Чтобы поддерживать свою генетическую интеграцию клетки эукариот д. аккуратно сегрегировать свои хромосомы к противоположным полюсам во время митозов. Выяснение механизмов, которые гарантируют высокую точность расхождения хромосом, д. помочь понять разные болезни у людей, такие как рак и врожденные нарушения, которые характеризуются хромосомной нестабильностью и ANEUPLOIDY1,2. Расхождение хромосом в основном зависит от сил, которые генерируются с помощью микротрубочек, которые прикрепляются к кинетохорам3. Для точного расхождения хромосом кинетохоры д. б. закреплены соответственно на MITOTIC SPINDLE перед началом анафазы. Собственно отлавливание кинетохор микротрубочками веретена достигается ступенчато-образно (FIG. 1). Сначала кинетохора улавливается латеральной поверхность микротрубочки веретена, которая может исходить из любого полюса веретена 4-7. Будучи захваченными кинетохоры транспортируются в направлении полюса вдоль микротрубочки. Чтобы гарантировать захват и транспорт микротрубочки д. эффективно распознавать положение неприкрепленных кинетохор, а после захвата кинетохоры д. стабилизировать свои ассоциированные микротрубочки. Затем микротрубочки, которые исходят от др. полюса веретена, также взаимодействуют с кинетохорами и в конечном итоге каждая SISTER KINETOCHORE прикрепляется к микротрубочкам, которые исходят из разных полюсов8,9 (это известно как сестринских кинетохор bi-orientation, би-ориентация хромосом или amphitelic прикрепление;
FIG. 2). Для достижения этого неправильно ориентированные соединения кинетохора--полюс веретена (напр., сестринские кинетохоры прикрепляются к микротрубочкам из одного и того полюса; это известно как syntelic прикрепление) д.б. удалены и би-ориентация д. будет достигнута избирательно.
Здесь будет рассмотрено, как кинетохоры собираются на центромерах. Затем молекулярные механизмы взаимодействия кинетохоры--микротрубочки перед анафазой. Мы обсудим, как кинетохоры первоначально улавливаются микротрубочками и как сестринские кинетохоры би-ориентируются на митотическом веретене. Мы не будем детально рассматривать SPINDLE CHECKPOINT (BOX 1), обзоры которого известны10,11.
Kinetochore components and their assembly
У S. cerevisiae, ~130-bp состоящие из трех частей консенсусные последовательности ДНК (известные как CDE I-II-III) достаточны для поддержания высоко-точной сегрегации хромосом12. Не смотря на такие простые центромерные последовательности ДНК, структура кинетохор, по-видимому, сложная. Фактически идентифицировано более 60 компонентов кинетохор с помощью генетических и биохимических подходов (rev. 13). Эти компоненты формируют несколько белковых комплексов (FIG. 3): комплекс CBF3 соединяется непосредственно с центромерной ДНК14-16; Dam1 (известный также как DASH или DDD) комплекс, как полагают, осуществляет непосредственное вмешательство в процесс прикрепления кинетохор к микротрубочкам в метафазе17-23; a Ndc80, Mtw1 (известный также как MIND) и Ctf19 (известный также как COMA) комплексы, как полагают, являются компонентами, образующими мостик между связанным с центромерой CBF3 комплексом и ассоциированным с микротрубочками комплексом Dam124-32. Некоторые компоненты CBF3, Ndc80, Mtw1 и Ctf19 комплексов структурно законсервированы от дрожжей до позвоночных.
Дополнительные компоненты кинетохор дрожжей, которые структурно законсервированы в клетках эукариот, включают Cse4 и Mif2. Cse4 является специфичным для центромер вариантом гистона H333,34 (его metazoan ORTHOLOGUE является CENP-A). Гистоновые регуляторы Cac1 и Hir1 и ассоциированный с центромерами белок Spt4 необходимы для ограничения ассоциации Cse4 с центромерами у почкующихся дрожжей35,36,
a гистоновые deacetylases Mis16 и Mis18 (и их ортологи) необходимы для ассоцииации с центромерой CENP-A (и его ортологами) у делящихся дрожжей и в клетках человека37. Mif2 (его ортологом у метазоа является CENP-C) ассоциирует с кинетохорами Cse4-щависимым способом и необходим для ассоциации кинетохор с комплексами Ctf19 и Mtw130,38,39. Последовательность, с которой компоненты кинетохор собираются суммирована на FIG. 3.
Кроме того, Ipl1-Sli15 киназный комплекс (его ортологом в клетках является Aurora-B-INCENP комплекс) также локализуется в кинетохорах и гарантирует би-ориентацию сестринских кинетохор22,40-45. 4 plus-end-tracking proteins (+TIPs) микротрубочек - Bim1, Bik1, Stu1 и Stu2
(чьими ортологами являются Mal3/EB1, Tip1/CLIP170, MAST/Orbit/CLASP и Dis1/Alp14/Zyg-9/Msps/XMAP215/ch-TOG, соотв.) - как полагают, влияют на поведение кинетохор путем регуляции динамики микротрубочек7,46-55. По крайней мере, некоторые (если не все) из +TIPs загружаются на кинетохоры на орпеделенных стадиях клеточного цикла.
У S. cerevisiae, MICROTUBULE-ORGANIZING CENTRES (MTOCs) известные как spindle pole bodies (SPBs), встроены в ядерную оболочку56,57. Ядерная оболочка не разрывается во время клеточного цикла (это известно как 'закрытые' митозы), a кинетохоры прикреплены к SPBs с помощью микротрубочек в течение большей части клеточного цикла45,57-59. Тем не менее, недавно было предположено, что центромеры временно отсоединяются от микротрубочек, когда центромерная ДНК реплицируется9. Было также показано, что большая часть белка Cse4 кинетохор оборачивается во время S фазы, но незначительный, еслии вообще происходит оборот во время остальных фах клеточного цикла60. Эти результаты указывают на то, что кинетохоры разбираются во время репликации центромерной ДНК (по крайней мере, до такой степени, которая достаточна для отсоединения микротрубочек), затем постоянно собираются вскоре после этого и снова захватываются микротрубочками. Соединение кинетохор с микротрубочками в самом деле становится видимым в S фазе, но не в др. фазах во время ненарушенного нормального клеточного цикла7.
Итак, репликация кинетохор у почкующихся дрожжей не происходит консервативным способом, сходным с дупликацией SPB (старое SPB от предыдущего клеточного цикла остается интактным, тогда как новое SPB формируется практически во время S фазы56,57). Если вся структура кинетохор разбирается во время S фазы, то не д. быть отличий между 'старыми' и 'новыми' сестринскими кинетохорами после сборки на реплицировавшихся центромерах.
У делящихся дрожжей и в клетках metazoan центромеры занимают более крупные регионы на хромосомах и их последовательности ДНК разнообразны у разных организмов10,61. Несмотря на это многие компоненты кинетохор законсервированы от почкующихся дрожжей, делящихся дрожжей до клеток metazoan (REF. 13). В клетках позвоночных кинетохоры обнаруживают фиброзные ковер-подобные структуры, которые различимы с помощью ЭМ62. Структуры кинетохор видны на центромерах только после начала конденсации митотических хромосом в профазе, хотя, по крайней мере, некоторые компоненты кинетохор откладываются уже в интерфазе61,63. Т.к. MTOCs (известны как центромеры у metazoa) расположены вне ядерной оболочки в клетках metazoan cells, то кинетохоры отлавливаются с помощью микротрубочек, которые исходят из центросом только после разрыва ядерной оболочки в начале прометафазы ('открытые' митозы)64.
Kinetochore capture by spindle microtubules
Visualizing kinetochore-microtubule interactions.
Как кинетохоры прикрепляются первоначально к микротрубочкам? Этот процесс видим в клетках позвоночных, таких как клетки легких тритона и rat kangaroo PtK клетки, с помощью цейттраферной микроскопии4-6. В этих клетках после разрыва ядерной оболочки кинетохоры первоначально отлавливаются с помощью решетки (т.е. латеральной поверхности скорее, чем торца) одиночной микротрубочки, которая исходит от одного из двух полюсов веретена (FIG. 1). Будучи захваченными кинетохоры транспортируются в направлении полюса вдоль поверхности микротрубочки, которая заканчивается дистальнее кинетохоры. Во время этого путешествия по направлению к полюсу кинетохоры взаимодействуют с дополнительными микротрубочками, плюс концы которых постепенно внедряются в структуры кинетохор. В конечном итоге каждая сестринская кинетохора прикрепляется к плюс концам микротрубочек от противоположных полюсов веретена. Таким образом, сестринские кинетохоры би-ориентируются на митотическом веретене перед началом анафазы.
S. cerevisiae является прекрасным модельным организмом для изучения взаимодействий кинетохоры--микротрубочки у эукариот из-за своей подходящей генетики. Прикрепление кинетохор к одиночным микротрубочкам в метафазе
65,66 также облегчает изучение этих взаимодействий. Путем маркирования индивидуальных центромер green fluorescent
protein (GFP), стало возможным визуализовать непосредственно движение центромер у почкующихся дрожжей, используя замедленную микроскопию
67-70. Базируясь на поведении маркированных хромосом, мы определили стадии M фазы у почкующихся дрожжей (BOX 2). Во время S фазы у почкующихся дрожжей большинство кинетохор остается вблизи SPBs
57. Возможно кинетохоры быстро повторно собираются после своей разборки вследствие репликации центромерной ДНК и повторно захватываются микротрубочками во время S фазы. Путем локализации положения центромер с использованием окрашивания иммунозолотом при ТЭМ, было установлено, что центромеры взаимодействуют с латеральной поверхностью микротрубочек во время S фазы у почкующихся дрожжей
7, так как они это делают во время прометафазы в клетках позвоночных. Однако, в живых клетках трудно визуализовать захват кинетохор индивидуальными микротрубочками с помощью световой микроскопии, т.к. все кинетохоры отлавливаются с помощью микротрубочек в течение короткого периода времени внутри небольшого пространства вблизи SPBs
57 (BOX 2).
В недавних исследованиях было показано, что один способ преодолеть эту проблему заключается в регуляции сборки кинетохор. Путем предупреждения повторной сборки кинетохор после репликации центромерной ДНК GFP-меченные центромеры располагаются на расстоянии от веретена и от др. центромер, которые уже расположились на веретене
7. Затем с помощью реактивации центромер (делающей возможной сборку кинетохор),
| |
|
| Box 1 | Sister chromatid cohesion and the spindle checkpoint
Sister chromatids attach themselves to each other through a multiprotein complex known as cohesin from the time of their production during DNA replication until the onset of anaphase171. Sister-chromatid cohesion resists the tendency of microtubules to pull chromatids apart during their bi-orientation on the mitotic spindle. Following anaphase onset, cleavage of the cohesin subunit Scc1 (also known
as Mcd1 or Rad21) by the protease separase triggers the segregation of sister chromatids172,173. A surveillance mechanism, known as the spindle checkpoint, delays the activation of separase until all pairs of sister kinetochores have bi-oriented on the spindle10,11. In both animal and yeast cells, the spindle checkpoint is crucial for
maintaining cell viability when the cell cycle is disturbed; for example, when the spindle is disrupted by drugs that cause microtubule depolymerization. In normal, undisturbed cell cycles of metazoan cells, the spindle checkpoint is essential to ensure the proper segregation of all chromosomes (for example, REF. 174). However, in budding and fission yeasts, the spindle checkpoint is dispensable for chromosome
segregation in their normal cell cycle. For example, the complete loss of checkpoint proteins such as Mad2 has little effect on cell growth and on the fidelity of chromosome segregation in budding yeast175. The spindle checkpoint is therefore not an integral part of the mechanism that ensures chromosome segregation in unperturbed cell cycles, at least not in yeasts. The difference between metazoan cells and yeast probably arises because yeast cells can establish sister kinetochore bi-orientation for all chromosomes more quickly during mitosis, so that a delay of
anaphase onset by the spindle checkpoint is not required for high-fidelity
chromosome segregation.
|
происходит визуализация (Supplementary information S1 (movie)). Центромера отлавливается латеральной поверхностью одиночной микротрубочки, которая исходит из полюса веретена и затем транспортируется в направлении полюса вдоль микротрубочки
7.
Итак, инициальный захват кинетохоры и последующий транспорт вдоль микротрубочки происходит одинаковым способом у дрожжей и в клетках позвоночных. Прикрепление кинетохоры к боковой стороне микротрубочки выявлено также и у DIATOMS71. Возможно, что этот механизм возникает рано в эволюции эукариотических клеток, т.к. решетка микротрубочки может обезопасить инициальное отлавливание кинетохоры за счет значительно большей поверхности для этого соединения по сравнению с торцом микротрубочки.
Initial kinetochore capture by microtubules. Первоначальное неожиданное столкновение кинетохоры с микротрубочкой происходит быстро после разрыва ядерной оболочки (в клетках metazoan) или как только закончится сборка кинетохор (у почкующихся дрожжей)4-7,72. Но как кинетохоры столь эффективно захватываются микротрубочками? Установлено, что микротрубочки увеличиваются из центросом преимущественно в направлении хромосом в экстрактах яиц Xenopus laevis73, это, по-видимому, зависит от концентрационных градиентов RanGTP и ассоциированных с ним белков вокруг хромосом74. В самом деле, RanGTP функционирует, облегчая восстановление микротрубочек (т.е. конверсию от уменьшения к росту микротрубочек) в яйцевых экстрактах X. laevis75,76. Недавно разработанная математическая модель также предполагает, что меняющаяся динамика микротрубочек вокруг хромосом д. приводить к эффективному отлавливанию кинетохор микротрубочками77.
Однако, у почкующихся дрожжей микротрубочки не распространяются преимущественно в направлении кинетохор7. Из-за небольших размеров ядра дрожжам не нужны подобные механизмы. Более того, при закрытых митозах у дрожжей маловероятно, что будет формироваться градиент RanGTP вокруг хромосом. Несмотря на это высокая концентрация RanGTP в ядре всё ещё облегчает рост микротрубочек от полюсов веретена у почкующихся дрожжей, но в разных направлениях, а не только в направлении кинетохор7 (BOX 3). Увеличение микротрубочек облегчается также с помощью +TIPs, таких как Bim1, Bik1 и Stu2, которые располагаются на плюс концах растущих микротрубочек (FIG. 4). Неожиданная встреча между кинетохорами и микротрубочками, которые распространяются от полюсов веретена может также облегчаться за счет генерации микротрубочки самой кинетохорой. Такие производные кинетохор микротрубочки впервые были обнаружены в клетках позвоночных, которые восстанавливались после обработки микротубулярным ядом. Недавно производные кинетохор микротрубочки были найдены в нормальных клетках позвоночных и Drosophila melanogaster (REFS 78,79). Производные кинетохор микротрубочки последовательно взаимодействуют с производными полюсов микротрубочками и тем самым 'подводят' кинетохоры к боковой поверхности микротрубочек, производных полюсов. Мы также установили, что микротрубочки, генерируемые кинетохорами, последовательно ассоциируют с микротрубочками, производными полюсов, у почкующихся дрожжей (K.T. and T.U.T., unpublished observations). Однако, степень, с которой производные кинетохор микротрубочки помогают встрече кинетохор с производными полюсов микротрубочками в нормальном клеточном цикле еще предстоит исследовать. У почкующихся дрожжей все комплексы кинетохор, упомянутые выше (CBF3, Ndc80, Mtw1, Ctf19, Dam1 и Ipl1 комплексы) существенны собственно для сегрегации хромосом. Однако, только CBF3, Ndc80, Mtw1 и Ctf19 комплексы, но не Dam1 и Ipl1 комплексы необходимы для инициального захвата и транспорта в направлении полюсов7 (FIG. 4). Вместо этого комплексы Dam1 и Ipl1 необходимы для гарантии последующей би-ориентации сестринских кинетохор17,20,23,42,44,45.
Интересно, что Dam1 комплекс не нужен ни для захвата кинетохоры, ни для транспорта вдоль решетки микротрубочки, но является критическим для би-ориентации хромосом7,17,20,23,44. Естественным следствием этого является то, что кинетохоры могут использовать другие контактные молекулы, когда они ассоциируют с боком микротрубочки, отличные от тех, что используются, когда сестринские кинетохоры би-ориентируются на веретене (возможно прикрепленные к плюс концам микротрубочек; FIG. 4). Комплексы Ctf19, Mtw1 и Ndc80, собираются в ансамбль на реплицирующихся центромерах, зависят от CBF3 комплекса (и Cse4 и Mif2)24-32, прежде, чем кинетохоры впервые встретятся нечаянно с микротрубочками (FIG. 3). Возможно, что один или более из этих трех комплексов обеспечивает непосредственный интерфейс для латерального прикрепления к микротрубочке. Напротив, комплекс Dam1 на микротрубочках от веретена нагружается на кинетохору (Ndc80-зависимым способом) только после того, как кинетохоры захватываются микротрубочками20,23, a комплекс Dam1 затем стабилизирует соединение кинетохора--микротрубочка (возможно end-on), когда сестринские кинетохоры би-ориентируются.
Kinetochore transport along microtubules. После захвата кинетохор латеральной поверхностью одиночных микротрубочек у почкующихся дрожжей они транспортируются вдоль микротрубочки преимущественно в направлении полюса веретена (т.е., в направлении минус конца микротрубочки). Какие факторы регулируют транспорт кинетохоры вдоль микротрубочки? Считается, что ATФ-управляемые моторные белки сверхсемейств KINESIN и DYNEIN могут участвовать в этом процессе. Геном S. cerevisiae кодирует 6 белков семейства kinesin (Cin8, Kar3, Kip1,
Kip2, Kip3 и Smy1) и одиночную тяжелую цепь dynein, Dyn1 (REF. 80). Это означает, что Kar3 (член семейства kinesin-1481)участвует в направленном к полюсам транспорте кинетохор вдоль микротрубочек7. Напр., у kar3 'rigour' мутантов, у которых происходит связывание микротрубочек, но отсутствует моторная активность из-за дефектов гидролиза АТФ82,83, кинетохоры часто
остаются значительное время в одном и том же положении на микротрубочках без ощутимого движения7. Напротив, избыточная экспрессия Kar3 ускорят транспорт кинетохор. Согласуется с этим вовлечением Kar3 в транспорт кинетохор то, что Kar3 загружается на кинетохоры7,84. Разумно предположить, что Kar3 вовлекается в транспорт кинетохор, т.к. он является мотором только в направлении минус конца, и который локализуется в ядре среди 6 белков семейства80, и хотя dynein также нацелен на минус конец он не локализуется ядре. В самом деле делеция dyn1 не усиливает дефектов транспорта кинетохор при комбинации с мутациями kar3 (K.T. and T.U.T., unpublished observations).
Однако, др., еще не идентифицированные регуляторы скорее всего функционируют, перекрываясь с Kar3, т.к. транспорт кинетохор продолжается в большинстве клеток с kar3 делециями7. В клетках позвоночных кинетохоры скользят значительно быстрее вдоль решетки микротрубочки, чем у почкующихся дрожжей7,85, a dynein, как полагают, участвует в этом быстром скольжении кинетохор4, исходя из его подвижности вдоль микротрубочек in vitro86 и его временной локализации в ранней M фазе87. Если dynein участвует в транспорте кинетохор в клетках metazoan, то может предположить, что после того как в клетках эукариот возникли открытые митозы, то они также приобрели способность цитоплазматического dynein транспортировать кинетохоры. Или, члены семейства kinesin-14 также могут вовлекаться в быстрый транспорт кинетохор в клетках metazoan. Т.к. моторные белки этого семейства не являются processive (т.е., мотор высвобождается с микротрубочек после каждого цикла ATФase)88, то они могут ускорять скорость транспорта кинетохор, когда они локализуются на кинетохорах с наибольшей плотностью или таким образом, что их моторные домены обнаруживают наивысшее сродство к микротрубочкам. Фактически избыточная экспрессия Kar3 у дрожжей ускоряет транспорт кинетохор7, a D. melanogaster Ncd белок (др. член семейства kinesin-14) обнаруживает высокую подвижность вдоль микротрубочек in vitro89. Интересно, что прикрепление к микротрубочкам веретена нарушается, когда Ncd дефектен в клетках D. melanogaster90.
Conversion from lateral to end-on attachment. В клетках позвоночных скорость транспорта кинетохор вдоль латеральной поверхности микротрубочек (латеральное прикрепление) снижается по мере приближения кинетохор к полюсам веретена. Одновременно кинетохоры прикрепляются к плюс концам множественных микротрубочек (end-on прикрепление)4,6. Прикрепление к торцам микротрубочек кинетохор также, по-видимому, происходит во время метафазы у разных одноклеточных эукариот, таких как делящиеся дрожжи и оомицетные грибы Saprolegunia ferax91,92. У S. cerevisiae, имеются косвенные доказательства того, что кинетохоры превращают свою ассоциацию с боковой поверхностью микротрубочек на end-on соединение после того, как кинетохоры транспортируются в направлении полюсов(Supplementary information S2 (box)), хотя подтверждающие доказательства отсутствуют.
Боковые стороны микротрубочек обладают преимуществами в надежности первоначального захвата кинетохор из-за образования значительно большей поверхности контакта по сравнению с кончиками микротрубочек. Однако, для поддержания ассоциации с кинетохорами, прикрепление к end-on микротрубочек может быть более стабильным, чем боковое прикрепление. Фактически, кинетохоры временами отсоединяются от латеральной поверхности микротрубочек во время своего транспорта в направлении полюсов у почкующихся дрожжей7. Напротив, кинетохоры некогда не отсоединяются от микротрубочек во время анафазы67-70, когда кинетохоры преимущественно прикреплены к плюс концам микротрубочек.
Пока ещё неясно, как кинетохоры превращают свое прикрепление к микротрубочкам с бокового на end-on. Комплекс Dam1 может выполнять важную роль в стабилизации прикрепления к торцам, по крайней мере, у почкующихся дрожжей. В клетках metazoan член семейства +TIP, MAST (известный также как Orbit), и checkpoint белок, Bub1, могут быть важными для этого превращения, т.к. их истощение вызывает персистенцию латерального прикрепления93,94.
Sister kinetochore bi-orientation
После того как кинетохоры оказываются захвачены микротрубочками и транспортируются в направлении полюсов, каждая сестринская кинетохора д. в конечном итоге присоединиться к микротрубочкам, которые исходят от противоположных полюсов веретена (би-ориентация сестринских кинетохор
| |
|
| Box 3 | Regulation of the spindle and microtubules by the small GTPase Ran
Ran is a member of the small GTPase family and its activity is regulated by a nuclear Ran GDP/GTP exchange factor (GEF) and a cytoplasmic Ran GTPase-activating protein (GAP)180-182. Ran mainly exists as RanGTP in the nucleus and RanGDP in the cytoplasm, and regulates nuclear import and export in both yeast and metazoan cells. In
addition, RanGTP facilitates microtubule rescue and bipolar-spindle formation after nuclear envelope breakdown in metazoan cells75,76,181,182. Although fission and budding yeasts do not show nuclear envelope breakdown, there is evidence that RanGTP promotes nuclear microtubule extension from the spindle pole bodies (SPBs) and supports a proper spindle structure, independently of nuclear-import regulation7,183,184. Moreover, in vertebrate cells, Ran GAP
is recruited to kinetochores and facilitates kinetochore-microtubule interactions, dependent on its sumoylation185.
However, budding yeast RanGAP lacks the sumoylation domain186 and is located primarily in cytoplasm187.
Nonetheless, RanGAP is required for kinetochore capture by microtubules in budding yeast7. Because the yeast RanGAP has putative nuclear localization signals188, it might transiently enter nuclei. However, so far it has not been detected at kinetochores by chromatin immunoprecipitation7, and it is unclear whether yeast RanGAP
regulates kinetochore-microtubule interaction directly or indirectly (that is, through regulation of nuclear import and export).
|
или amphitelic прикрепление; FIG. 2). Считается, что два различных механизма могут гарантировать би-ориентаци. кинетохор на веретене во время митоза и в первом мейотическом делении
95. В митозе сестринские кинетохоры, по-видимому, расположены спина-к-спине, из-за слипания центромер сестринских хроматид. Следовательно, если одна сестринская кинетохора прикрепляется к микротрубочке и оказывается повернутой лицом к данному полюсу, то др. кинетохора может повернуться лицом в др. полюсу и будет захвачена микротрубочкой только от второго полюса. Итак, неправильная ориентация (syntelic и merotelic прикрепления; FIG. 2) может быть устранена с помощью негибкости геометрии сестринских кинетохор (механизм, зависимый от геометрии).
Напротив, в первом мейотическом делении, когда две гомологичные кинетохоры (каждая состоящая из сестринских кинетохор, которые слиты вместе) д. прикрепляться к микротрубочкам, которые исходят от противоположных полюсов, то они могут гибко изменять свою геометрию, т.к. они соединены только с помощью CHIASMATA, формируемых плечами хромосом, т.к. нет слипчивости, которая непосредственно связывает две гомологичные центромеры96. Эта гибкость устраняет ключевую роль зависимого от геометрии механизма, облегчая би-ориентацию гомологичных кинетохор. На сперматоцитах кузнечиков кинетохоры и полюса веретена, из которых исходят и постоянно соединяются и отсоединяются микротрубочки до тех пор, пока они не станут би-ориентироваными, Nicklas и др. показали, что соединение кинетохор 'материнской' хромосомы к микротрубочкам полюса стабилизируется при использовании микро-иглы, чтобы оттянуть 'отцовскую' хромосому, прикрепленную к ней97,98. Это укзывает на то, что, по-видимому, в первом мейотическом делении неправильная ориентация корректируется до тех пор, пока прикладывается натяжение к соединению кинетохоры с полюсом веретена и тем самым оно стабилизируется (зависимый от натяжения механизм).
Достаточен ли зависимый от геометрии механизм, чтобы гарантировать би-ориентацию в митозе предмет споров99,100. Если это так, и нечаянная неправильная ориентация никогда не исправляется, то частота неправильных ориентаций д. быть униформно низкой входе всего митоза, иначе клетки не смогли бы поддерживать свою плоидность с высокой точностью. С др. стороны, неправильная ориентация может встречаться более часто в ранних митозах (prometaphase), чем в поздних митозах (metaphase и anaphase), если происходит коррекция, а недавние исследования с использованием продвинутой световой микроскопии показали, что это в самом деле имеет место101,102.
Принимая во внимание, что неправильная ориентация в самом деле корректируется во время митозов, то гарантирует ли зависимый от натяжения механизм би-ориентации в первом мейотическом делении и в митозах? Если это так, то мы можем предсказать, что любого типа соединение между двумя кинетохорами (включая соединения, которые не поддерживают спина-к-спине геометрию) д.быть достаточны для из би-ориентации, т.к. создание таких соединений может противостоять тянущим силам от микротрубочек веретена и тем самым создавать натяжение, когда две кинетохоры би-ориентированы.
Чтобы протестировать такое поведение двух кинетохор на нереплицированной циркулярной MINICHROMOSOME, которая несет две центромеры, изучали почкующиеся дрожжи72. Т.к. эти две кинетохоры не являются урожденными сестрами с помощью репликации ДНК, то они д.быть лишены какой-либо геометрии "спина-к-спине", характерной для сестринскоих кинетохор. Тем не менее, две кинетохоры, д. быть соединены с помощью хроматина, к которому прикладывается натяжение, если они би-ориентированы на веретене, и действительно всегда наблюдалась эффектная би-ориентация. Итак, любое соединение между кинетохорами, которое может создавать натяжение благодаря би-ориентации, достаточно, чтобы облегчить би-ориентацию возможно путем стабилизации соединений кинетохор с микротрубочками от полюсов в митозах, как это происходит в первом мейотическом делении. Это объясняет также, как в клетках позвоночных, где каждая кинетохора может ассоциировать с множественными микротрубочками, одиночная кинетохора может часто стабильно связываться с микротрубочками от противоположных полюсов после потери её сестринской кинетохоры103,104. Итак спина-к-спине геометрия двух кинетохор безразлична для их эффективной би-ориентации на митотическом веретене. Однако, это заключение не исключает зависимого от геометрии механизма для облегчения би-ориентации сестринских кинетохор в митозах. Напр., Aurora-B kinase, как полагают, облегчает би-ориентацию с помощью как tension- , так и geometry-зависимых механизмов105,106 в клетках позвоночных. Одиночные кинетохоры у делящихся дрожжей и в клетках metazoan прикрепляются к множественными микротрубочкам107, а сестринские кинетохоры неспособны би-ориентироваться, если кинетохора захватывается микротрубочками от противоположных полюсов веретена (merotelic прикрепление; FIG. 2). В организмах, у которых возможно merotelic прикрепление, геометрия сестринских кинетохор м. иметь более важную роль для гарантии би-ориентации, чем у почкующихся дрожжей. Тем не менее, если происходит merotelic прикрепление в клетках позвоночных, то оно может быть постепенно исправлено108, так что зависимые от геометрии механизмы не единственные ответственные за избегание этого.
Factors for sister kinetochore bi-orientation
Помимо белков, которые необходимы для прикрепления кинетохор к микротрубочкам, какие ещё факторы необходимы, чтобы гарантировать би-ориентцию сестринских кинетохор на митотическом веретене?
Cohesin. Одним из таких факторов является COHESIN комплекс. Напр., после деплеции cohesin субъединицы Scc1 у почкующихся дрожжей около половины сестринских пар центромер моно-ориентированы, тогда ка др. половина остается би-ориентированной69,72. Несмотря на это в Scc1-истощенных клетках кинетохоры оттаскиваются в направлении полюсов веретена, независимо от того моно- или би-ориентированы они, это указывает на то, что cohesin не нужен для собственно прикрепления кинетохор к микротрубочкам. Между тем, сходные результаты были получены в куриных DT40 клетках109. Фенотипы cohesin-дефектных клеток у др. организмов также согласуются с потребностью в cohesins для гарантии би-ориентации сестринских кинетохор110-112.
Учитывая эти результаты, как же cohesins гарантируют би-ориентацию?
Одна из возможностей заключается в том, что cohesins облегчают би-ориентацию сестринских кинетохор за счет создания натяжения между сестринскими кинетохорами, когда устанавливается би-ориентация. Если это происходит, то д.быть возможно восстановление би-ориентации в Scc1-истощенных клетках путем создания альтернативных способов соединений между сестринскими хроматидами. Это проверялось с помощью инактивации topoisomerase II, которая необходима для разделения (или disentangle) сестринских хроматид после репликации ДНК. Инактивация topoisomerase
II в самом деле приводит, по крайней мере, к частичному восстановлению би-ориентации сестринских кинетохор в cohesin-истощенных клетках DT40 кур113 и почкующихся дрожжей72. Эти данные указывают на то, что роль cohesin заключается не только в облегчении би-ориентации за счет создания физического натяжения соединений, когда они би-ориентированы (FIG. 5).
The Aurora-B-INCENP (Ipl1-Sli15) kinase complex.
Недавние данные подтверждают, что Ipl1-Sli15 киназный комплекс играет критическую роль в би-ориентации хромосом. Ipl1 это единственная AURORA KINASE у S. cerevisiae, a Sli15 кодирует дрожжевой ортолог белка INCENP, который обнаружен в клетках metazoan114-117. Ipl1 и Sli15 формируют комплекс в дрожжах, а Aurora B и INCENP в клетках metazoan. Первые исследования показали, что ipl1 и sli15 мутантные клетки часто приводят к неправильному расхождению хромосом40,41, a затем было установлено, что сестринские центромеры часто притягиваются к одному полюсу (70-80%), когда устанавливается биполярное веретено в этих мутантных клетках42,44,45. После того, как это происходит сестринские центромеры остаются на том полюсе веретена (т.е., они моно-ориентированы), это в конечном итоге приводит к неправильному расхождению хромосом в последующей анафазе. Однако, моно-ориентация в этих мутантных клетках не связана с дефектами в прикреплении кинетохор к микротрубочкам или дефектами в функционировании организации микротрубочек SPB45, это указывает на то, что соединения кинетохор с микротрубочками полюсов происходят, но они неправильно ориентированы в мутантов.
Учитывая, что комплекс Ipl1-Sli15 облегчает би-ориентацию хромосом, то создает ли этот комплекс гарантию спина-к-спине геометрии сестринских кинетохор или способствует зависимой от натяжения коррекции ориентации кинетохор по отношению к полюсам? Чтобы ответить на это изучали поведение нереплицированной минихромосомы с двумя центромерами у ipl1 и sli15 мутантов72. Удивительно, две кинетохоры этой минихромосомы часто моно-ориентированы у этих мутантов. Комплекс Ipl1-Sli15 д., следовательно, быть способен облегчать би-ориентацию независимо от нормальной геометрии сестринских кинетохор.
Более того, нереплицированные хромосомы с одиночными центромерами, к которым натяжение не может быть приложено, обнаруживают дефекты в ре-ориентации между SPBs у ipl1 и sli15 мутантов, указывая тем самым, что комплекс Ipl1-Sli15 способствует пере-ориентации соединений кинетохора--полюс веретена зависимым от натяжения способом, облегчая тем самым би-ориентацию45,72. Syntelic прикрепление приводит к отсутствию натяжения соединений кинетохора--полюс, что, по-видимому, запускает комплекс Ipl1-Sli15 для облегчения пере-ориентации этих соединений (FIG. 5), возможно за счет фосфорилирования компонентов кинетохор. После установления amphitelic прикрепления натяжение прикладывается к соединениям кинетохора--полюс и это создает сигнал к остановке комплекса Ipl1-Sli15, что способствует их пере-ориентации, приводя тем самым к предпочтительному выбору amphitelic способа прикрепления. Как натяжение приводит к остановке пере-ориентации еще предстоит выяснить; если возникает натяжение, то Ipl1 киназа на кинетохорах
может быть инактивирована, субстраты этой киназы могут быть дефосфорилированы, или некоторые др. механизмы могут преодолевать функцию Ipl1.
Тем временем было установлено, что Aurora B необходима для коррекции syntelic прикреплений на amphitelic прикрепления в клетках млекопитающих102,118. У делящихся дрожжей, червей и мух дефекты ортологов Aurora-B таже ведут к нарушению би-ориентации и сегрегации хромосом115,119-124. Итак, Ipl1/Aurora-B киназа гарантирует би-ориентацию хромосом путем обеспечения пере-ориентации соединений кинетохора--полюс веретена в отсутствие натяжения, и эта функция законсервирована от дрожжей до клеток млекопитающих (FIG. 5).
Ipl1/Aurora-B киназа известны также как 'passenger proteins' , т.к. они ре-локализуются с кинетохор на веретено, когда устраняется слипчивость сестринских хроматид, чтобы запустить анафазу116,117. Эта ре-локация Ipl1/Aurora B, как было установлено, зависит от дефосфорилирования Sli15 с помощью Cdc14 фосфатазы в почкующихся дрожжах125, и от деструкции cyclin B у эмбрионов мух126. Если Ipl1/Aurora-B kinases способствуют пере-ориентации прикреплений кинетохор к микротрубочкам в отсутствие натяжения, то эти киназы д. удаляться с кинетохор, чтобы предупредить дальнейшую пере-ориентацию во время анафазы, когда натяжение, прикладываемое к кинетохорам д.быть редуцировано относительно метафазы. Фактически, когда механизм релокации дефектен, а Aurora B поэтому остается на кинетохорах во время анафазы, то кинетохоры пере-ориентируются на веретене и в анафазе126.
Некоторые сообщения также указывают на то, что Ipl1/Aurora-B kinase необходимы, чтобы активировать checkpoint веретена, когда натяжение не прикладывается к кинетохорам (напр., во время syntelic прикрепления)43,102,127-129. Если функция Ipl1/Aurora B может меняться в ответ на натяжение, то было бы идеально совместить скоординированную би-орнтацию сестринских кинетохор с активацией spindle-checkpoint. Киназа может активировать checkpoint вторично путем облегчения пере-ориентации (т.е., с помощью отсоединения сопровождаемого повторным присоединением) ассоциации кинетохора--микротрубочка. Идея, что Ipl1 вызывает временное отсоединение кинетохор от микротрубочек согласуется с наблюдением, что снижение активности Ipl1 нормализует дефектные взаимодействия кинетохора--микротрубочка31. Тем не менее, наши недавние доказательтсва подтвердили, что Ipl1 может активировать checkpoint независимо от своей функции облегчать би-ориентацию (N. Rachidi,
E. King, N. Morrice, K. Hardwick and M.J.R.S., unpublished
observations). Этот вопрос обсуждается также в др. работах (REFS
102,129) для случаев клеток позвоночных.
Glc7 у почкующихся дрожжей и его metazoan ортолог PP1 являются фосфатазами, которые противодействуют Ipl1/Aurora-B-kinase функции130 путем дефосфорилирования субстратов этих киназ131,132 и/или непосредственным регулированием киназной активности (как это предполагается для X. laevis системы яйцевых экстрактов133). Принимая во внимание, что Ipl1/Aurora B важна для содействия би-ориентации, Glc7/PP1 может также быть вовлечена в этот процесс. Если Ipl1/Aurora-B киназа регулирует прикрепление кинетохор к микротрубочкам зависимым от натяжения образом, то glc7 мутанты могут заставлять Ipl1 отсоединять кинетохоры от микротрубочек с более высокой частотой, т.к. обычная противодействующая фосфатазная активность д. редуцироваться у таких мутантов. И в само деле, было установлено, что мутантны glc7 обнаруживают повышенную потерю хромосом и активируют checkpoint веретена131,134, что является показателем отсоединения кинетохор от микротрубочек.
Dam1 complex and other regulators. Разумно предположить, что Ipl1-Sli15-киназный комплекс способствует пере-ориентации соединений кинетохоры--полюс веретена путем фосфорилирования компонентов кинетохор, т.к. комплекс локализуется на кинетохорах с G1 и вплоть до начала анафазы22,44,45,135. Действительно, было установлено, что Dam1
и Spc34 (два компонента Dam1 комплекса кинетохор) фосфорилируются с помощью Ipl1 киназы и это фосфорилирование является критическим для гарантии би-ориентации сестринских кинетохор вообще-то путем ослабления ассоциации между Dam1 и Ndc80 комплексами кинетохор , что облегчает пере-ориентацию соединений кинетохор с микротрубочками19,136. Интересно, что комплекс Dam1 сам по себе необходим для поддержания би-ориентации сестринских кинетохор после её возникновения20. Это в контрасте с Ipl1-Sli15 комплексом. который не нужен для поддержания би-ориентации45. Поддержание би-ориентации, по-видимому, зависит от стабильности прикрепления кинетохор к плюс концам динамических микротрубочек и как недавно было предположено, комплекс Dam1 способствует такому прикреплению кинетохор путем формирования кольца, которое окружает и скользит вдоль микротрубочки137,138. Напр., во время уменьшения микротрубочки такое кольцо на плюс конце микротрубочки д. сдвигаться в направлении полюса по мере того как протофиламенты устраняются (splay out) во время их деполимеризации (FIG. 4, step 4). Итак, комплекс Dam1 является важным Ipl1 субстратом и фосфорилирование Dam1 облегчает пере-ориентацию соединений кинетохор с микротрубочками полюсов и более того комплекс Dam1 функционирует. что бы собственно стабилизировать би-ориентацию.
Ортолог комплекса Dam1 недавно идентифицирован у делящихся дрожжей и также оказался важным для би-ориентации139,140, хотя пока всё ещё неясно, является ли этот комплекс субстратом для Aurora kinase у этого организма. С др. стороны, ортолог комплекса Dam1 еще не идентифицирован в клетках позвоночных. Вместо этого необходимо Aurora-B-зависимое фосфорилирование MCAK (члена семейства kinesin-13 из
microtubule-depolymerizing kinesins81) и CENP-A, чтобы гарантировать би-ориентацию в клетках млекопитающих141-145. MCAK фосфорилирование с помощью Aurora B облегчает также формирование биполярного веретена в яйцевых экстрактах X. laevis146. Следовательно, возможно, что Ipl1/Aurora-B киназа облегчает би-оринетацию путем фосфорилирования множественных мишеней.
Чтобы гарантировать би-ориентацию сестринских кинетохор преимущественно используются механизмы для отслеживания натяжения и изменения соединений кинетохор с микротрубочками. Поэтому не будет сюрпризом, если окажется, что больше регуляторов вовлечены в исполнение этого процесса. В самом деле, компонент кинетохор Sgo1 у почкующихся дрожжей147 и Cdc14-родственная фосфатаза у делящихся дрожжей148 выполняют роль по гарантии би-оринетации, хотя клетки жизнеспособны и без этих факторов. Кроме того, checkpoint белок, BubR1, как полагают, регулирует Aurora B в клетках человека149. Выяснение специфической роли этих факторов в би-ориентации расширит информацию о механизмах би-ориентации.
Kinetochores regulate microtubule dynamics
Перемещение кинетохор во время митозов регулируется в основном с помощью ассоциированных микротрубочек. Однако, регуляция действует и др. способом; т.е. на динамику микротрубочек влияют также ассоциированные кинетохоры.
Напр., когда кинетохоры прикрепляются к боковым поверхностям микротрубочек, то микротрубочки часто восстанавливаются (rescued) за счет добавления тубулиновых димеров к их плюс концу (т.е. к дистальным концам, которые наиболее удалены от полюсов веретена), но такого наращивания не происходит, если кинетохоры не прикреплены7. Такое восстановление микротрубочек, по-видимому, важно для предупреждения кинетохор от соскальзывания с уменьшающихся микротрубочек, т.к. укорочение микротрубочек происходит быстрее, чем средняя скорость транспорта кинетохор в направлении полюсов веретена7. При таком восстановлении микротрубочек, +TIP белок, Stu2, был идентифицирован как критический медиатор7 (FIG. 4). Stu2 локализуется на плюс концах микротрубочек, но его количество уменьшается из-за укорочения микротрубочек. Кроме того, Stu2 располагается также на кинетохорах прежде, чем они будут захвачены микротрубочками. После такого захвата, Stu2 порциями транспортируется с кинетохор вдоль микротрубочек в направлении их плюс концов. Восстановление микротрубочек всегда совпадает с достижением Stu2 плюс конца. Stu2, по-видимому, обусловливает восстановление плюс конов микротрубочек, т.к. Stu2 (REFS 44,48,50,52,53) и его ортологи150-156 могут менять динамику плюс концов микротрубочек.
Даже после того, как сестринские кинетохоры би-ориентируются на митотическом веретене и прикрепляются к плюс концам микротрубочек, динамика микротрубочек продлжает испытывать влияние из-за поведения кинетохор. Напр., во время сборки хромосом в METAPHASE PLATE в клетках позвоночных, деполимеризация микротрубочек на ведущей кинетохоре купирована с полимеризацией микротрубочки на отстающей кинетохоре, а натяжение, прикладываемое к кинетохорам влияет на динамику кинетохора--ассоциированные микротрубочки в metazoan клетках157-161. Имеющиеся доказательства показывают, что CLASP, др. +TIP белок162-165, и MCAK166-169 участвуют в полимеризации и деполимеризации микротрубочек на кинетохорах, соотв. У почкующихся дрожжей кинетохоры движутся динамически между двумя полюсами веретена в метафазе67-70, a Stu2 (вообще-то специфическая фракция Stu2, которой загружены кинетохоры) необходим для этого движения44,53. Математические модели предсказывают, что у почкующихся дрожжей в метафазе динамика кинетохор--ассоциированных микротрубочек на плюс концах (следовательно, возможно и на кинетохорах)зависит от натяжения, прикладываемого к кинетохорам и микротрубочкам
170.
Concluding remarks
Kinetochore capture is the first crucial step for correct
chromosome segregation, whereas subsequent sister
kinetochore bi-orientation is of paramount importance
for equal segregation of the genetic information into
daughter cells. To uncover the mechanisms of kinetochore
capture and bi-orientation, many pertinent
questions remain to be answered. For example, how do
microtubules that extend from spindle poles efficiently
locate and capture kinetochores? If, as seems possible,
microtubules originating from kinetochores might be
involved in the capture process, how are they generated?
After the initial kinetochore–microtubule interaction,
is kinetochore transport towards the spindle
pole dependent solely on microtubule-motor proteins
or are other types of protein also involved? How might
captured kinetochores regulate microtubule dynamics
during attachment to microtubules in both a lateral
and an end-on manner, and how is lateral attachment
converted to the end-on configuration? Last,
what are the mechanisms by which phosphorylation
of kinetochore components by Aurora-B/Ipl1 kinase
leads to re-orientation of the microtubule-mediated
kinetochore–spindle pole connections, and how does
the tension generated following bi-orientation stabilize
the kinetochore–microtubule interaction?
Kinetochore capture and bi-orientation are fundamental
cellular events during mitosis. We therefore
expect that many aspects of the underlying
mechanisms are likely to be conserved from yeast to
vertebrates, even if modifications were added during
the evolutionary process — and this is proving to be
the case. Further studies and comparisons between
the mechanisms in yeast and metazoan cells will shed
more light on these crucial processes that are relevant
for mitosis in all eukaryotic cells.
Сайт создан в системе
uCoz 
Michael J. R. Stark and Kozo Tanaka
