества генов и белковых изоформ, которые участвуют в активации AKT/PKB и в генерации метаболических эффектов. Напр., IR имеют две сплайс-изоформы, которые обычно ко-экспрессируются в клетках, которые экспрессируют также высоко родственный insulin-growth factor-1 receptor (IGF1R), который также может активироваться инсулином. И IR и IGF1R могут фосфорилировать, по крайней мере, 6 субстратных белков, которые способны взаимодействовать с 8 известными формами PI3K регуляторной субъединицы, которая ассоциирует с тремя формами PI3K каталитической субъединицы, которые могут генерировать phosphatidylinositol-3,4,5-triphosphate (PIP3), что ведет к активации трех известных изоформ AKT/PKB. Следовательно, если рассмотреть комбинаторные возможности этих первых ступеней пути, то обнаружится свыше 1,000 возможных комбинаций и это количество увеличится, если учтем компартментализацию, кинетику и нижестоящие компоненты сигнальной сети.

Среди сотен молекул, которые, как было установлено, участвуют в сигнальном инсулиновом пути, мы идентифицировали IR/IRS, PI3K гетеродимер и AKT/PKB (Fig. 2) в качестве трех наиболее подходящих к определению критических узлов. Т.к. мы хотим объяснить каждый из этих компонентов сети, представляющих критический узел, т.к. они удовлетворяют критериям - каждый из них важен для действия инсулина, состоит из нескольких изоформ с уникальными функциями, высоко регулируется и обеспечивает кроме того взаимодействие с др. сигнальными каскадами. Важно, что эти критические узлы активно исследовались в качестве существенных медиаторов передачи сигналов инсулина, как in vitro так и in vivo. Могут существовать и др. критические узлы в инсулиновой сигнальной сети, однако, только IR/IRS, PI3K и AKT/PKB узлы имеют сильные и преобладающие данные к настоящему времени, которые рассматриваются как критические. Наконец, мы обсуждаем существование др. возможных критериев узлов и обсуждаем подходы для их дальнейшего изучения.

Первым критическим узлом в инсулин-сигнальной сети является по определению IR и ассоциированные IRS белки (Fig. 2). Важно отметить, что в отличие от др. receptor tyrosine kinases (RTKs), которые соединяются непосредственно с цитоплазматическими хвостами нижестоящих эффекторов², IR и IGF1R сателлитные белки, которые известны как IRS белки, обеспечивают связывание внутриклеточных эффекторов. Кроме того, IR и IRS белки обладают общими механизмами регуляции: они активируются с помощью фосфорилирования тирозина и они негативно регулируются с помощью protein tyrosine phosphatases (PTPs), фосфорилирования серина и индуцированного лигандом подавления.

Активность IR тонко регулируется, т.к. беспрепятственная активация или инактивация д. приводить к выраженным метаболическим последствиям. Имеются две сплайс-изоформы IR, и каждая обладает разным сродством к инсулину и IGF1 (Box 1). Кроме того, имеется несколько механизмов негативной регуляции. Одним классом регуляторных белков являются tyrosine phosphatases, наиболее изученной из которых является PTP1B. PTP1B взаимодействует непосредственно с IR и дефосфорилирует важный тирозиновый остаток, редуцируя тем самым его активность. Нокауты PTP1B обнаруживают удивительную эффективность в улучшении чувствительности к инсулину in vivo путем усиления передачи сигналов инсулина³. Др. белки, такие как suppressor of cytokine signalling-1 (SOCS1) и SOCS3 (Ref. 4), growth-factor-receptor-bound protein 10 (Grb10) и plasma-cell-membrane glycoprotein-1 (PC1) подавляют функцию IR путем стерического блокирования его взаимодействия с IRS белками или путем модификации его киназной активности. SOCS белки имеют особенно важное значение, т.к. они, как было установлено, обнаруживают усиленную активность при состояниях инсулиновой резистентности, таких как тучность, и, следовательно, могут вносить вклад в патофизиологию диабета⁵. IR подавляются также с помощью стимулируемой лигандом интернализации и деградации, которые являются общим признаком для большинства резистентных к инсулину hyperinsulinaemic состояний, включая тучность и type-2 диабет⁶.

Insulin-receptor substrates. Идентифицировано, по крайней мере, 11 внутриклеточных субстратов для IR и IGF1R киназ. 6 из них принадлежат семейству IRS белков и обозначены IRS1-6 (Refs 7-11). Др. субстраты для IR/IGF1R включают Grb2-associated binder-1 (Gab1)¹², Cas-Br-M (murine) ecotropic retroviral transforming sequence homologue (Cbl)¹³ и разные изоформы Src-homology-2-containing protein (Shc)¹⁴. IRS1 и IRS2 широко распределены, тогда как IRS3 в основном ограничен адипоцитами и головным мозгом, а IRS4 экспрессируется преимущественно в эмбриональных тканях или клеточных линиях. IRS5 и IRS6, по-видимому, ограничены тканевой экспрессией и участвуют в передаче сигналов¹¹.

IRS имеют pleckstrin-homology домены (PH домены) и phosphotyrosine-binding домены (PTB домены) вблизи N конца, это объясняет высокое сродство этих субстратов к IR (Fig. 3). Центр и C конец IRS белков содержат свыше 20 потенциальных мест фосфорилирования тирозина, которые после фосфорилирования с помощью IR, соединяются с внутриклеточными молекулами, которые содержат Src-homology-2 домены (SH2 домены).

Наиболее изучены SH2 белки, которые соединяются с фосфорилированными IRS белками, это адапторные молекулы, такие как регуляторная субъединица PI3K, или адапторная молекула Grb2, которая ассоциирует с son-of-sevenless (SOS), чтобы активировать Ras-MAPK путь (rev. Ref. 15). Др. категории белков, которые соединяются с IRS белками, являются энзимы, такие как SH2-domain-containing tyrosine phosphatase-2 (SHP2)¹⁶, и cytoplasmic tyrosine kinases, такие как Fyn. Имеется также немного белков, которые соединяются с IRS белками и не содержат известных SH2 доменов. такие как calcium ATPases SERCA1 и 2 (Ref. 17), и SV40 large T antigen¹⁸. Подобно IR, способность IRS белков обеспечивать внутриклеточную передачу сигналов также регулируется с помощью действия tyrosine phosphatases. Интересно, что SHP2, который соединяется с IRS1 по двум фосфотирозиновым остаткам на его C конце¹⁶,дефосфорилирует др. фосфотирозины, которые обеспечивают связывание PI3K и Grb2.

Serine phosphorylation of IRS proteins. IRS белки подвергаются также фосфорилированию серина в ответ на инсулин и др. стимулы, включая цитокины и свободные жирные кислоты¹⁹. Имеется свыше 70 потенциальных мест фосфорилирования серина в IRS1, и в целом фосфорилирование серина, по-видимому, негативно регулирует передачу сигналов IRS. Фосфорилирование серинов IRS1 увеличивается при состояниях резистентности к инсулину и может играть роль в патогенезе резистентности к инсулину. Многие IRS киназы, такие как extracellular signal-regulated kinase (ERK)²⁰, S6 kinase²¹ и c-Jun-N-terminal kinase (JNK)²², активируются инсулином, это указывает на то, что фосфорилирование серинов в IRS белках может представлять собой механизм негативной петли обратной связи в пути передачи сигналов инсулина. Фосфорилирование серинов в IRS белках может также служить механизмом, который обеспечивает общение между сигнальными системами. Недавно было показано, что активация пути nuclear factor (NF)-kappaB ингибирует передачу сигналов инсулина путем усиления фосфорилирования серинов в IRS1 (Ref. 23).

Точные механизмы, с помощью которых фосфорилирование серинов изменяет функцию IRS1, неясны. Одним из возможных механизмов является тот, что фосфорилированные серины мешают функциональным доменам IRS1, в которых они располагаются (Fig. 3). Напр., фосфорилирование Ser307 в IRS1, который располагается в PTB домене, коррелирует с негативной регуляцией передачи сигналов инсулина²⁴. In vitro фосфорилирование этого остатка достаточно, чтобы прервать взаимодействие между IR и IRS1 в дрожжевом tri-hybrid методе²⁵. Фосфорилирование Ser270,также внутри домена PTB, как было показано, способствует взаимодействию IRS1 с 14-3-3 белками, которые м. вмешиваться в функцию PTB домена²⁶. Недавно in vivo было показано, что снижение фосфорилирования по Ser612 с помощью MAPK коррелирует с повышением фосфорилирования по Tyr608 (Ref. 27).

Хотя фосфорилирование по серину в IRS1 строго коррелирует с резистентностью к инсулину, его точная роль в патофизиологии резистентности к инсулину всё ещё до конца не понятна. Более того, всё ещё неизвестно, выполняет ли фосфорилирование серинов в др. IRS белках столь же важную регуляторную роль.

Regulation of IRS expression. IRS могут также регулироваться пониженными уровнями экспрессии белка. Hyperinsulinaemia, как известно, снижает экспрессию IRS1 и IRS2 как в модельных клеточных культурах, так и в тканях мышей²⁸. Два возможных механизма могут объяснить этот эффект. Во-первых, hyperinsulinaemia индуцирует деградацию IRS1 белка и ингибирует синтез IRS2 на транскрипционном уровне²⁸. Во-вторых, некоторые исследования показали, что SOCS белки могут индуцировать ubiquitin-обусловленную деградацию IRS1 и IRS2 (Ref. 29). Независимо от механизма, пониженные уровни IRS белков связаны с пониженными уровнями самих IR, это определенно вносит вклад в резистентность к инсулину при диабетических состояниях у грызунов и людей³⁰.

Insights from knockout studies. Хотя IRS белки высого гомологичны и обладают многими сходными мотивами фосфорилирования тирозинов, исследования нокаутных мышей и нокаутных клеточных линий показывают, что различные IRS белки выполняют скорее комплементарные, чем перекрывающиеся роли в передаче сигналов insulin/IGF1 (rev. Ref. 31) (Fig. 4). Irs1-нокаутные мыши обнаруживают дефектное действие инсулина прежде всего в мышцах и генерализованный эффект на рост тела из-за резистентности к IGF1³². Irs2-нокаутные мыши имеют более значительные дефектц передачи сигналов инсулина в печени и обнаруживают нарушения роста только в немногих тканях, таких как определенные нейроны³³ и панкреатические beta-клетки³⁴. Сходным образом на клеточном уровне Irs1-нокаутные пре-адипоциты имеют дефекты в дифференцировке³⁵, тогда как Irs2-нокаутные пре-адипоциты дифференцируются нормально, но неспособны отвечать на стимулированный инсулином транспорт глюкозы³⁶. Эти исследования нокаута явно показали, что IRS белки составляют критический узел, так что делеция каждой из изоформ имеет разные биологические последствия.

Механизмы, которые объясняют различия между IRS изоформами, в частности IRS1 и IRS2, были исследованы in vitro и in vivo. Когда были использованы small interfering RNAs (siRNAs) для снижения экспрессии IRS1 или IRS2 специфически в L6 мышечных трубках, то оказалось, что IRS1 более тесно регулирует потребление глюкозы в то время как IRS2, по-видимому, более тесно связан с активацией MAPK³⁷. Ткане-специфический нокдаун печеночных IRS1 и IRS2 с использованием аденовирусных short hairpin РНК in vivo показал, что IRS1 и IRS2 выполняют комплементарные роли по поддержанию активации AKT/PKB, но выполняют разные роли по регуляции экспрессии генов³⁸. Следовательно, пониженные IRS1 коррелируют с повышенной экспрессией генов, которые участвуют в глюконеогенезе, тогда как подавление печеночной IRS2 приводит к усилению экспрессии генов, которые участвуют в липогенезе.

Биохимические исследования выявили некоторые молекулярные механизмы, с помощью которых IRS белки могут осуществлять свои специфические эффекты. Напр., IRS1 и IRS2 отличаются по своей способности связывать различных SH2 партнеров. IRS1 может соединяться с Abl tyrosine kinase и SHP2, тогда как IRS2 нет³⁹. Кроме того, IRS1 соединяется с некоторыми SH2 белками с большим сродством, чем IRS2, включая Grb2, Crk адапторный белок и phospholipase Cγ³⁹. IRS1 и IRS2 обладают также дифференциальной способностью активировать разных членов семейства atypical protein kinase C (aPKC)⁴⁰. IRS3 и IRS4, по-видимому, модифицируют действие IRS1 и IRS2, т.к. они не могут активировать MAPK и PI3K в той же самой степени, что и IRS1 и IRS2, и могут действительно противодействовать некоторым их функциям, если экспрессируются на высоких уровнях⁴¹. Изоформы IRS-белков отличаются также по своей клеточной компартментализации⁴² и кинетике активации⁴³. Кроме того, IRS2 структурно отличается от др. IRS белков - он может соединяться с IR посредством уникального kinase-regulatory-loop связывающего домена, который может вность вклад в его специфические эффекты⁴⁴.

Энзим PI3K состоит из регуляторной и каталитической субъединиц, каждая из которых представлена несколькими изоформами (Fig. 5). Активация каталитической субъединицы зависит от взаимодействия двух SH2 доменов в регуляторной субъединице со специфическими phosphotyrosine мотивами в IRS белках в виде последовательностей (pY)MXM и (pY)XXM45. Ингибиторы PI3K или трансфекция доминантно-негативной конструкции блокируют почти все метаболические действия инсулина, включая стимуляцию транспорта глюкозы, синтез glycogen, синтез липидов и дифференцировку адипоцитов⁴⁶, это подчеркивает жизненно важную роль этого энзима в метаболических действиях инсулина (Fig. 4).

PI3K regulates insulin signalling by generating PIP3. PI3K активирует критические регуляторы передачи сигналов инсулина, катализируя формирование липидного вторичного мессенджера PIP3 в клетках (Fig. 5). Белки с PH доменами могут соединяться с PIP3 и оказываются локализованными в той же самой области, что делает возможной их активацию. Сверхсемейство AGC serine/threonine protein kinases, guanine-nucleotide-exchange белки из семейства Rho и TEC семейство tyrosine kinases отностятся к этим белкам. Вообще-то наиболее критической из AGC киназ для действия инсулина является 3-phosphoinositide-dependent protein kinase 1 (PDK1), которая ответственна за активацию AKT/PKB и aPKCs. PDK1 фосфорилирует активационную петлю AKT/PKB по Thr308 (Ref. 47) и PKCzeta по Thr410 (Ref. 48), усиливая активность этих киназ. AKT/PKB, однако, нуждается во втором фосфорилировании по Ser473 для полной активации. Т.к. PDK1 не способна фосфорилировать Ser473, поэтому было предположено существование PDK2. Недавно показано, что PDK2 для AKT/PKB может быть rapamycin-insensitive companion of mTOR (rictor)-mammalian target of rapamycin (mTOR) complex. Этот комплекс необходим для фосфорилирования Ser473 у Drosophila melanogaster и в клетках млекопитающих, включая адипоциты⁴⁹.

Позитивное действие PI3K может негативно регулироваться на уровне PIP3 с помощью phospholipid phosphatases, таких как phosphatase and tensin homologue (PTEN) и SH2-containing inositol 5'-phosphatase-2 (SHIP2), которые дефосфорилируют и инактивруют PIP3. PTEN дефосфорилирует phosphoinositides по 3'-позиции⁵⁰, в то время как SHIP2 действует на 5'-позицию. In vivo делеции PTEN улучшают чувствительность к инсулину⁵¹, тогда как роль SHIP2 противоположна⁵². Однако, недавние нокауты SHIP2 защищали мышей от индуцированной ожирением резистентности к инсулину⁵³.

Several non-redundant isoforms of the PI3K subunits. PI3K существует в виде гетеродимера, состоящего из каталитической субъединицы в 110 kDa и SH2-содержащей регуляторной субъединицы приблизительно в 85 kDa. Три разные каталитические субъединицы, p110alpha, beta and delta происходят от трех разных генов и обнаруживают разное тканевое распределение, с alpha и beta формами с почти повсеместным распределением (rev. Ref. 54) и p110delta, ограниченной лейкоцитами. Каталитическая субъединица PI3K почти всегда обнаруживается связанной с регуляторной субъединицей, т.к. свободная p110 нестабильна и быстро деградирует⁵⁵. Эта связь p110 с регуляторной субъединицей не только стабилизирует каталитическую субъединицу, но и также аллостерически ингибирует ферментативную функцию до тех пор, пока гетеродимер связан с phosphotyrosines, что деблокирует ингибирование⁵⁵. Нокауты по p110alpha и p110beta являются ранними эмбриональными леталями, это указывает на то, что каждая из этих изоформ обладает уникальной биологической функцией, которая не может быть компенсирована экспрессией др. Исследования избыточной экспрессии показали, что p110alpha может выполнять более важную роль в передаче сигналов platelet-derived growth-factor, тогда как p110beta более важен в обеспечении стимулированного инсулином потребления глюкозы⁵⁶.

Каталитическая субъединица PI3K регулирует также свою собственную функцию благодаря своей прирожденной serine-kinase активности, которая фосфорилирует регуляторную субъединицу p85alpha по Ser608 (Ref. 57). Это фосфорилирование, как известно, снижает ферментативную активность гетеродимера. Кроме того, PI3K может фосфорилировать по серину IRS1 и снижать передачу им сигналов в модельных клеточных культурах⁵⁸.

По крайней мере, идентифицировано 8 изоформ регуляторной субъединицы PI3K, которые транскрибируются с трех разных генов⁵⁹. Pik3r1 кодирует 65-75% регуляторных субъединиц в форме p85alpha, и ответственна также за продукцию сплайс-изоформ p55alpha и p50alpha. Каждый из продуктов гена Pik3r1 может экспрессироваться также с или без spliced вставки в 24 нуклеотида⁵⁹. p85alpha экспрессируется повсеместно, тогда как p55alpha и p50alpha экспрессируются преимущественно в скелетных мышцах и печени, соотв. Pik3r2 продуцирует p85beta и является почти в 20% случаев регуляторной субъединицей⁶⁰. Pik3r3 кодирует p55PIK, которая сходна по своей структуре с p55alpha, но экспрессируется на более низких уровнях в большинстве тканей.

Помимо своей роли в качестве позитивного регулятора функции PI3K, регуляторная субъединица распознается также как важный негативный регулятор действия PI3K и инсулина. Это мнение исходит из парадоксального наблюдения, что нокауты регуляторной субъединицы могут улучшать чувствительность к инсулину^60-63 и могут нормализовать диабетический фенотип мышей с генетическим ограничением IR и IRS1 (Ref. 64). Эта обратная корреляция между уровнем p85 и чувствительностью к инсулину обнаруживается также, когда регуляторная субъединица экспрессируется на более высоком. чем в норме, уровне. Напр., p85 избыточная экспрессия коррелирует с резистентностью скелетных мышц к инсулину у мышиных моделей gestational диабета⁶⁵ и связана с резистентностью к инсулину у тучных людей⁶⁶.

Negative regulation of insulin signalling by PI3K. Негативная регуляция передачи сигналов инсулина с помощью PI3K регуляторной субъединицы, как полагают, происходит за счет нескольких механизмов (Fig. 5). Одним из факторов является stoichiometry регуляторной субъедницы по отношению к каталитической в гетеродимере⁶⁴. В нормальных условиях концентрация регуляторных субъединиц является избыточной по отношению к каталитической субъединице и фосфорилированным IRS белкам. Эта каталитически неактивная мономерная p85 конкурирует с p85-p110 гетеродимером за связывание с фосфотирозинами на IRS белках. Следовательно, снижение регуляторных субъединиц может улучшить действие инсулина, т.к. оно преимущественно редуцирует p85alpha мономер и позволяет гетеродимеру соединяться с фосфорилированными IRS белками. Этот механизм. однако, не полностью объясняет негативные эффекты регуляторной субъединицы, т.к. избыточная экспрессия коротких изоформ p55alpha или p50alpha не вызывает сходного понижения в действии инсулина несмотря на сходные изменения в стоихометрии⁶⁷.

По крайней мере, два из этих механизмов, которые используют только полную длину p85, могут также помочь объяснить негативные эффекты регуляторных субъединиц. Первый использует секвестрацию и/или компартментализацию активности PI3K. Напр., было показано, что свободная мономерная p85alpha, а не др. изоформа регуляторной субъединицы, может секвестрировать IRS1, и любую ассоциированную PI3K ферментативную активность, в инертные клеточные фокусы, которые не способны генерировать PIP3 (Ref. 68).

Второй механизм связан с взаимодействием между p85 субъединицей и stress-kinase путем. Недавние исследования показали, что субъединица p85 необходима для стимулированной инсулином активации JNK. Установлено, что регуляция активности JNK обеспечивается посредством p85alpha, a не короткими Pik3r1 изоформами. JNK активность восстанавливается также с помощью доминантно негативной p85, которая не может соединяться с p110, это указывает на то, что мономерная p85 активирует JNK независимо от ее роли в качестве компонента PI3K holoenzyme⁶⁹. Недавно мы получили условные нокауты Pik3r1 в печени и нашли, что это взаимоотношение между p85alpha и JNK происходит и in vivo, и может выполнять важную роль в регуляции чувствительности к инсулину во всем теле (C.M.T., J. Luo, L. Cantley, C.R.K., unpublished observation).

Негативная регуляция, которая происходит почти исключительно с помощью p85 регуляторной субъединицы указывает на то, что функциональные различия могут происходить из структурных различий между изоформами (Fig. 5). Все изоформы регуляторных субъединиц обладают общими С концами с двумя SH2 доменами и inter-SH2 доменом, который имеет p110 связывающий домен (rev. Ref. 70). Структура субъединиц, однако, дивергирует по длине и составу их N концов. N концы p85alpha и p85beta длиной примерно в 339 аминокислот и содержат SH3 домен, два proline-rich домена и breakpoint cluster-region homology домен. p55alpha и p50alpha имеют N-концевые последовательности, которые состоят только из 34 аминокислот и 6 аминокислот, соотв.⁵⁹.

Уникальный N конец p85alpha, как было установлено, соединяется снесколькими интересными молекулами, которые могут регулировать чувствительность к инсулину, включая c-Cbl⁷¹ и малые GTPases Rac1 и cell-division cycle 42 (CDC42)⁷². Хотя эффект in vivo этих взаимодействий на чувствительность к инсулину еще не установлен перевес доказательств указывает, что p85alpha, по-видимому, имеет множество способов регуляции чувствительности к инсулину помимо ее обычной роли в регуляции каталитической субъединицы PI3K.

AKT/PKB является serine/threonine kinase, которая является нижестоящей мишенью передачи сигналов PI3K. AKT/PKB обеспечивает большинство обуславливаемых PI3K метаболических действий инсулина посредством фосфорилирования нескольких субстратов, включая и др. киназы, сигнальные белки и транскрипционные факторы (Fig. 6).

AKT/PKB targets. Glycogen synthase kinase-3 (GSK3) была первой идентифицированной физиологической мишенью для AKT/PKB⁷³. Фосфорилирование GSK3 снижает ее активность в отношении glycogen synthase, это ведет к повышению синтеза гликогена⁷⁴. GSK3 может также фосфорилировать некоторые др. субстраты и участвует во многих процессах помимо регуляции синтеза гликогена⁷⁴.

AKT/PKB, по-видимому, регулирует потребление глюкозы путем фосфорилирования и ингибирования Rab-GTPase-activating белка, AS160 (for AKT substrate of 160 kDa)⁷⁵. Это запускает активацию Rab малых GTPases, которые вовлекаются в реорганизацию цитоскелета, что необходимо для транслокации транспортера глюкозы GLUT4 в плазматическую мембрану. AKT/PKB также фосфорилирует и ингибирует tuberin (известный также как tuberous sclerosis complex-2, TSC2), который в комплексе с hamartin (TSC1)⁷⁶. Т.к. этот комплекс ингибирует регулятор роста mTOR, то негативная регуляция TSC1/2 с помощью AKT/PKB эффективно активирует путь mTOR. mTOR ассоциирует с raptor и др. белками и регулирует синтез белков путем фосфорилирования белков p70 рибосомальной protein S6 kinase и эукариотического translation initiation factor 4E binding protein-1 (Ref. 76).

AKT/PKB регулирует также экспрессию gluconeogenic и lipogenic энзимов, контролируя активность транскрипционных факторов классов winged helix или forkhead (FOX). Семейство FOX содержит свыше 100 членов и некоторые из них критические для действия инсулина⁷⁷. Напр., FOXO1 активирует gluconeogenic гены в печени⁷⁸ и ингибирует адипогенез⁷⁹, a insulin обращает эти эффекты посредством AKT/PKB, которая фосфорилирует Foxo1 по Ser256. Это событие ведет к взаимодействиям с 14-3-3 белками и секвестрации в цитоплазме⁷⁷. То же самое верно и для Foxa2, который является критическим регулятором липидного метаболизма при голодании. AKT/PKB-обеспечиваемое фосфорилирование Thr156 в Foxa2 предупреждает его ядерную локализацию и транскрипционную активность⁸⁰.

Complex regulation of AKT/PKB. AKT/PKB активность регулируется с помощью нескольких ингибирующих молекул, включая энзимы, подобные protein phosphatase-2A (PP2A) и PH-domain leucine-rich repeat protein phosphatase (PHLPP), которые непосредственно дефосфорилируют и деактивируют AKT/PKB^81,82. Др. регуляторы, такие как tribbles-3 (TRB3), соединяются с не фосфорилированной AKT/PKB и ингибируют ее фосфорилирование и активацию in vivo⁸³. Уровни TRB3увеличиваются у голодающих мышей, а избыточная экспрессия TRB3 увеличивает печеночную продукцию глюкозы. Напротив, RNAi-обусловленное подавление TRB3 улучшает чувствительность к инсулину⁸⁴.

Divergent functions of the three AKT/PKB isoforms. AKT/PKB имеет три изоформы у млекопитающих, каждая кодируется самостоятельным геном (AKT1-3, известны также как PKB alpha, beta и gamma; Fig. 6). Эти изоформы обладают в общем то одной и той же структурой, которая состоит из N-терминального PH домена и С-терминального каталитического домена, оба с высокой степенью идентичности. Несмотря на это последние данные по нокауту мышей и siRNA показывают, что изоформы участвуют в регуляции разных биологических процессов. Делеция AKT1 приводит к задержке роста и уменьшению продолжительности жизни⁸⁵, но не вызывает метаболических аномалий⁸⁶. Напротив, AKT2-дефицитные мыши обнаруживают резистентность к инсулину и диабет в результате, по крайней мере, частичной неспособности инсулина индуцировать утилизацию глюкозы и снижения продуцкции глюкозы печенью⁸⁷. Соотв. и мутации в киназном домене AKT2 вызывают тяжелую резистентность к инсулину и диабет у людей⁸⁸. AKT3, с др. стороны, по-видимому, не играет роли в гомеостазе глюкозы, но оказывает существенные эффекты на нейральное развитие⁸⁹.

Специфичность действия разных изоформ AKT/PKB возникает в результате различий в их тканевом распределении, субклеточной локализации и в нижестоящих мишенях. Относительные соотношения экспрессии трех изоформ варьируют существенно в разных тканях. AKT3 преимущественно экспрессируется в нервной системе и тестисах, тогда как AKT1 и AKT2 распределены широко, с AKT2 особенно богатой в тканях, чувствительных к инсулину, таких как печень и жир⁹⁰. Исследования, проведенные на адипоцитах от Akt2 нокаутных животных, показали, что стимулируемое инсулином потребление глюкозы сильно снижено и не может быть компенсировано избыточной экспрессией AKT1 (Ref. 91). При siRNA-based подходе в 3T3-L1 адипоцитах также выявлена первичная роль AKT2 на чувствительность к инсулину адипоцитов⁹². Интересно, что AKT2 обнаружена совместно с GLUT4-содержащими пузырьками, свойство, не характерное для AKT1 и AKT3 (Ref. 93). Более того, Synip, белок, который регулирует прикрепление и слияние GLUT4-содержащих пузырьков, фосфорилируется с помощью AKT2, но не AKT1 или AKT3 (Ref. 94). Т.к. основные структурные различия между изоформами AKT обнаруживаются в домене PH⁹⁵, то может предположить, что др. мишени AKT должны также обнаруживать специфичность к изоформам, исходя из различий в связывании их PH доменов с разными фосфолипидами или др. партнерами по связи.

IR/IRS, PI3K и AKT/PKB сигнальные узлы являются 'critical nodes' т.к. они удовлетворяют всем критериям для критических узлов, включая достаочное количество доказательств in vitro и in vivo. Ниже мы представим некоторые др. молекулы, которые участвуют в действии инсулина. Хотя они и обладают некоторыми характеристиками для критических узлов, но необходимы дальнейшие эксперименты, чтобы определить их действительную роль в сигнальной сети и чтобы определить действительно ли они являются настоящими критическими узлами.

aPKCs and glucose transport. Вместе с активацией AKT/PKB важным нижестоящим эффектором PI3K в обеспечении метаболических эффектов инсулина является новая PKCs, aPKCs не чувствительна ко вторичным мессенжерам calcium или diacylglycerol (DAG). Являясь членом сверхсемейства AGC, то и механизмы действия aPKCs сходны с AKT/PKB, это необходимость в PIP3 и фосфорилирование с помощью PDK1 (Ref. 96). aPKCs, как было показано, выполняет роль в стимулированном инсулином потреблении глюкозы и транслокации GLUT4 в адипоциты и мышцы⁹⁷. Снижение активации aPKCs описано в мышцах грызунов и людей с type-2 диабетом, в то время как активация AKT/PKB может оставаться неизменной⁹⁸. aPKCs участвует также в регуляции липидного синтеза в печени за счет повышения уровня экспрессии sterol-regulatory-element binding protein-1c⁹⁸.

Изоэнзимы aPKC lambda и zeta кодируются двумя разными генами и их уровни экспрессии варьируют. PKClambda является основной aPKC в скелетных мышцах и адипозной ткани мышей, тогда как PKCzeta наиболее многочисленна у крыс, обезьян и людей⁹⁷. Высокий уровень позитивной и негативной регуляции этих киназ и роль, кодорую эти белки играют в действии инсулина, указывают на то, что они могут формировать критический узел в передаче сигналов инсулина. Однако, in vitro эксперименты по реконструкции показали, что обе изоформы могут функционировать взаимно заменяя др. др., чтобы поддерживать стимулированный инсулином транспорт глюкозы⁹⁷. Ткане-специфические нокауты различных изформ aPKC могли бы пролить свет на относительную роль этих генов.

The Ras-MAPK pathway. Путь Ras-MAPK активируется с помощью инсулина благодаря связыванию Grb2 и guanyl nucleotide-exchange фактора SOS, чтобы распознавать фосфотирозины на IRS белках Shc и Gab1. Это связывание запускает активацию малой GTPase Ras и последующую активацию Raf, которая запускает киназный каскад, приводящий к фосфорилированию и активации dual-specificity kinases MEK1 (MAPK и ERK kinase 1) и MEK2, которые в свою очередь фосфорилируют MAPK/ERK1 и ERK2 по threonine и tyrosine остаткам. Активированные ERKs фосфорилируют различные мишени, включая p90 ribosomal protein S6 kinase (p90RSK) и транскрипционный фактор Elk1, способствуя тем самым экспрессии генов⁹⁹. Путь Ras-MapK в основном используется для обеспечения клеточного роста, выживания и дифференцировки клеток. Хотя и было постулировано, что ERK1 и ERK2 имеют сходные функции, а ERK2 способна компенсировать потерю ERK1 у Erk1 нокаутных мышей¹⁰⁰, ERK1, как было показано, специфически необходима для адипогенеза in vitro и in vivo¹⁰¹. ERK1 и ERK2 участвуют также в негативной петле обратной связи действия инсулина путем фосфорилирования IRS1 по сериновым остаткам²⁰. Следовательно, хотя ERK1 и ERK2 и обладают некоторыми признаками критических узлов, предварительные данные in vivo указывают на то. что эти киназы могут быть необходимы только для таких аспектов действия инсулина, как рост и дифференцировка, а не для др. метаболических эффектов.

Так, со многими компонентами сигнальной сети и Ras и Raf киназы встречаются в нескольких изоформах. Три изоформы Ras, H-Ras, N-Ras и K-Ras экспрессируются повсеместно. Разные липидные якоря на трех изоформах Ras обладают потенциалом направлять их в разные условия и разные сигнальные комплексы¹⁰². Также p85/p110-PI3K комплекс соединяется с Ras, связывая два пути, которые обычно рассматриваются самостоятельными¹⁰³. Raf белки также представлены тремя изоформами: A-Raf, B-Raf и C-Raf, которые регулируются дифференциально¹⁰⁴. Хотя все они способны активировать MAPK, имеются различия в продолжительности или интенсивности активации, что может влиять на клеточную реакцию¹⁰⁴. Однако, не выявлено дифференциального влияния на действие инсулина.

Rho family of GTPases. Малые GTPases семейства Rho, Rac и CDC42, также влияют на действие инсулина. Две изоформы Rac (1 и 2) кодируются двумя отдельными генами¹⁰⁵, тогда как две изоформы CDC42 возникают в результате альтернативного сплайсинга¹⁰⁶. И Rac и CDC42 активируются с помощью замены GDP на GTP, это запускает конформационные изменения, которые индуцируют взаимодействие GTPases с нижестоящими эффекторами, многие из которых участвуют в перестройке актинового цитоскелета. Это свойство, как полагают, связывает Rac с транслокацией GLUT4 в скелетных мышцах¹⁰⁷, тогда как CDC42 может выполнять подобную роль в адипоцитах¹⁰⁸.

Stress-activated p38 MAPK and JNK. Три JNK-кодирующих гена (JNK1-3) описаны у млекопитающих, каждый из которых с несколькими сплайс-вариантами. JNK1 и JNK2 экспрессируются повсеместно, тогда как экспрессия JNK3 ограничена нервной тканью¹⁰⁹. Инсулин активирует JNK1 и JNK2 в разных клеточных системах²². Как уже упоминалось, активация JNK может негативно регулировать передачу сигналов инсулина путем фосфорилирования серина в IRS1. Интересно, что активность JNK обнаружена повышенной при состояниях резистентности к инсулину, включая ожирение и воспаление, а делеция JNK1, но не JNK2, улучшает чувствительность к инсулину у тучных мышей²⁴, это указывает на роль в патофизиологии болезни.

p38 MAPK is also an intracellular target of insulin. 4 сплайс-варианта p38 семейства (p38alpha, beta, gamma и delta) обнаруживают 60% идентичность и имеют разное тканевое распределение, с p38alpha и beta экспрессирующимися повсеместно¹¹⁰. Некоторые исследования показали, что p38 MAPK активация необходима для полной транслокации GLUT4¹¹¹, однако, активация p38 MAPK описана также в противоположной роли в отношении экспрессии GLUT4 в разных тканях¹¹². Действительно ли инсулин влияет дифференциально на активацию разных изоформ p38 MAPK, и действительно ли эти варианты специфчески модулируют самостоятельные клеточные процессы, неизвестно.

The CAP-Cbl pathway. Прото-онкоген c-Cbl фосфорилируется по тирозину с помощью IR, и формирует комплекс с др. молекулами, такими как Cbl-associated protein (CAP), который приводит в результате к активации малой GTPase TC10 (Ref. 13). Было предположено, что CAP-Cbl путь сотрудничает с PI3K путем в отношении стимуляции транслокации GLUT4¹¹³, хотя это всё ещё спорно. Семейство Cbl содержит три члена c-Cbl, Cbl-b и Cbl-3 , которые играют роль в ubiquitylation рецепторных тирозин киназ¹¹⁴. Интересно, что, c-Cbl-дефицитные мыши обнаруживают улучшенную чувствительность к инсулину, которая ассоциирует с пониженной adiposity и более высокой тратой энергии¹¹⁵. Необходимы дальнейшие исследования для определения роли Cbl белков в действии инсулина

As our understanding of the genome and proteome grows, so does the complexity of cell-signalling networks, which underscores the importance of establishing a framework to define the critical nodes in the system, and their roles in the network. The insulin-signalling network illustrates well the concept of critical nodes, as the molecular relationships between many of its components have been validated using genetic and biochemical approaches in vitro and in vivo. These studies demonstrate the essential features of a critical node. Critical nodes consist of several molecular isoforms that are involved in divergent signalling, they are highly regulated (both positively and negatively), they are essential for the biological actions of the ligand, and in many cases, they are points of crosstalk with other signalling systems. These nodes allow for the incredible diversification and fine-tuning of insulin's signal in normal physiology and disease states.

The main challenge to validating the critical nodes of other ligand–receptor systems is the in vivo elucidation of the exact roles of each component. Genetic techniques, such as knockout by homologous recombination, provide one approach to uncovering the unique biological functions of different signalling isoforms. The use of RNAi might also enable the rapid assessment of gene-isoform function and regulation, both in vitro^116,117 and in vivo^38,118, as could other emergent knockout techniques¹¹⁹. In this manner, critical-node analysis is not only helpful in understanding insulin signalling, but will also be a broadly useful concept in dissecting the biological effects of all receptor–ligand-mediated processes.