Во время развития пищеварительной системы разные дополнительные органы, такие как зачатки легких, печени и дорсальной и вентральной частей поджелудочной железы, формируются в специфических позициях вдоль передне-задней оси пищеварительного тракта. Предшественники этих энтодермальных органов располагаются в тесной близи др. к др. и нуждаются в высоко регулируемой сети сигналов для спецификации каждой популяции. Хотя молекулярные детали дифференцировки печени начинают вырисовываться^1-4, процессы, ведущие к локальной индукции всё ещё плохо известны.

Чтобы идентифицировать факторы. участвующие в морфогенезе энтодермальных органов был осуществлен генетический скрининг с использованием Tg(gutGFP)^s854 линии рыбок данио рерио, экспрессирующей green fluorescent protein (GFP) в ходе развития энтодермы⁵. Была идентифицирована рецессивная мутация prt, которая обусловливала отсутствие печени спустя 50 ч после оплодотворения (Fig.1b) или сильную её редукцию (Fig.1c) по сравнению с контролем. Идентифицированы 3 фенотипически идентичных аллеля. Изучали экспрессию нескольких известных печеночных маркеров⁵. Самыми ранними генами, экспрессирующимися при формировании зачатка печени были hhex и prox1, примерно 22 ч после оплодотворения (чпо). Экспрессия эти х генов или отсутствовала или обнаруживалась на очень низких уровнях у мутантных эмбрионов prt на 24 и 28 чпо, соотв. (Fig.1d-i), указывая тем самым, что спецификация печеночной судьбы нарушена у мутантных prt эмбрионов. Даже если мутантные prt эмбрионы не обнаруживают печеночной ткани на ранних стадиях, некоторые из них начинают формирование печени на более поздних стадиях и доживают до взрослой стадии. В самом деле, в то время как зачаток печени может быть четко выявлен на 28 чпо у сибсов дикого типа, у мутантных prt эмбрионов печеночная ткань морфологически не выявляется вплоть до 50 чпо, когда небольшие выпячивания в печень-формирующую территорию становятся заметными у большинства из них (Fig.1c). Более того, маркеры дифференцировки, такие как ceruloplasmin (cp), который обычно выявляется в развивающейся печени и печеночных протоках, и selenoproteinPb (sePb) , который экспрессируется только в дифференцирующихся гепатоцитах, отсутствовали у prt мутантных эмбрионов спустя 52 чпо (Fig.1j-o). Интересно, что эти мутантны не обнаруживают др. морфологических фенотипов. Учитывая всё это формально нельзя исключить возможность, что hhex-негативные и Prox1-негативные гепатопбласты формируются в отсутствие функции Prt, указывая тем самым, что prt может специфически участвовать в раннем развитии печени, а именно, при формировании гепатобластов - общего предшественника гепатоцитов и клеток желчных протоков.

Осуществяли мозаичный анализ. После трансплантации rhodamine-меченных клеток дикого типа гомозиготным мутантным эмбриона было установлено, что клетки дикого типа вносят вклад исключительно в энтодерму печень-формирующей области, где они не способны устранить prt печеночный фенотип. Однако, присутствие клеток дикого типа только в латеральной пластинке мезодермы (lateral plate mesoderm (LPM)) или в LPM и энтодерме, приводило к формированию печени нормального размера (Fig.2d-f). Это указывает на то. что продукт гена prt действует в клетках не автономно при формировании печени и нуждается в соседней LPM, чтобы сформировать печеночный примордий. Это согласуется с доказательствами in vivo, что сигналы от мезодермы специфицируют печень, согласно эксплантационным и рекомбинационным экспериментам, показавшим роль мезодермы кардиальной и из поперечной перегородки в формировании печени^6-9. Следовательно, prt необходим в LPM, чтобы обеспечить взаимодействие между мезодермой и энтодермой при формировании печени.

Мы выявляли гены, которые нарушают свою активность у мутантов prt. Используя simple sequence length polimorphism (SSLP) маркеры мы помещали локус prt в группу сцепления 8 и благодаря тонкому картированию позиционировали prt в геноме в интервале примерно в 110 т.п.н. (Fig.3a), 54.1 centimorgans от вершины группы сцепления. Анализ по геномному секвенированию выявил две открытые рамки считывания внутри этой области, которые кодируют α-субъединицу F-actin-capping белка и ген wnt2b, который назван wnt2bb, т.к. второй wnt2b ген у данио был описан ранее¹⁰ и был обозначен как wnt2ba. Секвенирование показало, что все 3 мутантных аллеля prt содержат точковые мутации в wnt2bb (Fig.3b). Аллель prt^s403 несет Т→С замену в позиции 454, приводя к замещению законсервированного остатка серина на пролин. С→Т замена в позиции 538 у prt^s404 аллеля создает преждевременный стоп кодон, вызывая делецию 245 аминокислот с С-конца белка. Сходным образом Т→А замена в позиции 282 в аллеле prt^s416 создает преждевременный стоп кодон, укорачивая белок на 303 аминокислоты.

Затем вызывали нокдаун функции Wnt2bb с помощью morpholino антисмысловых нуклеотидов (МО). Инъекции 2 ng wnt2bb MO в Tg(gutGFP)^s854 эмбрионов приводили к полному отсутствию или сильному уменьшению печеночной ткани на 52 чпо (Fig.3c). Следовательно, wnt2bbявляется геном, затрагиваемым мутацией prt.

Т.к. было показано, что Wnt2b способен передавать сигналы через β-catenin¹¹/ то мы тестировали не вызывают ли нарушения передачи сигналов β-катенина нарушения печеночной спецификации, используя трансгенную линию рыбок данио, экспрессирующую ингибитор передачи сигналов Wnt/β-catenin, dnTcf3-GFP под контролем хитшокового промотора¹². Эти эмбрионы получают одиночное температурное воздействие на разных стадиях развития от 16 чпо (14 сомитов) до 25 чпо. Экспрессия hhex определялась на 25 чпо, а foxA1 на 48 чпо. Используя эти маркеры, мы установили, что ингибирование передачи сигналов β-катенина между 16 и 25 чпо приводит к отсутствию или сильному уменьшению печеночной ткани, тогда как трансгенные эмбрионы, подвергнутые тепловому шоку на 25 чпо, формируют печень, хотя и варьирующих размеров. Эти данные указывают на участие β-катенина в раннем развитии печени, кроме того, они указывают на то, что Wnt2bb может регулировать спецификацию печени посредством канонического Wnt сигнального пути. Кроме того, мы установили, что инъекции мРНК prt в ранние эмбрионы приводят к увеличению дорсальной судьбы, это подтверждает, что Wnt2bb действует как канонический Wnt.

У развивающихся эмбрионов данио рерио wnt2bb экспрессируется в виде динамического паттерна (Fig.4a-h), сходного с тем. что описан у мышиных и куриных ортологов^13,14. Транскрипты могут впервые выявляться в начале сомитогенеза в задней части LPM, преимущественно в клетках, предназначенных дать эндотелиальный и кровяной клоны. На 18 и 21 чпо (стадии 18-сомитов и 24-сомитов) wnt2bb экспрессируется в дискретных билатеральных доменах, близких к срединной линии в печень-формирующей области, а также в субнаборе тканей бранхиальных дуг и развивающейся васкулатуры (Fig.4a-d). Мы изучали также экспрессию wnt2bb у мутантных эмбрионов cloche (clo), которые лишены эндотелиальных клеток. Как и ожидалось не было обнаружено сосудистой экспрессии у мутантов clo, но др. домены экспрессии становились четко видимыми (Fig.4e), выявляя билатеральную экспрессию в печень формирующей области. (образующиеся эндотелиальные клетки участвуют в раннем формировании печени у мышей¹⁵, способствуя росту после печеночной спецификации. Однако, у мутантов clo раннее развитие печени происходит нормально⁵, возможно исключается роль wnt2bb сосудистой экспрессии в спецификации печени). На 24 чпо экспрессия wnt2bb исчезает из эндотелиальных клеток, тогда как экспрессия в орган-формирующей области всё ещё присутствует (Fig.4f). Чтобы определить, действительно ли wnt2bb экспрессируется в LPM по соседству с печенью или в орган-формирующей энтодерме, мы изучали экспрессиию wnt2bb у мутантных эмбрионов casanova (cas) ? у которых отсутствуют все энтодермальные клетки. На 24 чпо билатеральная экспрессия wnt2bb обнаруживалась в печень-формирующей области мутантов cas, которые были лишены энтодермальных клеток. На 24 чпо билатеральная экспрессия wnt2bb в печень-формирующей области присутствует у cas мутантов, хотя и на варьирующем расстоянии от срединной линии, это возможно обусловлено дефектами в миграции LPM к срединной линии в отсутствие энтодермы. На 52 чпо экспрессия wnt2bb всё ещё присутствует в мезенхиме, соседствующей с печенью (Fig.4h). Эти находки показывают, что билатеральная экспрессия wnt2bb в пред0печеночной области находится в LPM и что сильно ограниченный паттерн экспрессии wnt2bb в LPM не зависит от сигналов от энтодермы. Т.о., пространственно-временная экспрессия wnt2bb совпадает с потребностью в LPM в печень-формирующей области и также с временным промежутком спецификации печени.

Т.о., мы предоставили генетические доказательства позитивной роли передачи сигналов Wnt в формировании печени, отличной от её хорошо известно роли в спецификации передней энтодермы¹⁶ и в росте и регенерации печени^17-19. Наши данные показывают возможную модель, согласно которой экспрессия wnt2bb билатерально в LPM специфицирует одиночный печеночный зачаток в соседней компетентной энтодерме³. Более того, функция Prt/Wnt2bb может также регулировать пролиферацию гепатобластов непосредственно или косвенно посредством таких факторов, как Hhex²⁰ и prox1²¹. Хотя экспрессия гена, кодирующего Wnt антогонист Secreted frizzled-related protein 5 (sFRP5), в энтодерме передней кишки дает печень у мышей и Xenopus^22,23 ? что было интерпретировано как негативная регуляция печеночного развития с помощью передачи сигналов Wnt¹, мы полагаем, его присутствие необходимо, чтобы модулировать передачу сигналов Wnt, позволяя тем самым осуществлять дальнейшее развитие печени. Более того, наши находки указывают на то, что асимметричный рост печени происходит независимо от её спецификации, возможно в связи с петлеобразованием кишечной трубки и ассиметричным расположением LPM²⁴.

Эта работа согласуется с др. данными^6-9,25-27. показавшими, что взаимодействие между мезодермой и энтодермой может представлять общую тему в предопределении судьбы энтодермальных органов вдоль кишечной трубки. Высоко ограниченный домен экспрессии prt/wnt2bb вдоль передне-задней оси LPM напоминает определенные паттерны экспрессии генов Wnt вдоль aral-aboral оси морской анемоны N.vectensis²⁸ и кишечного тракта кур^29,30.