Insulators: exploiting transcriptional and epigenetic mechanisms
Miklos Gaszner and Gary Felsenfeld Nature Reviews Genetics 7, No.9, P. 703-713 (September 2006) | doi:10.1038/nrg1925
Insulators are DNA sequence elements that prevent inappropriate interactions between adjacent chromatin domains. One type of insulator establishes domains that separate enhancers and promoters to block their interaction, whereas a second type creates a barrier against the spread of heterochromatin. Recent studies have provided important advances in our understanding of the modes of action of both types of insulator. These new insights also suggest that the mechanisms of action of both enhancer blockers and barriers might not be unique to these types of element, but instead are adaptations of other gene-regulatory mechanisms.
Рис.1. | Testing for enhancer-blocking insulator function.
Рис.2. | Insulator-body formation and enhancer blocking are closely correlated in Drosophila melanogaster.
Lei, E. P. & Corces, V. G. RNAi machinery influences the nuclear organization of a chromatin insulator. Nature Genet. 23 July 2006 (doi: 10.1038/ng1850)
Изучение активности инсуляторов позволило открыть новую роль для RNAi кухни (machinery) в организации структуры хроматина.
Мобильный элемент gypsy Drosophila melanogaster широко используется для изучения функции инсулятора благодаря своей способности заслонять гены от энхансеров, когда но вставляется между ними. gypsy рекрутирует белковый комплекс, который, как полагают, способствут образованию структур хроматина высшего порядка, которые и препрятсвуют встерче энхансеров и промоторов.
"This study adds the control of chromatin architecture to the growing list of skills of the RNAi machinery."
Lei and Corces идентифицировали предположительно RNA helicase, Rm62, в качестве нового компонента gypsy инсуляторного комплекса, который взаимодействует с др. компонентами только в присутствии молекулы РНК. Rm62 является существенным для dsRNA-обусловленного молчания у мух, что создает потенциальную связь между путем RNAi и функцией инсулятора.
Чтобы оценить функциональное значение своей находки авт. тестировали эффекты мутирования или Rm62 или др. компонентов RNAi-пути на инсуляторную способность gypsy. Rm62 мутации увеличивали инсуляторную активность, указывая тем самым, что кодируемая геликаза каким-то образом ингибирует функцию gypsy. Напротив, мутации в piwi и aubergine — которые кодируют Argonaute белки, необходимые для RNAi-индуцированных модификаций хроматина - вызывали противположный эффект. Анализ эпистаза с использованием комбинаций этих мутаций показал, что два белка Argonaute функционируют иерархически выше Rm62 в общем пути.
Как может RNAi machinery физически влиять на функцию инсулятора? Мутации в piwi, aubergine и Rm62 не оказывают влияния на хромосомную локализацию белков комплекса gypsy, что исключает участие в рекрутировании. Однако, они обнаруживали влияние на организацию высшего порядка инсуляторного комплекса, который обычно формирует фокусы, известные как инсуляторные тельца. Piwi и aubergine необходимы для формирования этих комплексов, в то время как Rm62 , по-видимому, негативно регулирует их накопление.
Это исследование усложняет контроль архитектуры хроматина, добавляя к списку RNAi machinery. Как в точности Rm62 осуществяет свои противоречивые роли нуждается в дальнейшем исследовании.
Организация геномов эукариот обязательно приводит к близости доменов с различающимися функциями. Домен, содержащий гены, которые транскрипционно активны в определенных типах клеток, могут располагаться вблизи к др. домену, содержащему гены. которые неактивны. В др. месте активный ген может быть окружен постоянно молчащими хроматиновыми структурами. До некоторой степени, качественные особенности этих доменов поддерживаются с помощью классических транскрипционных регуляторных элементов, таких как , and (UASs). В др. случаях , однако, специфические последовательности ДНК и ассоциированные с ними связывающие белки, играют роль в установлении или поддержании дискретных внутридоменовых границ. Последовательности таких элементов были названы insulators.
В некоторых случаях эндогенные сайты инсуляторов, как было показано, выполняют важные функции по регуляции генной экспрессии. Большая часть знаний об инсуляторах, однако, получена в экспериментах с трансгенными конструкциями. Большинство трансгенов у Drosophila затрагиваются с помощью эндогенных энхансеров и сайленсеров, как результат комбинированных эффектов крупного эухроматического генома и метода доставки трангена1. Напротив, большинство трансгенов у позвоночных являются объектом обусловленного хроматином молчания, как отражение высокого содержания гетерохроматина в геноме. Биохимические активности, которые лежат в основе защиты от этих двух типов регуляторного вмешательства, различны, а элементы, которые участвуют носят разные имена: те, которые защищают от активации с помощью энхансеров известны как , тогда как те, что защищают от обусловленного гетерохроматином молчания известны как 2. Некоторые компаундные инсуляторы обладают обоими и энхансер-блокирующей и барьерной активностями, а энхансер блокирующие инсуляторы защищают также от определенных типов транскрипционных репрессоров.
Многие недавние исследования были посвящены идентификации и характеристике инсуляторов. Среди причин такой активности является недавний сдвиг в пользу транскрипционного контроля генной экспрессии с помощью соседних регуляторных элементов для распознавания роли дальнодействующих взаимодействий и трехмерной организации хроматина внутри ядра. Инсуляция проявилась также как основной механизм эпигенетического контроля генной экспрессии, особенно в . Исследования инсуляторов привели к новым моделям способа их действия. Эти исследования подтвердили также, что оба типа инсуляторных элементов эксплуатируют функцию др. регуляторных элементов в ядре. Это привело к предположению, что установление различий между различными регуляторными элементами у эукариот может быть слишком ограничивающим из-за того, что все такие элементы - enhancers, silencers, promoters и insulators - используют общий набор стратегий, чтобы регулировать транскрипцию, с существенным перекрыванием функций.
Enhancer-blocking elements
Энхансеры обычно расположены на некотором расстоянии выше или ниже генов, которые они регулируют, и служат для увеличения уровня базовой транскрипции с этого гена. Энхансер-блокирующие инсуляторы определяются по их способности вмешиваться в энхансер-промотор взаимодействия, если помещаются между этими двумя, но не с фланкирующих позиций (Fig. 1). Энхансер-блокирующие инсуляторы первоначально принимали за редко встречающиеся, но недавние результаты, особенно на позвоночных, показали, что блокирование энхансеров выполняет критическую роль в широком круге регуляторных систем.
Loop domains: a common theme in enhancer blocking. Хотя разные ДНК связывающие последовательности и ассоциированные с ними белки участвуют в блокировании энхансеров у позвоночных и беспозвоночных, очевидно, что сходные механизмы энхансер-блокирующей функции возникают у обоих: во всяком случае, энхансер-блокирующие элементы могут взаимодействовать др. и др. или прикреплять хроматиновые волокна к структурным элементам внутри ядра и тем самым устанавливать chromatin loop домены, в которых энхансер и промотор разделены.
Большинство ранних работ, которые определяли свойства энхансер-блокирующих инсуляторов, проведено на Drosophila с использованием gypsy ретротранспозона, которые стали ключевой экспериментальной парадигмой для таких инсуляторов. Инсерция этого элемента in vivo в кластер энхансеров локуса выявила эффективный блок действия всех энхансеров, которые располагаются дистальнее инсерции, не затрагивая при этом какой-либо из энхансеров, которые более проксимальны к промотору3. Последующая работа показала, что последовательности ДНК, которые существенны для энхансер-блокирующего эффекта gypsy содержат кластер для 12 связывающих сайтов для белка Suppressor of Hairy wing . Этот белок в свою очередь связывает два др. (POZ-доменовых белка и 4, и этот комплекс взаимодействует также с ubiquitin ligase Topoisomerase-I-interacting белком (), который связан с ядерной оболочкой (lamina)5. Т.к. следствием некоторых из этих или всех этих взаимодействий, gypsy элементы, которые локализованы на удаленных хромосомных позициях, сходились вместе. чтобы сформировать кластеры - insulator bodies - которые располагаются на периферии ядра6, 7 (Fig. 2). Было предположено, что самостоятельные домены, которые создаются с помощью этого механизма разделяют энхансер и промотор, когда сайт gypsy располагается между ними и каким-то образом вмешивается во взаимодействие энхансер-промотор. Важно, что локализация кластеров на периферии ядра не является существенной для энхансер-блокирующей активности8,9. Это согласуется с идеей, что Su(Hw)-обусловленное формирование loop-домена является критическим событием; локализация инсуляторных телец может быть менее важной.
Парные элементы scs/scs', которые фланкируют эндогенный Hsp70 (heat-shock protein 70) локус в цитологической позиции 87A7, являются др. хорошо известной системой инсуляторов у Drosophila которая обеспечивает поддержку важную для loop доменов10,11. Белки (Zeste-white 5, известный также как Deformed wings)12 и A и B изоформы BEAF32 (boundary-element-associated factor of 32 kD)13 соединяются с scs и scs', соотв. Две BEAF32 изоформы образуют гетерокомплексы на scs' in vitro14, a взаимодействие между BEAF32 и Zw5, как было показано, стабилизирует образование loop-домена на противоположных концах 87A7 hsp70 локуса in vivo15. Образование хроматиновой петли, которая обеспечивается с помощью scs/scs', сходно с тем, что наблюдается с Su(Hw), оно, , по-видимому, ответственно за энхансер-блокирующую активность этих элементов.
Существуют ли сходные структуры, генерируемые энхансер-блокирующими инсуляторами у позвоночных? Первый энхансер-блокирующий инсулятор у позвоночных был идентифицирован как cHS4, сложный элемент, который комбинирует энхансер-блокирующую активность и барьерную активность и располагается на 5' конце локуса β-globin кур16,17 (Fig. 3). Полная энхансер-блокирующая активность этого элемента ассоциирована со строгим сайтом связывания для , повсеместно экспрессируемого белка цинковые пальчики позвоночных18,19. Это породило интерес к идентификации др. сайтов связывания для CTCF и понимания основ его функции.
К счастью, одно из первых исследований по поиску др. CTCF связывающих сайтов выявило роль CTCF энхансер-блокирующей активности в известной регуляторной системе, импринтируемом (insulin-like growth factor 2)- локусе. В эмбриональной ткани Igf2 экспрессируется только с отцовского аллеля под контролем нижестоящих энтодермальных энхансеров, и экспрессия коррелирует со специфичным для отцовского аллеля метилированием CpG поверх imprinted control region (ICR), которая расположена между энхансерами и Igf2 промотором. В геноме мышей и людей ICR содержит множественные CTCF-связывающие сайты, которые функционируют как инсулятор, а paternal-специфическое метилирование этих сайтов устраняет как CTCF связывание, так и инсуляторную активность, что делает возможной импринтированную экспрессию Igf2 (Refs 20-22). Эти результаты выяснили роль энхансер-блокирующих инсуляторов в регуляции эндогенных локусов, которая теперь продемонстрирована для многих др. сайтов23-26.
Что является молекулярной основой инсуляторной активности CTCF? Та же самая модель, что была предложена для Su(Hw) у Drosophila скорее всего приложима и здесь: CTCF молекулы могут взаимодействовать др. с др., чтобы сформировать кластеры и следовательно сгенерировать закрытые loop домены27. Было предположено, что CTCF может также прикреплять хромтиновое волокно к поверхности ядрышка посредством взаимодействий с ядрышковым белком (известным также как B23). Это д. приводить к созданию 'открытых' loop доменов, в которых CTCF сайты контактируют с поверхностью ядрышка, но не др. с др. Такая модель подтверждается находкой, множественные копии, стабильно интегрированных cHS4 трансгенов локализуются на поверхности ядрышка CTCF-зависимым способом. Следует подчеркнуть, что важным свойством этой модели энхансер-блокирующих инсуляторов является способность позиционировать энхансер и промотор в отдельные домены.
Как инсулятором индуцированные домены предупреждают действие энхансера? Для этого необходимо знать, как работают энхансеры и vice versa. Пока трудно объяснить позиционную зависимость энхансер-блокирующих инсуляторов: в отличие от сайленсеров, они осуществляют свой эффект только, если они расположены между промотором и энхансером. Модель обусловленного инсулятором loop-домена привела к двум возможным объяснениям причины этой позиционной зависимости, каждая базируется на специфической модели действия энхансеров (Fig. 4). Во-первых, энхансеры могут функционировать благодаря непосредственному взаимодействию с предназначенными для них промоторами (модель непосредственного контакта). В этом случае энхансер-блокирующие инсуляторы м. оказывать стерический эффект, которые предупреждает энхансеры от контакта со др. промоторами, или за счет предпочтительных intra-loop взаимодействий энхансер-промотор или за счет предупреждения inter-loop контактов. Альтернативно, д.быть активирующий сигнал, который перемещается processively от энхансера к промотору (tracking модель действия энхансера). Этим сигналом может быть , напр., helicase complex, который модифицирует гистоны или меняет структуру или он может быть собственно RNA polymerase, запускаемой энхансером. Этот сигнал может быть блокирован энхансер-блокирующим инсулятором как только он попытается пересечь нуклеопротиновую структуру в основании петли, которая генерируется инсулятором. Обширная литература касается механизма действия UASs и энхансеров28,29. Существуют доказательства как для прямого контакта, так и tracking моделей действия энхансеров, которые не являются взаимоисключающими.
Хотя довольно просто посмотреть, как намечающий путь (tracking) сигнал может быть остановлен комплексом инсулятора, труднее визуализовать, как, как формирование пути хроматина может повлиять на непосредственный контакт между энхансером и промотором. Описан потенциальный механизм в исследованиях прямого контакта между Escherichia coli промотором glnAp2 (нижестоящем промоторе гена, который кодирует glutamine synthetase, ) и энхансером, который зависит nitrogen-regulation белка (известного также как GlnG), которые разделены 2.5 kb на закрытой циркулярной суперскрученной (supercoiled) матрице30,31. Экспрессия ингибировалась, когда матрица была расслаблена (relaxed) или когда lac репрессор, , соединялся с сайтами, которые присутствовали на любой из строно элементов, димеризовались, чтобы поместить энхансер и промотор в отдельные петли. Данные подтверждают модель, согласно которой действие энхансера зависит от прямого контакта между энхансером и промотором, который достигается за счет скользящего механизма, в котором заплетенная суперспираль использует различные конформации до тех пор, пока не будет достигнут контакт. Реляксация или фиксация структуры ДНК с помощью LacI взаимодействий, как полагают, предупреждает такой контакт. Был предложен родственный механизм для эукариот благодаря исследованию, которое использовало SV40 минихромосому, несущую энхансер и энхансер-блокирующие элементы32.
Enhancer blocking and chromatin hubs. Эта традиционная точка зрения на взаимодействия энхансер-промотор с помощью непосредственного контакта, фокусируется на регуляции одиночных генов, она нуждается в модификации в свете недавно предложенной модели по регуляции экспрессии генов у эукариот33,34. Исследования, которые первоначально были проделаны на локусах beta-globin мышей и людей, показали, что два промотора, gene-proximal энхансеры и far-upstream активаторы - которые могут быть разделены многими т.п.н. - стремятся ко-локализоваться внутри ядер в т. называемые хроматиновые центры (hubs). Гены, которые контролируются этими элементами, транскрибируются, когда hubs осуществляют контакт с молекулами RNA polymerase II, которые распределены в виде мультимолекулярных агрегатов34,35 внутри ядра, которые формируют 'фактории' для транскрипции, В недавних исследования. взаимодействия, которые даже наиболее удаленные, выявляются в таких факториях как внутри, так и между хромосомами34,36,37.
Как активные промоторы находят свой путь к этим hubs? Хотя они могут делать это просто с помощью процесса случайных контактов на большие расстояния (непосредственные контакты), West and Fraser38 предположили, что удаленные энхансеры и промоторы м. встречаться посредством действия RNA polymerase в ходе транскрипции межгенных регионов, которые расположены между энхансером и промотором. Межгенные транскрипты, которые впервые были описаны несколько лет тому назад39,40, хорошо задокументированы; с этой новой точки зрения они являются побочными продуктами механизма, который делает возможным контакт между промоторами и даже очень удаленными энхансерами.
Т.к. полимераза фиксирована в фактории, то она д. притягивать промотор по мере того как он транскрибируется, в противоположность более простым tracking моделям, в которых polymerase движется свободно вдоль ДНК от энхансера к промотору. Во всяком случае присутствие энхансер-блокирующего инсулятора может вмешиваться в tracking или архитектуру хроматинового hub в варианте модели прямого контакта.
Модель, которая описана выше, является единственным примером более общего класса прокладывающего курс (tracking) механизма, который можно вообразить. Вариант, который обсуждается в др. месте41 предполагает роль Drosophila белка в стабилизации связывания определенных гомеодоменовых белков с распределенными сайтами в области между промотором и энхансером, в создании кластеров, которые сводят энхансеры и промоторы вместе42,43. Было предположено, что Su(Hw) сайты д. вмешиваться в этот процесс. Было подчеркнуто41, что процесс образования кластеров может быть processive, чтобы объяснить свойства энхансер-блокирующего инсулятора Su(Hw). Наилучшим прямым доказательством для tracking является исследование CTCF. Этот инсуляторный белок может блокировать продвижение RNA polymerase II, как это было показано с использованием стабильно реплицирующихся минихромосом, которые несут cHS4 инсулятор: полимераза накапливается выше и внутри инсулятора44.
Challenges to simple models of enhancer-blocking action. Неизвестно, существуют ли hubs у Drosophila, но более общие tracking и direct-contact модели, которые обсуждены выше, всё ещё приложимы. Обе эти возможности, однако, по-видимому, слишком упрощены, т.к. ни одна не может объяснить все свойства элемента gypsy. Напр., tracking модель противоречит тому факту, что gypsy элементы, которые вставляются в интрон yellow эффективно блокируют активацию с помощью энхансера, который расположен значительно ниже, но не мешает действию энхансера, который располагается выше промотора (Fig. 5a). Если закрепляющий комплекс всегда блокирует, то трудно увидеть, почему он не блокирует образование транскриптов yellow на этих стадиях развития, на которых вышестоящие энхансеры активны. Единственная возможность заключается в том, что polymerases, которые происходят из энхансеров, более легко блокируются чем те, что инициируются на промоторах; в подтверждение этому было показано, что инсуляторная сила элемента gypsy обратно пропорциональна силе вышестоящего энхансера45.
Вторая трудность как для tracking, так и для direct-contact моделей заключается в ограниченном наблюдении, что если два элемента gypsy вносятся тандемно, то энхансер-блокирующая активность сводится к нулю46,47 (Fig. 5b). Было предположено, что соседние кластеры Su(Hw)-связывающих сайтов взаимодействуют др. с др., чтобы сформировать микро-петлю, и тем самым предупредить их от взаимодействия с более удаленными сайтами, чтобы сформировать крупный петлевой домен. Неясно, однако, почему такая микро-петля не формирует эффективный блок против tracking polymerase. Неясно это и в терминах direct-contact модели, почему такая микро-петля не может присоединять кластер из др. сайтов gypsy, чтобы поддержать доменовую организацию. Ситуация ещё больше осложняется находками, что инсерция третьего элемента gypsy между энхансером и промотором восстанавливает энхансер-блокирующую активность в некоторых случаях, но не в др.48,49. По крайней мере, в случае gypsy, др. структуры или компоненты д. вовлекаться в установку активного инсуляторного сайта.
Должны ли существовать предполагаемые механизмы действия энхансер-блокирующих инсуляторов, которые описаны выше, как результат интерференции с определенными типами репрессорной активности, а также с активностями, которые стимулируют генную экспрессию? Модели, которые были предположены, могли бы объяснить функции этих репрессоров, у которых дистальный сайленсер имеет непосредственный контакт с промотором, способным (напр.) высвобождать histone deacetylase. У позвоночных, однако, преобладание замалчивающих активностей возникает дифференциально - из-за экспансии гетерохроматина в окружающие области. Такого типа молчание не затрагивается энхансер-блокирующими инсуляторами, но предупреждается с помощью барьерных инсуляторов.
CTCF - a context-dependent enhancer-blocking insulator? Учитывая, что CTCF часто связывается с областями генома, которые соседствуют с сайтами связывания для др. регуляторных факторов, не будет неожиданностью, если его функция окажется контекст зависимой. Подобно многим регуляторным белкам, CTCF является также мишенью модификаций, которые могут затрагивать его свойства. Напр., он может быть poly(ADP-ribosyl)ated, a ингибирование этой модификации нарушает его способность функционировать в качестве инсулятор50. Важно, что CTCF может также функционировать как классический транскрипционный фактор, хотя это поведение, по-видимому, ограничено определенными сайтами (напр., Ref. 51). Т.к. CTCF является 11-zinc-finger белком, для которого разные сайты связывания в ДНК используют разные субнаборы пальчиков52, с потенциалом экспозиции разных регуляторных поверхностей на CTCF, то его стимулирующий эффект на транскрипцию может быть не связан с его энхансер-блокирующей функцией. С др. стороны, вполне возможно, что при некоторых условиях способность CTCF формировать или вступать в хромосомные кластеры, может позволить ему приводить промоторы в тесную близость к активным транскрипционным hubs. Это открывает возможность, что энхансер-блокирующая активность является единственным проявлением более общих механизмов, которые сводят гены и регуляторные элементы вместе на мульти-компонентных сайтах внутри ядра.
Barrier elements
Барьерные инсуляторы защищают от position-effect variegation (PEV), который является стохастическим, мета-стабильным и наследуемым молчанием эухроматинового гена за счет расширения образования гетерохроматина (Fig. 6). Барьерные элементы были изолированы у нескольких организмов (список см. Ref. 41), a недавние исследования привели к более детальному пониманию их молекулярных активностей, которые проливают свет на клеточные механизмы, которые используются для поддержания эпигенетических характеристик хроматиновых доменов.
Heterochromatin and euchromatin. Барьерная активность может обсуждаться только в контексте гетерохроматина и эухроматина. Биохимически гетерохроматин более конденсированная форма хроматина, что демонстрируется его пониженной чувствительностью к перевариванию нуклеазами, что отражает позиционирование нуклеосом на регулярных коротких интервалах. Характерные гистоновые модификации, которые видны в гетерохроматиновых областях, являются высокими уровнями метилирования гистона H3 по Lys9 (H3K9) и Lys27 (H3K27) остаткам, в комбинации с отсутствием признаков ацетилирования; гетерохроматин также характеризуется присутствием heterochromatin protein 1 (HP1). Гетерохроматиновая ДНК у позвоночных, также как и у растений, также обнаруживает обширное метилирование CpG.
Недавние успехи пролили свет на биохимию инициации и поддержания гетерохроматиновых структур (Ref. 53). В центре обоих процессов находится бессменный цикл реакций: метилирование H3K9 ведет к HP1-обусловленному рекрутированию активности дополнительной histone methyltransferase (HMT). Описаны два пути для достижения образования гетерохроматина. Первый нацелен на метилирование H3K9 в элементах повторяющихся последовательностей, используя молекулы малых РНК, которые являются комплементарными мишеням54. Второй касается сиквенс-специфических ДНК-связывающих белков для доставки активности HMT к специфическим местам генома55. Тот же самый биохимический цикл используется для объяснения распространения гетерохроматина: метилирование H3K9 нуклеосом вблизи сайта инициации ведет к расширению HP1-связывающего домена (Fig. 7a).
Этот путь формирования гетерохроматина законсервирован у большинства организмов. Заметным исключением является S. cerevisiae, которая использует биохимически иной концептуально сходный путь для обусловленного хроматином молчания56. Дрожжевой гетерохроматин состоит из деацетилированных нуклеосом, которые располагаются в коротких, регулярных интервалах. Он ограничен HML м HMR молчащими локусами спаривания, теломерами и повторами рДНК, a PEV ощущается с помощью трансгенов, которые вставляются внутри или вблизи областей молчащего хроматина. Образование молчащего хроматина на HML и HMR инициируется с помощью E и I сайленсеров, на которых связывающие сиквенс-специфичные факторы рекрутируют Sir2 histone deacetylase. Деацетилирование хвостов гистонов с помощью способствует связыванию - комплекса с нуклеосомами, которые затем рекрутируют дополнительные Sir2 молекулы, стабилизирующие дрожжевой гетерохроматин и позволяя ему распространяться.
Эухраматин представляет транскрипционно активные части генома, в которых ДНК более доступна для нуклеаз и нуклеосом и нерегулярно расположена. Характерным признаком эухроматина является присутствие , которые маркируют присутствие сиквенс-специфических ДНК-связывающих белков. Нуклеосомы внутри эухроматина несут комбинированный паттерн многих пост-трансляционных модификаторов, которые включают высокие уровни ацетилирования и метилирования H3K4 и H3K79. Образование эухроматина осуществляется с помощью процессов, которые ассоциированы с активацией транскрипции. Сюда входят различные модификации гистонов и ремоделирование нуклеосом, а также отложение вариантов гистонов. В отличие от гетерохроматина эухроматин по-видимому, не распространяется за счет линейного процесса, сходного с полимеризацией, но вместо этого осуществляется посредством дестабилизации гетерохроматиновых структур.
Barrier activity: breaking the nucleosome chain. Учитывая ряд доступных генетических инструментов, не может быть сюрпризом то, что большинство детальныъх характеристик барьерной активности получено на дрожжевых клетках. В большинстве этих экспериментов использованы конструкции, которые базируются на простой архитектуре сайленсеров (на E или I элементе), которые отделены от репортерного трансгена с помощью предполагаемого барьера и был проведен скрининг для идентификации последовательностей элементов57 и энзимов, которые ассоциированы с барьерной активностью58. В поиске энзимов были использованы библиотека DNA-binding-domain fusion и 4 GAL4-связывающих сайта в барьерной позиции. Эти эксперименты увязали барьерную активность с локальной деструкцией цикла реакции, подобной полимеризации, в сердце распределения гетерохроматина. Барьерная функция подобна цепочке терминаторов с помощью модификации нуклеосомного субстрата этой processive реакции (Fig. 7b). Наиболее экстремальной модификацией матрицы является удаление нуклеосом; различные элементы нуклеосомы исключающих последовательностей, как было показано, нарушают распространение обусловленного хроматином молчания59. Жр. формы модификаций достигаются посредством целенаправленного рекрутирования histone acetyltransferase (HAT) и ATФ-зависимых нуклеосомы-ремоделирующих комплексов58. Ассоциирована ли барьерная активность только со специфическими субнаборами этих энзимов, остается выяснить. Исключение нуклеосом и рекрутирование гистон- и нуклеосомы-ремоделирующих комплексов имеет важное значение для эндогенных барьерных элементов у дрожжей.
Изучение cHS4, сложного инсулятора позвоночных, о котолром говорилось выше, подтверждает идею, что сходный молекулярный механизм играет важную роль в барьерной активности у высших эукариот, хотя участвуют др. энзимы. cHS4 располагается на краю 5' конца куриного локуса beta-globin16,60, и обладает как энхансер-блокирующей18, так и барьерной активностью17. В то время как блокирование энхансера с помощью cHS4 обеспечивается посредством CTCF белка, его барьерная активность не зависит от этого белка61. Хромосомная позиция cHS4 маркируется во всех типах клеток с помощью гиперчувствительных к нуклеазе сайтов и пика эухроматин-специфических модификаций гистонов (ацетилирование гистонов и метилирование H3K4)62,63. Пик гистоновых модификаций на cHS4 обусловлен рекрутированием HATs и HMTs с помощью upstream transcription factor 1 () и сиквенс-специфических ДНК-связывающих белков64. cHS4 мутации, которые нарушают связывание USF1 и USF2, не только элиминируют поставку HATs и HMTs,но и устраняют барьерную активность. Эти находки привели к предположению, что cHS4-обусловленное ацетилирование и метилирование H3K4 нуклеосом обеспечивает их резистентностью к метилированию H3K9 и связыванию HP1 и следовательно, к остановке распространения образования гетерохроматина. Сходные механизмы могут базироваться на распространении др. ассоциированных с гетерохроматином гистоновых модификаций и их ко-факторов. Пока неизвестно все ли гистоновые модификации, которые обнаруживаются на cHS4 вносят равный клад в барьерную активность.
Can barriers function through subnuclear targeting? Идея, что структуры хроматина высшего порядка, особенно хроматиновые петли, могут ограничивать распределение гетерохроматина, обсуждалась некоторое время. Интерес к этому вопросу возник снова благодаря двум недавним сообщениям о связи барьерной активности и способности прикреплять волокна хроматина или путем связывания с ядерными порами65 или путем гомотипических межбелковых взаимодействий66. Эти сообщения показали, что прикрепления ограничивают распространение гетерохроматина посредством молекулярного механизма, который отличен от описанного в предыдущем разделе, хотя и не было предложено специфического механизма. Кстати, имеется согласие с возможностью того, что слабые барьерные активности элементов, которые были исследованы в этих работах, являются результатом комбинации исключения нуклеосом и таргетинга репортера в субъядерный компартмент67. Напр., целенаправленная доставка на д. создавать условия, которые являются неблагоприятными для обусловленного хроматином молчания, т.к. известна высокая концентрация транскрипционных активаторов, которые благоприятствуют образованию эухроматина.
Могут ли энхансер-блокирующие белки также функционировать в качестве барьеров путем прикрепления локуса к субъядерному компартменту, что является неблагоприятным для формирования или распространения гетерохроматина? Su(Hw), как сообщалось, частично защищает трансгены от обусловленного гетерохроматином молчания у D. melanogaster68. Молекулярный механизм такой активности неизвестен; однако, можно предполагать, что продемонстрированная способность Su(Hw) доставлять хроматиновые волокна к телам инсулятора имеет место. У позвоночных не известны сообщения о подобной CTCF непосредственной защите локуса от обусловленного гетерохроматином молчания. Фактически, CTCF не способен функционировать в качестве барьера у кур в в клеточном трансгенном подходе61. cHS4, и следовательно, CTCF, также неспособны защищать трансген, который локализуется на неактивной Х хромосоме мыши, от молчания69. Сохраняется большой интерес к этому предмету, особенно, учитывая недавнюю идентификацию новых CTCF-связывающих сайтов в или вблизи точек перехода между молчащими и активными структурами хроматина. Одно исследование описывает такие сайты на 5' конце генов, которые избегают замалчивания на неактивной Х хромосоме70. Др. упомянутая выше, показала, что CTCF может избирательно блокировать элонгацию транскрипта, которая инициируется на энхансерном элементе71. Ни одно из сообщений, однако, не предоставило доказательств, что CTCF непосредственно ограничивает распространение гетерохроматина, хотя это д. быть безусловно проверено.
tRNA genes can function as barriers. Исследования, которые показали, что tRNA гены могут функционировать как барьеры, выдвигают концепцию, что барьерная инсуляция является свойством разных классов уникальных регуляторных элементов. Sir3, маркер молчащего хроматина, располагается приблизительно в области в 4 kb, которая соответствует молчащим alpha генам и фланкирующим E и I сайленсерам в S. cerevisiae HMR локусе72. Переход между молчащим и активным хроматином происходит приблизительно в 1 kb области на центромера-дистальный конец HMR73. Используя трансгенный подход, барьерная активность внутри этого фрагмента была картирована до уникального tRNA Thr гена с минорным вкладом фланкирующих последовательностей74. Делеция законсервированного промоторного элемента устраняет барьерную активность, а мутации в транс-действующих факторах TFIIIB и TFIIIC (которые являются базовыми транскрипционными факторами для RNA polymerase III) вызывают тот же самый эффект. Барьер tRNA Thr оказался также чувствительным к мутациям в субнаборе генов, которые кодируют HATs. Доступные данные подтверждают гипотезу, что высокого уровня транскрипция tRNA промотора необходима для пограничной активности. Возможным объяснением этого рекрутирования является наблюдение, что высокие уровни транскрипции ведут к образованию свободных от нуклеосом пробелов промотора.
Недавно проанализированы эффекты специфических мутаций на in situ активность tRNAThr барьера в HMR75. Одиночные мутации. которые затрагивают HAT или только tRNAThr промотор не приводят к увеличению распространения Sir3 белка за пределы границ дикого типа. Для нарушения барьера необходима комбинация двух мутаций: одна в tRNAThr промоторе, чтобы элиминировать свободный от нуклеосом участок и вторая или в ada2, eaf3 или sas2 генах, которые кодируют histone acetyltransferases. Не было сообщений, что эти HATs специфически рекрутируются на tRNA промоторы, так что скорее всего, что они вносят вклад в барьерную функцию благодаря увеличению глобальных уровней ацетилирования. Снижение уровней глобального ацетилирования в мутантных линиях увеличивает спообность молчащих хроматиновых структур за счет снижения деацетилазной активности Sir2, которая рекрутируется, чтобы поддерживать статус нуклеосом, свободных от ацетилирования.
tRNA genes also serve as barriers in other organisms. Анализ с высоким разрешением архитектуры хроматина у Schizosaccharomyces pombe показал, что точки переходов между активными и молчащими регионами хроматина на центромерах ко-локализуются с кластером tRNA генов76,77. Недавно было продемонстрировано, что активный tRNA ген может функционировать как барьер распространению гетерохроматина у S. pombe, хотя механизм действия ещё неизвестен78. Интересно, что делеция tRNA барьера не только разрушает организацию хроматина дикого типа на центромере, но и - возможно как следствие этого эффекта на хроматин - ведет также к аномальной функции центромеры. Способность барьерных инсуляторов предопределять границы гетерохроматина может, следовательно, затрагивать крупно-масштабную организацию хроматина, а также локальную транскрипционную активность. Промоторы RNA polymerase III (которые транскрибируют tRNA) могут также функционировать как барьеры у позвоночных, в которых они участвуют в барьерной активности Alu элементов. которые фланкируют ген человека, который кодирует 79.
Показано, что кластеры Box B связывающих сайтов для TFIIIC, которые фланкируют молчащий локус спаривания у S. pombe могут функционировать как барьеры в отсутствие дополнительных Pol-III-promoter-ассоци ированных факторов. Это сообщение предоставляет дальнейшую информацию о потенциальных молекулярных механизмах барьеров80. Анализ иммунопреципитации хроматина по всему геному выявил существование ряда TFIIIC-связанных Box B кластеров (chromosome-organizing clamp или COC сайтов), которые не ассоциируют с RNA polymerase III. Микроскопическая проверка ядер S. pombe показала, что удаленные COC сайты приходят в контакт, чтобы сформировать ограниченное количество кластеров на периферии ядра. Как эта структура, которая обнаруживает значительное сходство с Su(Hw)-обусловленными инсуляторными телами, облегчает барьерную активность? Ответ может заключаться в наблюдении, что большая фракция COC сайтов локализована на 5' концах высоко активных, дивергентно транскрибируемых пар генов. Вообще-то таргетинг COC сайтов, которые фланкируют молчащий MAT локус (который контролирует тип спаривания), в субъядерный регион с высокой транскрипционной активностью предупреждает дальнейшее распространение ассоциированных с гетерохроматином структур. Дальнейшие эксперименты необходимы для определения, действует ли TFIIIC, если он функционирует один, посредством тех же механизмов, что и интактные tRNA генные барьеры.
Transition without a fixed barrier. Изучение 4-ой хромосомы у Drosophila выявило организацию, которая, по-видимому, не зависит от фиксированных барьерных элементов для отделения областей гетерохроматина и эухроматина. Большинство линий, сцепленных с 4-й хромосомой, генерировано с использованием трансгенной конструкции, которая специально разработана для исследования статуса хроматина на месте инсерции81. Анализ линий показал, что фракция, богатая генами, четвертой хромосомы состоит из смеси гетерохроматиновых и эухроматиновых областей с некоторыми генами, локализованными в гетерохроматиновых частях82. Сходное распределение скорее всего имеет место и в перицентрических областях др. хромосом. Чтобы понять значение этого результата необходимо держать в уме, что в специфических тканях, в которых эндогенные гены имеют активную организацию хроматина, могут быть отличны от тех, что в глазах, которые являются тканью мишенью для репортерного трансгена.
Результатами генетических манипуляций над индивидуальными трансгенами приводят к заключению, что на четверной хромосоме границы между гетерохроматином и эухроматином не регулируются фиксированными барьерами83. Вместо этого они предопределяются локальным балансом между силами активностей, которые способствуют формированию или гетерохроматина или эухроматина (Fig. 8). Т.к. эти активности обнаруживают легкую межклеточную изменчивость в положении границы, которая ведет к variegated экспрессии трансгена, который вставлен в область перехода. предполагаемое место инициации образования гетерохроматина в этом случае представлено 1630 субклассом повторяющихся элементов; трансгены, которые вставлены внутри приблизительно 10 kb элемента 1630, становятся субъектами PEV. Распространение гетерохроматина за границу приблизительно 10 kb д. ограничиваться за счет сокращения активностей, которые ассоциированы с образованием эухроматина. Такие гетерохроматин-ограничивающие 'позитивные ' сигналы скорее всего являются комбинацией глобальной активности и целенаправленного рекрутирования гистон- и/или нуклеосомы-модифицирующиъх энзимов. Возможно, что ни один из индивидуальных локально рекрутируемых элементов не являются достаточно строгим, чтобы доминировать над распространением гетерохроматина способом, который позволяет вести как фиксированный барьер.
Картина, которая возникает из различных тесно связанных полей исследований хроматина, показывает. что эпигенетическое состояние данной геномной области детерминировано с помощью локального баланса между противоположными активностями, которые способствуют образованию гетерохроматина или эухроматина84. Эти активности включают как те, что затрагивают глобальные компоненты (такие как уровни белка HP1) так и целенаправленные модификации (напр., HATs или HMTs, которые с помощью USF1 или USF2 на cHS4), и могут функционировать или для стабилизации или дестабилизации эухроматина или гетерохроматина. Тонкая регуляция состояния хроматина, по-видимому, ограничена геномными областями, в которых присутствие одной формы чрезвычайно желательно. Примеры включают не только образование эухроматина на активных генах и их регуляторных регионах, но также поддержание гетерохроматина в перицентромерных областях и репрессированных генов (напр., молчащие копии генов типов спаривания на HML и HMR локусах). Резкий переход между гетерохроматином и эухроматином наблюдается только в тех случаях, в которых две тонко регулируемые области находятся бок о бок (напр.,локус beta-globin кур). В этих ситуациях точка перехода предопределяется позицией барьера, который функционирует как доминантный сайт рекрутирования для активностей, способствующих эухроматину. В др. случаях переходы кажутся постепенными, при исследовании экспериментальными методами, такими как иммунопреципитация хроматина, это отражает средние свойства клеточной популяции (напр., S. cerevisiae HML локус)72. Кажущийся постепенный переход скорее всего является следствием межклеточной вариации в степени распространения гетерохроматина. Даже в этих случаях слабые сайты рекрутирования эухроматина играют роль; они не достаточно сильны, однако, служат как определенный барьер во всех клетках.
Rethinking the definition of insulators
Как уже указывалось недавние эксперименты строго подтвердили существование связи между энхансер-блокирующей инсуляцией и организацией структуры хроматина внутри ядра. Несмотря на это ни одна из обсужденных моделей, которые вытекают из этих наблюдений, не удовлетворяет целиком, объясняя как работает энхансер-блокирующая инсуляция, вообще-то из-за участия более чем одного механизма как между так и внутри организмов. Напротив, механизмы барьерно-инсуляторной функции кажутся общими с наиболее очевидной и широко распространенной темой поддержания гистоновых модификаций на границе, которая ассоциирует с 'активным' хроматином. Для обоих типов инсуляторов эти механизмы, по-видимому, отражают не уникальный, высоко специализированный аппарат, который посвящен инсуляции, а скорее модификации или расширению существующих регуляторных элементов.
Эти неясные деления между механизмами инсуляторов и др. регуляторных элементов совершенно ясны в случае барьерных инсуляторов, которые рекрутируют широкое разнообразие гистон-модифицирующих факторов (HATs и HMTs) типа, которые обнаруживаются также в энхансерах. Строгие энхансеры могут обладать в большей или меньшей степени также защитой против позиционных эффектов, возможно благодаря поддержанию позитивных модификаций гистонов. Барьерные инсуляторы отличаются от энхансеров тем. что барьерные элементы лишены способности работать как активаторы во временных экспериментах по трансфекции. Отметим, однако, что (LCRs), которые могут обеспечивать строгую зависимую от позиции экспрессию на трансгенах, состоят из множественных регуляторных областей, некоторые из которых могут функционировать во временных подходах, а др. только, когда стабильно интегрированы в геном. Мы полагаем, что последние элементы могут обладать свойствами барьерных инсуляторов. Происходит ли это в действительности, неизвестно, но ясно, что барьерные инсуляторы и энхансеры обладают многими одними и теми же факторами и способами действия.
Сходный аргумент может быть приведен и в отношении энхансер-блокирующих инсуляторов к др. типам транскрипционных регуляторов и элементов архитектуры хроматина: как отмечалось выше, архитектура петли, которая соединяется с этого типа действием инсулятора, может быть одним из специализированных применений более общего набора регуляторных механизмов, которые ассистируют сведению вместе удаленных регуляторных элементов и генов (напр., в хроматиновые hubs), и стабилизации межхромосомных взаимодействий. Белки, такие как CTCF, д. прекрасно подходить к роли в этих механизмах, которые могут быть совсем отличны в зависимости от способа действия в энхансер-блокирующих инсуляторах.
Ясно, что инсуляторы обоих типов обладают одним и тем же багажом трюков с др. регуляторными элементами - энхансерами, сайленсерами и LCRs - которые они комбинируют разными остроумными способами, чтобы приобрести специфические свойства. Хотя они всё ещё употребимы для поддержания различных категорий регуляторных элементов, нужно держать в уме, что может быть существенное перекрывание их функций in vivo. Как и с др. элементами мы не д. позволять нашим схемами классификации инсуляторов затемнять наше понимание их потенциальной многосторонности в контроле организации хроматина внутри ядра.
