Конечный мозг млекопитающих обнаруживает удивительное разнообразие типов нейронов. Появление этого разнообразия базируется на множественных стратегиях развития, включающих региональное паттернирование предшественников, их временн’ую спецификацию и образовании промежуточных популяций клеток-предшественников. В настоящее время достигнут определенный прогресс в понимании некоторых механизмов такого разнообразия. В частности было показано, что промежуточные предшественники играют важную роль в генерировании нейронов в коре мозга, а с помощью элегантных методов timelapse микроскопии исследованы свойства и взаимосвязи между клетками радиальной глии и их промежуточными предшественниками. Множество путей контролирует преобразование нейральных предшественников из мультипотентных стволовых клеток в промежуточные предшественники, постмитотические предшественники и конечные зрелые нейроны. Достигнут значительный прогресс и в понимании регуляции двух важных этапов – commitment («фиксации») нейронов и детерминация идентичности их подтипов. Эти два этапа четко различимы, но согласованно регулируются общими транскрипционными факторами, такими как нейрогенины (neurogenin) и Pax6. По мере улучшения наших знаний о механизмах спецификации нейронов конечного мозга, появится возможность внедрять стволовые клетки в генерирующие особые популяции нейронов конечного мозга, что открывает путь для эффективной заместительной клеточной терапии.

Конечный мозг млекопитающих в течение долгого времени является моделью для исследования механизмов, лежащих в основе образования новых нейронов и клеток глии у эмбрионов позвоночных. Многое из того, что сейчас известно о природе и свойствах нейрональных предшественников является результатом ранних исследований, проводимых на коре мозга эмбрионов грызунов. Были охарактеризованы родоначальники нервных клеток in vivo и in vitro (1). Совсем недавно были идентифицированы молекулы, регулирующие важные этапы нейрального развития, включая молекулы определяющие принадлежность стволовых клеток к нейрональным и глиальным предшественникам (2), спецификацию нейрональных подтипов и миграцию нейронов (4,5) и снова благодаря исследованиям с использованием конечного мозга в качестве модели. Цель данного обзора – это иллюстрация того, что конечный мозг остается лучшей моделью для исследования клеточных и молекулярных механизмов, лежащих в основе нейрогенеза позвоночных.



Fig.1. Progenitors in the embryonic telencephalon are organized in distinct domains that generate defined neuronal subtypes. This figure represents frontal sections through the mouse embryonic telencephalon at three rostral–caudal levels (rostral to caudal sections are shown from left to right). The dorsal telencephalon includes the choroids plexus (cpe), the cortical heme (ch), medial pallium (mp), dorsal pallium (dp), lateral pallium (lp) and ventral pallium (vp), while the ventral telencephalon includes the dorsal lateral ganglionic eminence (dlge), ventral lateral ganglionic eminence (vlge), medial ganglionic eminence (mge), septum (sep), and caudally, the caudal ganglionic eminence (cge). Distinct populations of Cajal–Retzius cells (CR; calret+ denotes the presence of caretinin) [20,21] and of cortical interneurons (IN; som+, parv+ and calret+ denote the presence of somatostatin, parvalbumin and calretinin, respectively) [18] have been shown to originate from some of these domains. Their migration directions are indicated by arrows.

Конечный мозг, включающий кору и базальные ганглии, обеспечивает координацию движений, эмоции, когнитивные способности и сознание у человека. Это наиболее сложно устроенная область мозга у взрослых млекопитающих, хотя она относительно проста у эмбриона, у которого она состоит из крупных и просто идентифицируемых участков, каждый из которых содержит легко различимые клеточные популяции (РИС.1). Два основных подотдела конечного мозга – это дорсальный конечный мозг (pallium) и вентральный конечный мозг (subpallium) – производят совершенно разные типы нейронов. Герминальная зона дорсального конечного мозга дает начало возбуждающим глутаматергическим проекционным нейронам, последовательно достигающим различных слоев коры через радиальную миграцию. Родоначальники вентрального конечного мозга генерируют GABA-ергические ингибиторные нейроны, включая нейроны базальных ганглиев, а также интернейроны, мигрирующие тангенциально и способствующие формированию коры. Кроме описанных региональных различий, каждый из этих участков конечного мозга дает начало огромному разнообразию нейрональных подтипов. Например, как кортикальные проекционные нейроны, так и интернейроны значительно отличаются по своим молекулярным профилям, морфологии, способности к взаимодействию и физиологическим свойствам (6,7). Появление такого разнообразия клеток в нервной системе обусловлено множеством механизмов развития, включая переднее-заднее и дорсо-антральное паттернирование, временну’ю спецификацию и появление вторичных или промежуточных популяций клеток-предшественников. Все эти механизмы изучаются особенно активно на модели конечного мозга. Некоторые из этих исследований обсуждаются в данном обзоре.

Обзор состоит из двух частей. В первой части обсуждаются клеточные аспекты нейрогенеза, разные типы предшественников нейронов, их свойства и взаимосвязи. Во второй части обсуждаются некоторые молекулы, регулирующие ключевые этапы нейрогенеза конечного мозга. Авторы не обсуждают нейрогенез во взрослом мозге, т.к. об этом можно прочесть в недавно вышедшем обзоре Tramontin с соавт (8).

Клетки предшественники в конечном мозге

Три отличающихся друг от друга популяции клеток генерируют нейроны и клетки глии в эмбриональном конечном мозге (РИС.2). Нейроэпителиальные клетки, формирующие стенку нервной трубки в начале нейрогенеза, дают начало самым ранним нейронам коры и двум другим популяциям предшественников – клеткам радиальной глии и базальным предшественникам (basal progenitors). Клетки радиальной глии подобно нейроэпителиальным клеткам, достигают внутренней (вентрикулярной) и наружной (относящейся к мягкой мозговой оболочке – pial) поверхности нервной трубки и делятся у вентрикулярной поверхности, однако они отличаются по экспрессии глиоспецифических маркеров (9). В дорсальном конечном мозге клетки радиальной глии появляются вскоре после начала нейрогенеза (Е12-Е13 у мышей). Исследования по картированию судьбы клеток показало, что клетки радиальной глии дают начало прямо или через образование базальных предшественников проекционным нейронам коры мозга, тогда как их вклад в образование нейронов базальных ганглиев и кортикальных интернейронов остается пока под вопросом (9-11).

Третий тип предшественников, которые достаточно изменчивы – это базально-, интермедиально-, абвентрикулярно- (abventricular) или внеповерхностно- делящиеся предшественники, отличаются от остальных групп тем, что утрачивают вентрикулярную локализацию (присязку) и делятся вне вентрикулярной поверхности. Такие «внеповерхностно-делящиеся» клетки были известны давно, однако степень их вклада в кортикальный нейрогенез была оценена лишь недавно – показано, что именно эти клетки могут давать начало большинству кортикальных проекционных нейронов (12, 13). Базальные предшественники, которые могут быть визуализированы у GFP репортерных мышей, обнаруживаются в конечном мозге сразу как только начинается нейрогенез и задолго до того как они формируют гистологически отличимую субвентрикулярную зону (SVZ). Это подтверждает то, что они генерируют рано- и поздно-рожденные нейроны (12).



Fig.2. Several types of progenitors contribute to neurogenesis in the mammalian cortex [12–14]. (a) At the beginning of neurogenesis (around E11–E12 in the mouse), neuroepithelial cells located in the ventricular zone (VZ) and undergoing interkinetic nuclear migration either divide symmetrically to generate two new neuroepithelial cells or divide asymmetrically to generate either a neuroepithelial cell and a neuron, which migrates to the preplate (PP), or a neuroepithelial cell and a basal progenitor, which divides symmetrically on the basal side of the VZ (bVZ) to generate two neurons. (b) As neurogenesis progresses (around E13–E17 in the mouse), several signalling pathways induce the expression of glial markers by neuroepithelial cells, which thus become radial glial cells. These cells also divide either symmetrically, to generate two radial glial cells, or asymmetrically, to generate a radial glial cell and either a neuron, which migrates through the intermediate zone (IZ) into the cortical plate (CP), or a basal progenitor, which moves to the subventricular zone (SVZ) and divides symmetrically to generate two neurons. MZ, marginal zone.

С помощью метода time-lapse микроскопии было показано, что клетки радиальной глии и базальные предшественники продуцируют нейроны при помощи разных механизмов (РИС.2). Клетки радиальной глии делятся, как правило, асимметрично. В результате одних делений появляются другие клетки радиальной глии и постмитотические нейроны, в результате других делений - также клетки радиальной глии и базальные предшественники (12-14). В отличие от этого, базальные предшественники всегда делятся симметрично и продуцируют, главным образом, два нейрона (12-14). Оба способа нейрогенеза протекают одновременно во время кортикального развития, хотя на поздних стадиях нейроны образуются чаще из базальных предшественников.

Кроме разных способов деления, радиально-глиальные/ вентрикулярные и базальные/ субвентриулярные предшественники также различаются по продолжительности клеточного цикла – у них более продолжительный G2 период для SVZ предшественников (15). Об экспрессии их молекулярных маркеров можно прочесть в обзорах (6, 16). Только базальные предшественники экспрессируют нейрональные маркеры, указывая на то, что они являются родоначальниками нейронов. Имеется четкая корреляция между положением делящихся предшественников (базальное или апикальное), способом их деления (асимметричное или симметричное) и их потенциалом развития (мультипотентное или нейрональное), а это предполагает, что локальное окружение предшественников может влиять на способ их деления и их судьбу. Остается однако неясным, продуцируют ли асимметрично делящиеся клетки радиальной глии и симметрично делящиеся базальные предшественники разные типы нейронов, а, следовательно, играет ли экспансия SVZ в конечном мозге млекопитающих важную роль в появлении разнообразия нейронов (6).

Региональная спецификация предшественников – хорошо изученный механизмом, с помощью которого образуется многообразие нейронов. В конечном мозге как дорсальные, так и вентральные последовательные подотделы содержат домены множественных предшественников, продуцирующие разные типы нейронов (РИС. 1, обзор 17). Еще не установлено, все ли клеточные популяции конечного мозга имеют отношение к особым доменам предшественников, но недавние эксперименты частично заполнили этот пробел для подтипа кортикальных интернейронов, которые, как оказалось, происходят из особых вентральных доменов конечного мозга (18) (РИС.1). Как оказалось, клетки Кахаля-Ретциуса (Cajal–Retzius - CR ) – популяция рано возникающих клеток (происхождение которых долго оставалось загадкой), играющих важную роль в миграции нейронов коры (19), также генерируются из дискретных доменов предшественников. Три области, локализованные на границах дорсального конечного мозга, продуцируют CR клетки (это было показано методом «картирования судьбы клеток») (20, 21) (РИС.1). CR клетки, генерированные в этих разных ограниченных участках, имеют необычно высокую степень гетерогенности по своим путям миграции и молекулярным фенотипам.

Молекулярный контроль выбора пути родоначальниками нейронов

Fig.3. Some of the pathways that regulate the generation of telencephalic neurons or astrocytes by neural stem cells. Several signalling pathways have been shown to promote the self-renewal of telencephalic stem cells and to interact (the FGF and Notch pathways [25], and the FGF and Wnt/b-catenin pathways [39]). Cross-talk between signalling pathways is also important for astrocyte differentiation, and some of the mechanisms underpinning the synergy between signalling pathways in the activation of the astrocyte differentiation marker GFAP have been identified [38,66]. These pathways have been studied in the cerebral cortex, except for GDNF, which is involved in cortical interneuron differentiation (IN) [61] and the Gsh2/RA pathway, which is involved in striatal neuron differentiation (STR) [60].

В настоящее время пути, регулирующие нейрогенез в конечном мозге, в целом идентифицированы (РИС.3). Их механизмы не всегда хорошо поняты, но, по крайней мере, в некоторых случаях было установлено, что они связаны с регуляцией перехода от одной стадии предшественников к другой – т.е. из нейроэпителиальной клетки к клетке радиальной глии или от клетки радиальной глии к базальному предшественнику. Большинство путей, регулирующих нейрогенез в конечном мозге, контролирует множественные этапы процесса нейрогенеза. Например, самовосстановление и нейрональное commitment (направление, выбор) или нейрональное commitment и спецификацию подтипов предшественников. Имеется некоторое пересечение, взаимное влияние между сигнальными путями. Некоторые из этих комбинаций сигналов уже изучены. К сожалению, немного известно о механизмах, модулирующих активность транскрипционных факторов и определяющих, каким образом они выбирают именно ту роль, которая требуется для нейрогенеза.

Выбор стволовыми клетками их нейрональной судьбы

Множество сигнальных путей и ядерных факторов участвуют в самообновлении стволовых нервных клеток, включаясь в их пролиферацию и/или поддержание их недифференцированного состояния. В обзоре обсуждаются лишь исследования, касающиеся регуляции появления стволовых нервных клеток и клеток предшественников. О пролиферации предшественников можно прочесть в обзоре (22).

Хорошо известно, что Notch сигнальный путь и его основные эффекторы – Hes белки - участвуют в удержании предшественников в недифференцированном состоянии и их изоляции от сигналов спецификации (детерминации), поэтому предшественники, которые избегают Notch ингибирования в разные периоды времени, имеют иную судьбу (23, 24). Однако оказалось, что Notch сигналы оказывают влияние на клетки предшественники не прямым путем. Недавно было показано, что Notch1 активация влияет на особую популяцию клеток предшественников – радиальную глию (25,26). Активность Notch1 действительно ограничивается клетками радиальной глии (27), а Notch сигналы прямым способом активирует маркер радиальной глии – brain lipid binding protein (BLBP) (28). В стриатуме Notch активность требуется только во время периода нейрогенеза, когда предшественники делятся асимметрично, а различные комбинации Notch рецепторов необходимы для появления рано- и поздно-рожденных нейронов стриатума (29). Эндотелиальные клетки, являющиеся «убежищем» и источником стволовых нервных клеток как в эмбриональном, так и во взрослом мозге, секретируют растворимые факторы, стимулирующие Notch сигнализирование и, следовательно, самообновление стволовых нервных клеток, возможно путем тесных межклеточных контактов, которые необходимы для Notch активирования (30).

FGF сигнальный путь запускает сходные с Notch реакции в предшественниках конечного мозга – также способствует самообновлению клеток, возможно, через активирование Olig2 (31) и индуцирует радиально-глиальный фенотип, что подтверждает возможное взаимодействие между этими двумя сигнальными путями в поддержании популяции предшественников (25)

Numb относится к внутриклеточным ингибиторам сигналов Notch, который у беспозвоночных играет важную роль в определении судьбы дочерних клеток асимметрично делящихся предшественников. У мышей утрата Numb и отчасти избыток гена Numb-like ведет к тяжелым дефектам кортикогенеза (32, 33). Однако эти дефекты могут быть разной степени выраженности - от гиперпролиферации мутантных кортикальных предшественников до преждевременной нейрональной дифференцировки в зависимости от того, когда в коре исчезает Numb активность (32,33, обсуждение в 34). Это свидетельствует о том, что Numb и Numb-like играют сложную роль в нейрогенезе, в который вовлекаются взаимодействия с другими путями, а не только с Notch. Разрушение гена клеточной полярности Lgl1 ведет к утрате асимметричной локализации Numb и к гиперпролиферации кортикальных предшественников, подтверждая тем самым то, что Lgl1-опосредованная локализация Numb на апикальной мембране необходима для поддержания асимметричных делений и нейрогенеза (35).

Wnt сигнальная система также играет важную и сложную роль в регуляции активности стволовых нервных клеток. В коре стабилизированная форма β- catenin способствует либо самообновлению (36), либо нейрональной дифференцировке предшественников (37) в зависимости от того, когда он экспрессируется во время кортикального развития. Это подтверждает то, что временн’ой механизм корректирует ответ кортикальных предшественников на Wnt сигналы (38). Было также установлено, что FGF сигналы модифицируют реакцию кортикальных предшественников на β- catenin, опосредуя переключение от пролиферации (в присутствии FGF2) на нейрональную дифференцировку (в его отсутствии) (39). Вклад FGF в этот временной механизм, как уже предполагалось для временн’ого контроля дифференцировки астроцитов, неизвестен и является предметом будущих исследований (40).

Пролиферативная активность, зависимая от Wnt сигнализирования в коре, опосредуется Emx2 (41), тогда как его роль в нейрональной дифференцировке может заключаться в непосредственной транскрипционной активации проневрального bHLH gene Neurogenin1 посредством TCF/ β-catenin комплекса (37, 39). Сверхэкспрессия Neurogenin2 приводит к тому, что предшественники в вентрикулярной зоне делятся вдали от желудочка (13), подтверждая, что Wnt сигнальная система может стимулировать образование нейронов, превращая клетки радиальной глии в базальные предшественники. Такая активность предполагалась для Wnt7a/b также в синергизме с другими сигнальными молекулами – FGF2 и Shh (42). В любом случае путь Wnt/Neurogeni действует инструктивно и способствует выбору пути мультипотентных стволовых нервных клеток по нейрональной линии (38, 43, 44).

Прогрессивное начало экспрессии невральных генов, которые маркируют определенные предшественники для развития их по нейрональному пути и их последующую дифференцировку, включает не только транскрипционные активаторы, такие как проневральные bHLH белки (3), но и транскрипционный репрессоры. Известно, что REST/NRSF – фактор, репрессирующий гены в не-нейральных клетках, является важным регулятором, от которого зависит развитие клеток по нейральному пути (45). Переход от плюрипотентных стволовых клеток к стволовым нервным клеткам и затем к нейронам включает прогрессивное уменьшение REST связывания с нейрональными промоторами. Более того, время экспрессии нейральных генов может регулироваться разной аффинностью REST связывающих участков – так, ранняя экспрессия проневрального гена Mash1 коррелирует с более низким связыванием REST с Mash1 геном, чем невральные гены, экспрессирующиеся в более поздние сроки (45).

Астроциты имеют множество общих маркеров с клетками радиальной глии (9). Однако дифференцировка астроцитов происходит не по «умолчанию», для этого необходимы инструктивные сигналы, действующие через множественные интерактивные пути, включающие BMP/Smad, JAK/STAT и Notch пути (38,46,47). Как и во всей нервной системе, астроциты в коре образуются после нейронов. В отсроченной экспрессии маркера дифференцировки астроцитов GFAP участвует множество механизмов, включающих ингибиторную роль проневральных белков во время нейрогенетической фазы (44), саморегулирующую активность JAK/STAT пути (46) и эпигенетические модификации как GFAP , так и генов JAK/STAT пути, которые блокируют активность этого пути на ранних этапах кортикального развития и способствуют активности на более поздних стадиях развития (38,40,48,49).

Детерминация и дифференцировка отдельных подтипов нейронов

Принадлежность мультипонентных стволовых клеток к «клану» нейронов и спецификация нейрональных предшественников представляют два концептуально отличных этапа нейрогенеза. Пока еще они связаны механистически, т.к. гены определяющие направление нейронального развития, контролируют нейрональную идентичность. Известна история с проневральными генами Neurogenin1 и в особенности с Neurogenin2, которые не только способствуют нейрогенезу (43, 44) и дорсальным признакам нейронов конечного мозга через репрессию вентрального проневрального гена Mash1 (50), но и определяют многие аспекты фенотипа кортикальных проекционных нейронов, включая фенотип их глутаматергической нейротрансмиссии и морфологию дендритов (51, 52). Удивительно, что только Neurogenin гены нужны для спецификации рано-рожденных кортикальных нейронов, заселяющих самые глубокие слои коры (51). Важно и то, что роль Neurogenin2 в детерминации морфологии дендритов и содействии радиальной миграции может быть иной, чем его роль, определяющая направление нейронального развития, поскольку только в первом случае необходимо фосфорилирование особого тирозинового остатка внешнего bHLH домена (52).

Другие факторы имеют дополнительное значение в отношении Neurogenin1/2 и контролируют появление поздно-рожденных поверхностно-локализованных кортикальных нейронов. Известен случай со спаренным доменом и гомеобоксным белком Pax6 и с ядерным рецептором Tlx: эти белки действуют синергически при дорсально-вентральном паттернировании конечного мозга и позже в генерировании поверхностных нейронов коры (6,51, 53). Несколько новых транскрипционных факторов с интересным паттерном кортикальной экспрессии, ограниченным базальными предшественниками и поверхностными нейронами, также играют заметную роль в детерминации этого подтипа кортикальных нейронов (6). Оказалось также, что Pax6 участвует в появлении интернейронов обонятельных луковиц (54) – популяции нейронов, которая в отличие от кортикальных нейронов, происходит из вентрального конечного мозга и продолжает генерироваться у взрослых организмов (55). Pax6 необходим для появления обонятельных нейронов, способствуя нейрогенезу вместе с проневральным белком Mash1 (56) и детерминируя особые подтипы обонятельных нейронов – дофаминергических перигломерулярных (periglomerular) нейронов (54). Как и в случае Neurogenin2 функции Pax6 могут быть экспериментально разобщены (54), указывая на то, что эти два действия являются действительно отдельными, хотя механистически они связаны общими транскрипционными регуляторами.

Детерминация нейрональной идентичности определяется не только факторами, действующими инструктивно для обеспечения определенной судьбы клеток, но и факторами, подавляющими альтернативную судьбу клеток. Foxg1 - winged helix transcription factor, экспрессируемый большинством предшественников конечного мозга, регулирует пролиферацию и клеточную судьбу как в дорсальном, так и в вентральном конечном мозге (57-59). В коре Foxg1 подавляет предопределенную судьбу CR клеток. Является ли это частью временн’ого механизма, необходимого для того чтобы кортикальные предшественники адаптировались к более поздней клеточной судьбе (58), или это осуществляется посредством регуляции пространственного паттернирования и ограничениями CR судьбы по отношению к кортикальным границам, остается пока неизвестным (20, 21, 59). Как только судьба постмитотического предшественника становится детерминированной, он еще должен мигрировать в место своего окончательного расположения, приобрести морфологию зрелых дендритов и выжить до тех пор, пока его аксон достигнет соответствующей ему мишени. Недавно идентифицировано несколько генетических программ, контролирующих поздние этапы дифференцировки нейронов конечного мозга. В дифференцировке проекционных нейронов стриатума участвуют сигналы ретиноевой кислоты, индуцированные паттернирующим геном Gsh2 (60). Glial-derived neurotrophic factor (Gdnf) принимает участие в росте аксона и приобретении нейрональной морфологии кортикальными интернейронами (61), тогда как Dlx1, необходимый в избытке вместе с Dlx2 для тангенциальной миграции кортикальных интернейронов способствует выживаемости и приобретению зрелой морфологии подтипов кортикальных интернейронов (62). Сравнительно мало известно о факторах, регулирующих дифференцировку кортикальный нейронов, хотя Neurogenin2, который транзиторно экспрессируется в постимитотических и премиграционных предшественниках (52,63), играет важную роль в начале этого процесса (52). Очевидно, что предстоит исследовать регуляторные сети, лежащие в основе дифференцировки постмитотических предшественников в разные типы зрелых нейронов.

Заключение

Многие случаи инсультов и наиболее распространенные нейродегенеративные заболевания человека ведут к утрате нейронов в определенных областях конечного мозга. Такая утрата почти невозместима, т.к. только часть эндогенных предшественников во взрослом мозге является нейрогенной и эти предшественники продуцируют лишь небольшую часть от всех типов нейронов в ограниченной зоне конечного мозга (8,64). Авторы надеются, что выявлению путей в эмбриональной конечном мозге, определяющих судьбу клеток, помогут новые методы, с помощью которых можно будет генерировать новые нейроны соответствующих типов в разных участках взрослого мозга, и т.о. появится перспектива клеточно-заместительной терапии для восстановления мозга. На самом деле некоторый прогресс уже достигнут в генерации регионально специфических нейронов конечного мозга из эмбрионвльных стволовых клеток (65). Тем не менее, предстоит исследовать пути контролирующие появление огромного массива нейронов конечного мозга, и их дальнейшую интеграцию в нейральные цепи и тогда наши надежды на клеточную терапию станут реальностью.

Литература