The role of the forkhead transcription factor, Foxc1, in the development of the mouse lacrimal gland
 Developmental Dynamics Volume 235, Issue 4, | |
|
The lacrimal gland produces secretions that lubricate and protect the cornea of the eye. Foxc1 encodes a forkhead/winged helix transcription factor required for the development of many embryonic organs. Autosomal dominant mutations in human FOXC1 cause eye disorders such as Axenfeld-Rieger Syndrome and glaucoma iris hypoplasia, resulting from malformation of the anterior segment of the eye. We show here that lacrimal gland development is severely impaired in homozygous null Foxc1 mouse mutants, with reduced outgrowth and branching. Foxc1 is expressed in both the epithelium of the lacrimal gland and the surrounding mesenchyme. FGF10 stimulates the growth and branching morphogenesis in cultures of wild type and Foxc1 mutant gland epithelial buds. However, using micromass culture of lacrimal gland mesenchyme, we show that Bmp7 induces wild type mesenchyme cells to aggregate, but Foxc1 mutant cells do not respond. This study demonstrates that Foxc1 mediates the BMP signaling required for lacrimal gland development.
|
Слезные железы продуцируют секрет, который смазывает и защищает безсосудистую роговицу. Недостаточная продукция слез приводит к болезням поверхности глаз, таким как синдром сухих глаз, который затрагивает более 10 миллионов людей только в США (Rios et al.,[2005]). Sjogrens синдром является довольно распространенным аутоиммунным нарушением. характеризующимся сухостью глаз и рта, который затрагивает как слюнные, так и слезные железы (Fox,[2005]). В некоторых случаях аномалии слезных желез, ведущие к отсутствию смазки роговицы приводят к изъязвлениям и слепоте (Knop et al.,[2003]). Несмотря на превалирование синдрома dry eye и сходных нарушений слезных желез, относительно мало известно о развитии и физиологии слезных желез. У мышей развитие слезных желез начинается на ст. E13.5 с эктодермального отпочкования от конъюнктивального fornix на височном аспекте глаз. Первичная почка увеличивается в каудальном направлении в окружающую мезенхиму. происходящую из нервного гребня. Между E15.5 и E16.5, почка подвергается морфогенезу ветвления (branching morphogenesis), формируя крупную вне-орбитальную долю и маленькую внутриорбитальную долю (Makarenkova et al.,[2000]). Зрелая железа состоит из клеток эпителия протоков и серозных ацинусов, окруженных миоэпителиальными клетками, а также кровеносными сосудами и нервами (Rios et al.,[2005]).
Несколько ключевых сигнальных путей участвуют развитии слезных желез. Fibroblast growth factor 10 (Fgf10) способствует пролиферации эпителия слезных желез (Makarenkova et al.,[2000]; Entesarian et al.,[2005]), а транскрипционный фактор Pax6 может действовать как фактор компетентности слюнных желез в конъюнктивальном эпителии (Makarenkova et al.,[2000]). Bmp7 экспрессируется как в эпителиальном, так и мезенхимном компонентах слюнных желез, а нулевые мутантны Bmp7 имеют редуцированные размеры и ветвление слюнных желез (Dean et al.,[2004]). Считается, что Bmp7 действует в первую очередь на мезенхиму слезных желез, способствуя пролиферации и конденсации мезенхимы, чтобы регулировать морфогенез ветвления. Каноническая передача сигналов Wnt модулирует уровни Fgf10 в мезенхиме и супрессирует Bmp-индуцированную пролиферацию, способствуя негативной регуляции морфогенеза ветвления слезных желез (Dean et al.,[2005]).
В данном исследовании мы изучали роль forkhead транскрипционного фактора, Foxc1, в элонгации и морфогенезе ветвления слезных желез. Foxc1 гомозиготные нулевые мутантные мыши погибают перинатально от геморрагической гидроцефалии. Они также имеют тяжелые скелетные, сердечнососудистые и глазные аномалии, включая отсутствие передней камеры и открытые глаза при рождении (Kidson et al.,[1999]; Kume et al.,[1998]; Hong et al.,[1999]). По своему описанию фенотипа Foxc1ch (congenital hydrocephalus) нулевых мутантов, Green ([1970]) сообщает о редукции размеров слезных желез, но дальше это не исследовалось. Здесь мы показали, что фенотип Foxc1-/- обусловлен редукцией выростов и ветвления мутантных желез как in vivo , так и в культуре органов. Мы также установили, что Foxc1 экспрессируется в эпителии и мезенхиме. Мы также использовали культуру изолированных тканей, чтобы выяснить различия в реакциях мутантных и нормального типа эпителия и мезенхимы на индивидуальные сигнальные факторы, участвующие в регуляции развития слезных желез.
RESULTS Foxc1 Is Expressed in the Developing Lacrimal Gland Рис.1. | Foxc1 is expressed in both mesenchyme and epithelium of the developing lacrimal gland. All figures show Foxc1lacZ staining except F and G. A: Whole mount preparation at E14.5 when the Foxc1-positive lacrimal bud extends from the conjunctival epithelium. B: At E16.5, branching has begun in the main lobe, and the intraorbital lobe has formed (arrowhead). Foxc1 is expressed in the duct and budding epithelium. C: At E18.5, Foxc1 expression continues in the epithelium of the main lobe and the less highly branched intraorbital lobe (arrowhead) and parotid gland (arrow). D,E: Cross sections through lacrimal glands at E16.5 reveal that Foxc1 is expressed in bud and duct epithelium and mesenchyme, especially surrounding the tips of the epithelial buds (arrowheads in E). F: In situ hybridization with the Foxc1 anti-sense probe reveals high levels of expression in the epithelium and confirms expression in the mesenchyme. G: No signal is seen with sense strand control. H-J: Sections through lacrimal glands at E18.5 show expression in both epithelium of the duct and buds, and the mesenchyme (arrowheads). K: No staining is seen in wild-type samples not containing the lacZ allele. Scale bars = 1 mm (A-C), 100 m (D, F-I, K), 50 m (E, J). Foxc1 Is Essential for Normal Morphology of the Lacrimal Gland Рис.2. | Foxc1 is required for normal development of the lacrimal gland. A,E: At E16.5, Foxc1+/lacZ lacrimal glands have begun branching and extend out from the conjunctival epithelium. B,F: In comparison, the Foxc1 mutant glands show reduced branching and elongation. Lacrimal buds are thicker and shorter. C,G: By E18.5, Foxc1+/lacZ lacrimal glands consist of an extensively branched main lobe, and a smaller, intraorbital lobe (arrowhead). D,H: Foxc1 mutant glands lack an intraorbital lobe and the main lobe has significantly fewer branches. I: Quantification of the total gland length and (J) number of acini in control (black bars) and Foxc1 mutant (white bars) lacrimal glands. *P < 0.05, n = a minimum of 6 in all groups. K-N: E-cadherin (green staining) is expressed in the epithelial component of the lacrimal gland in both wild type (K and L) and Foxc1 mutant embryos (M and N). Nuclei are counterstained with propidium iodide (red staining). Smooth muscle actin (yellow staining) is expressed in the mesenchyme in both wild type (M) and Foxc1 mutant (N) lacrimal glands. Nuclei are counterstained with DAPI (blue nuclei). Scale bars = 1 mm (A-D), 100 m (E-H, K, M, O, Q), 50 m (L, N, P, R). Foxc1 Is Required for Branching Morphogenesis of the Lacrimal Gland Рис.3. | Foxc1 is required for normal branching morphogenesis of the lacrimal gland. Examples of whole lacrimal explants from E15.5 embryos from two different wild type (A-D) or Foxc1 mutants (E-H) that were cultured for 48 hr. At the start of the culture period, glands contained between 1-6 buds. After 48 hr, wild type glands showed extensive branching (C and D). In comparison, Foxc1 mutant glands had fewer branches and individual branches were longer and wider (G and H). I: Quantification of the increase in bud number from wild type (black bars) and Foxc1 mutant (white bars) lacrimal glands starting from 1-3 or 4-6 buds. Branching is significantly reduced in mutant glands (*P < 0.05, n = 9 mutant glands, n = 19 wild type glands). Scale bars = 200 m (A-H). Foxc1 Is Not Required for FGF-Induced Proliferation of the Lacrimal Gland Epithelium Рис.4. | Foxc1 is not required for FGF-induced proliferation of the lacrimal gland epithelium. A-D: In the absence of FGF, epithelial buds in MatrigelTM droplets from E15.5 wild type (A and B) and Foxc1 mutant embryos (C and D) showed little extension or proliferation. E-H: The addition of 100 ng/ml FGF10 to the medium resulted in extension of the epithelial buds from both wild type (n = 15, E and G) and Foxc1 mutant (n = 11, F and H) glands. I,J: BrdU staining indicates that addition of exogenous FGF10 results in equal proliferation in both wild type (n = 20, I) and Foxc1 mutant glands (n = 17, J). Cultures were repeated three times for each condition. K,L: Fgf10 is expressed in the mesenchyme of lacrimal glands in both wild type (K) and Foxc1 (L) null mutants. Scale bars = 100 m (A-D,I,J), 200 m (E-H), 500 m (K,L). Foxc1 Is Required for the Response of Mesenchyme to Exogenous Bmp7 Рис.5. | Foxc1 is required for the response of mesenchyme to Bmp7. A,B: Bmp7 is expressed in the epithelium (outlined in dashed lines) and weakly in the mesenchyme of both wild type (A) and Foxc1 mutant (B) glands. C-F: Isolated mesenchymal cells stained with Syto13. In the absence of Bmp7, wild type (C) and Foxc1 mutant mesenchyme (D) at E15.5 showed little aggregation over a 48-hr period, and remained fairly evenly distributed over the plating area. E,G,H: Addition of 100 ng/ml Bmp7 to wild type cells caused changes in cell morphology and distribution. After 48 hr, the cells were elongated (arrowheads in H), and had aggregated to form large clusters as visualized by Syto13 staining (G) or phase contrast (H). F: Addition of Bmp7 did not induce changes in either cell distribution (F) or morphology (I,J) in Foxc1 mutant gland mesenchyme cells. Cultures were repeated three times for each condition with each culture containing cells pooled from three different glands. Scale bars = 200 m (A,B), 100 m (D-F), 50 m (H-J). DISCUSSION Несколько линий доказательств указывают на то, что Foxc1 играет важную роль в регуляции морфогенеза ветвления слезных желез. Появление первичной почки у всех нулевых Foxc1 мутантных эмбрионов указывает на то, что ген не нужен во время индуктивной фазы развития желез. Однако, последующее развитие мутантных желез приводит к образованию коротких протоков, меньшему количеству дистальных ответвлений, аномальной форме терминальных почек и к полному отсутствию внутриорбитальной доли. Мы показали, что один из первичных дефектов в железах мутантов Foxc1 скорее всего обусловлен реакцией мезенхимы желез на Bmp7, хотя и др. первичные дефекты не могут быть исключены в настоящее время. Foxc1 Is Not Involved in the Response of Lacrimal Gland Epithelium to FGF10 Генетический анализ показал, что Fgf10, который экспрессируется в мезенхиме, необходим для нормального развития слезных желез. FGF10 достаточен для индукции слезного зачатка из конъюнктивального эпителия (Govindarajan et al.,[2000]), а у Fgf10 нулевых мышей эпителиальный компонент слезных желез полностью отсутствует (Makarenkova et al.,[2000]; Entesarian et al.,[2005]). Изолированный эпителиальный слезный зачаток отвечает на FGF10 пролиферацией, но без морфогенеза ветвления, указывая тем самым, что первичное действие FGF10 на эпителий стимулирует деления эпителиальных клеток и вырост/элонгацию. Нами было показано, что эпителий изолированных слезных зачатков от Foxc1 нулевых мышей отвечает нормально на FGF10 повышенной пролиферацией и элонгацией. Кроме того, нет существенных различий в экспрессии Fgf10 в мезенхиме слезных желез Foxc1-/- эмбрионов по с равнению с нормальными эмбрионами. Всё это подтверждает, что Foxc1 не нужен для FGF-индуцируемых пролиферации и морфогенеза в эпителии слезного зачатка. Foxc1 Functions in the Mesenchyme to Mediate Responses to Bmp7 Bmp7 экспрессируется и в эпителии и мезенхиме развивающихся слезных желез, а Bmp7 нулевые эмбрионы имеют редуцированные слезные железы (Dean et al.,[2004]). Целые слезные железы, подвергнутые воздействию экзогенного Bmp7 обнаруживают увеличение количества эпителиальных зачатков, но не обнаруживается реакции в эпителии желез, отделенном от мезенхимы. Напротив, обработка изолированной мезенхимы с помощью Bmp7 вызывает повышение пролиферации, агрегации и экспрессии маркеров дифференцированных типов клеток (Dean et al.,[2004]). Мы подтвердили находки, что экзогенный Bmp7 ведет к агрегации мезенхимы дикого типа слезных желез в культуре. Существенно, однако, что Foxc1 мутантная мезенхима неспособна отвечать на передачу сигналов Bmp. Foxc1 участвует также как медиатор передач сигналов Bmp в др. типах клеток. Мезенхимные клетки мутантных эмбрионов Foxc1 плохо дифференцируются в хрящ в micromass культуре и не отвечают на факторы, такие как Bmp2 и TGF1, которые способствуют хондрогенезу (Kume et al.,[1998]). Процесс хондрогенеза нуждается в агрегации клеток и увеличении межклеточной адгезии, указывая тем самым, что Foxc1 обычно обеспечивает усиление активности этих процессов в мезенхимных клетках мишенях в ответ на Bmps и TGF. Сходным образом, развитие костей свода черепа нуждается в конденсации мезенхимных клеток, которые затем пролиферируют и дифференцируются в остеобласты (Rice et al.,[2003]). Foxc1 регулирует BMP-обусловленную пролиферацию osteoprogenitor, необходимую для хода остеогенеза, в результате чего отсутствует calvarium, что ассоциирует с гидроцефалией у мутантов Foxc1.
Базируясь а этих наблюдениях, возможны две не взаимоисключающие модели роли Foxc1 в развитии слезных желез посредством передачи сигналов Bmp7 в мезенхиме. Во-первых, Bmp7 может способствовать агрегации мезенхимных клеток, которые проникают в терминальный эпителиальный зачаток в процессе, известном как расщепление (clefting), приводящем к ветвлению эпителия. Этот процесс был описан во время морфогенеза ветвления слюнных желез, где белок внеклеточного матрикса fibronectin, обеспечивает агрегацию мезенхимы, что существенно для формирования расщепления, которое инициирует разветвление эпителия (Sakai et al.,[2003]). У мутантов Foxc1 мезенхима неспособна отвечать на Bmp7 агрегацией и миграцией в эпителиальную терминальную почку, чтобы создать богатую фибронектином щель (Sakai et al.,[2003]). Дальнейшие эксперименты необходимы, чтобы тестировать эту гипотезу. Однако, следует отметить, что аномалии во внеклеточном матриксе были отмечены и в др. Foxc1 нулевых фенотипах, включая развитие трабекулярной сети в переднем сегменте глаз (Smith et al.,[2000]) и прехондрогенной мезенхимы (Kume et al.,[1998]).
Согласно второй гипотезе передача сигналов Bmp может быть необходима для создания сигнальных центров внутри мезенхимы вблизи кончиков почки, которые и управляют процессом ветвления. Сигнальные центры, как полагают, включают и эпителиальные и мезенхимные клетки, здесь небольшие группы тесно ассоциированных клеток секретируют факторы и отвечают на стимулы, позволяющие прогрессивное развитие одиночной эпителиальной почки в структуру со многими веточками (Hogan,[1999]). Пролиферация и агрегация мезенхимных клеток являются реакциями, характерными для сигнальных центров, которые являются критическими для морфогенеза ветвления. Bmp7 может быть компонентом таких сигнальных центров, необходимых для ветвления слезных желез (Dean et al.,[2004]). Согласно этой модели, мутантные мезенхимные клетки не способны агрегировать , чтобы создавать локальные источники вторичных факторов. которые способствуют разрастанию почки, хемотаксису и/или ветвлению.
Подтверждает нашу гипотезу, что Foxc1 опосредует реакцию мезенхимы на Bmps, то, что обработка эксплантов целых желез ингибиторами Bmp, noggin и follistatin, продуцирует меньше, но более крупные почки, по сравнению с нормой, как это наблюдается в железах мутантов Foxc1 (Dean et al.,[2004]). Эта модель не утверждает, что Bmp7 является единственным Bmp членом, активным в морфогенезе желез. Bmp4 скорее всего является др. членом семейства, т.к. экспрессия Bmp4lacZ выявляется вдоль всей длины протоков слезных желез (data not shown). Однако, и Bmp4 и Bmp2 нулевые мыши погибают до начала функционирования слезных желез, что мешает изучению участия этих Bmps в развитии слезных желез.
Итак, Foxc1 мутантные слезные железы редуцированы как в отношении размера, так и морфогенеза ветвления. Хотя эпителий и чувствителен к пролиферативным сигналам, Foxc1 мутантные слезные мезенхимные клетки не отвечают в культуре на экзогенный Bmp. Всё это указывает на то, что Foxc1 является критическим для опосредования сигналов Bmp, необходимых для нормального морфогенеза ветвления в слезных железах.
|