| MECs | Pgr | Pg | Prl

Массивное ремоделирование ткани молочных желез во время беременности приводит к образованию секреторных лобулоальвеолярных (lobuloalveolar) единиц при подготовке к лактации. Первоначальная пролиферативная фаза морфогенеза альвеол исследовалась с помощью повышения уровня сывороточного prolactin (Prl) и progesterone (Pg) [1]. Эти гормоны активируют альвеолярное переключение, генетическую программу, которая координирует изменения в пролиферации, миграции, дифференцировке эпителиальных клеток молочных желез и делецию многих типов тканей молочных желез. Будет рассмотрена генетическая программа, контролирующая морфогенез альвеол с использованием модельных мышей [2]. Затем будет рассмотрена роль ets транскрипционного фактора Elf5 в координациии этой программы в эпителиальных клетках.

Tissue remodelling during pregnancy

Наиболее важным аспектом развития молочных желез во время беременности является массивное ремоделирование ткани. Во время фазы альвеолярного морфогенеза [3], происходит быстрая и глобальная пролиферация эпителиальных клеток внутри веточек протоков и развивающихся альвеол. Это увеличивает и количество эпителиальных клеток и область эпителиальной поверхности, действия важные для достаточной продукции молока во время лактации. Клеточная дифференцировка начинает доминировать с середины беременности, когда железы вступают в фазу инициации секреции [3]. Развивающиеся альвеолы расщепляются и альвеолярные клетки становятся поляризованными и формируют сферо-подобный одиночный слой эпителиальных клеток, которые покрывают шарообразный просвет, соединенный с сетью протоков посредством одиночного небольшого протока. Каждая индивидуальная альвеола окружена basket-подобной архитектурой контрактильных мио-эпителиальных клеток. Мио-эпителий альвеол прерывист, так что просветные клетки непосредственно контактируют с подлежащей базальной мембраной, которая формирует часть внеклеточного матрикса. Некоторые клетки сети протоков также контактируют с базальной мембраной. Контакт необходим для завершения лобулоальвеолярной дифференцировки [4,5], проявляющейся морфологически появлением капелек жира [6] и инициацией экспрессии генов в определенном порядке [7]. В предверии родов, альвеолярные плотные соединения закрываются и белки молока и молозива поступают в просвет альвеол, готовясь к активной секреции молока после родов, которые отмечают начало фазы секреторной активации [8] (Figure 1).

Эпителиальная экспансия параллельна столь же драматическим изменениям в др. компартментах ткани. Адипоциты теряют свое липидное содержимое и сохраняются в виде длинных проекций, разбросанных по всему альвеолярному эпителию [9]. Огромная экспансия сосудов также происходит в строме, чтобы создавать огромные количества энергии, сахаров, аминокислот и растворов, необходимых для продукции молока [10]. Онтогенетические события выявляются и в др. местах животных; напр., кишечник и печень увеличиваются драматически, чтобы обеспечить нужды в энергии беременность и лактацию. Головной мозг программируется к корректному материнскому поведению с помощью Prl [11]. Т.о., альвеолярное переключение является часть большого механизма, контролирующего все аспекты адаптации к беременности и лактации.

Др. важным аспектом тканевого ремоделирования во время беременности является его циклическая природа. После прекращения кормления почти всё развитие, индуцированное альвеолярным переключением, удаляется с помощью запрограммированной клеточной гибели во время фазы инволюции, чтобы развиться снова во время следующей беременности. Это привело к гипотезе, что молочная ткань д. содержать персистирующие, само-обновляющиеся стволовые клетки молочных желез (rev. [12]). Способность небольших эпителиальных трансплантатов воспроизводить завершенные и полностью функциональные эпителиальные молочные железы и анализируется в данном обзоре [13]. Присутствие одиночных стволовых клеток молочной железы было показано с помощью экспериментов, ограничивающих dilution, и существование предетерминированных клеток предшественников было продемонстрировано с помощью трансплантатов, которые показали ограниченную онтогенетическую способность [14]. Эти клетки недавно были выделены и было продемонстрирована их способность продуцировать возобновляемый и полный эпителий молочных желез [15]. Было высказано предположение, базирующееся на парадигме, разработанной в гематопоэтической системе, что первичные эпителиальные стволовые клетки молочных желез дают иерархию клонов эпителиальных клеток предшественников, которые в конечном итоге продуцируют разные клетки, обнаруживаемые в эпителии молочных желез [16,17]. Прохождение клеток через эти клоны скорее всего контролируется с помощью и в свою очередь контролирует паттерны генной экспрессии, которые обеспечивают альвеолярное переключение. Суммирование наших знаний о паттернах генной экспрессии со знаниями о клонах стволовых клеток и об их взаимодействиях предоставляет нам беспрецендентные возможности понять эту фазу развития молочных желез.

Prolactin and progesterone initiation of alveolar morphogenesis

Формирование структур, секретирующих молоко, во время беременности зависит от синергичного взаимодействия между сигнальными путями Prl и Pg [6]. Эти гормоны запускают инициальную волну клеточной пролиферации на 2-6-й день беременности [18]. Мыши, нокаутные по progesterone receptor (Pgr), показывают, что Pg необходим для альвеолярного морфогенеза, а эксперименты по рекомбинации эпителия демонстрируют, что Pgr в эпителии молочных желез, но не в строме, существенен для пролиферации эпителиальных клеток [19]. Не все эпителиальные клетки молочных желез экспрессируют Pgr и, следовательно, неспособны отвечать на Pg непосредственно. Молочные железы химер, полученные из Pgr+/+ и Pgr-/- mammary epithelial cells (MECs), демонстрируют, что эпителиальные клетки Pgr-/- пролиферируют в ответ на Pg и, следовательно, д. отвечать на паракринный фактор из клеток Pgr+/+ [1]. В самом деле, в эпителии, пролиферирующие клетки сегрегируют с Pgr позитивными клетками [20]. Это также верно и для клеток, позитивных по эстрогенному рецептору [21]. Далее, клетки, позитивные по стероидному рецептору, оказываются в тесной близости к пролиферирующим клеткам, указывая тем самым, что пролиферация обеспечивается, по крайней мере, частично за счет паракринного механизма. Это гетерогенное формирование паттерна рецепторов, наблюдаемое в эпителии просвета, необходимо для завершения лобулоальвеолярного развития [22].

Wingless-related MMTV integration site 4 (Wnt4) и receptor activator of nuclear factor (NF)-κB ligand (RankL) являются мишенями для сигнального пути Pgr и могут быть паракринными факторами, ответственными за клеточную пролиферацию в клетках, негативных по стероидному рецептору. Избыточная экспрессия прото-онкогена Wnt1 может восстанавливать индуцированное беременностью ветвление боковых протоков у Pgr нокаутных мышей, указывая тем самым, что фактор Wnt может быть важным паракринным медиатором Pg-индуцированного ответвления боковых протоков во время ранней беременности [23]. Трансплантаты Wnt4-/- эпителия молочных желез показали. что Wnt4 действует паракринным способом, стимулируя боковые эпителиальные ответвления протоков во время ранней беременности. В этих экспериментах, нормальная лобулоальвеолярная пролиферация наблюдалась во время последней половины беременности, указывая, что др. факторы могут привлекаться для обеспечения пролиферации в поздней беременности [23].

Мишень для RankL, NF-κB, необходима для активации cyclin D1 (Ccnd1) посредством киназы IκB (IKKα) в соседних пролиферирующих клетках. Делеция в зародышевой линии и RankL и его рецептора (Rank) у мышей приводит к неспособности альвеолярного морфогенеза из-за снижения пролиферации и усиления апоптоза альвеолярных эпителиальных клеток [24]. Эти эффекты обеспечиваются protein kinase B (PKB/Akt), демонстрируя тем самым, что этот путь существенен для формирования лобулоальвеолярных структур [24]. Путь RankL/NF-κB/Ccnd1 , как сегодня известно, является критическим для формирования альвеолярных структур во время беременности [25], a NF-κB важен для Pg управляемой пролиферации внутри альвеол [20]. RankL ко-локализуется также с Pgrs в ответ уровни эстрогена и Pg у беременных, указывая тем самым, что он является важной частью ответа. В первичных культурах MEC, Pg действует синергично с эстрогеном, чтобы повысить транскрипцию Ccnd1, увеличивая в результате пролиферацию [26]. Всё это указывает на то, что Pg может управлять пролиферацией соседних клеток посредством RankL/NF-κB, вызывая транскрипцию Ccnd1 (Figure 2a,b). Pgr состоит из двух изоформ, PgrA и PgrB, которые экспрессируются с одного гена. Изоформа PgrB существенна и достаточна для альвеолярного морфогенеза во время беременности. Альвеолы у PgrB нокаутных мышей неспособны развиваться из-за нарушения пролиферации протокового и альвеолярного компартмента, что возможно обеспечивается посредством активации RankL [27].

Стимуляция с помощью гипофизарного Prl овариального Pg помогает в поддержании необходимых уровней Pg во время ранней беременности [28]. Кроме того, позитивная регуляция экспрессии Pgr с помощью Prl, и экспрессии Prl receptor (Prlr) с помощью Pg, подтверждает, что эти гормоны могут взаимодействовать синергичным способом, чтобы контролировать развитие альвеол. Нокаутные по Prolactin receptor (Prlr-/-) мыши демонстрируют важность этого рецептора во время развития молочных желез [29]. Подобно Pgr, эксперименты с Prlr-/- мышами показали, что присутствие Prlr в эпителиальных клетках, не в строме, является важным для нормальной лобулоальвеолярной дифференцировки [30]. Трансплантаты Prlr-/- молочных желез неспособны развивать лобулоальвеолы и продуцировать молочные белки во время беременности, иллюстрируя, что Prlr существенен в эпителии молочных желез во время морфогенеза альвеол. Нижестоящие мишени для сигналов prolactin детально будут обсждены ниже.

Нейрональный пептид galanin (Gal) регулирует секрецию Prl lactotrophs гипофиза [31]. Кроме того, эпителий молочных желез чувствителен к Gal, т.к. он усиливает альвеолярный морфогенез в эксплантах молочных желез в присутствии Prl [32]. Gal-/- мыши обнаруживает повышенные уровни ингибирующей фосфорилированной формы Prl [33] и не способны вскармливать детенышей из-за неспособности к секреторной активации [34]. Следовательно, Gal обладает двойным действием: во-первых, косвенным действием по модулированию гипофизарного Prl и высвобождению фосфорилированного Prl; и, во-вторых, прямым клеточно автономным действием по формированию лобулоальвеол во время беременности.

Др. гормоны могут влиять на альвеолярный морфогенез. Гормон роста может действовать в комбинации с Prl, чтобы обеспечивать альвеолярную пролиферацию. Обработка гормоном роста восстанавливает альвеолярный морфогенез, но ингибирует лактацию в Prlr+/- молочных железах [35]. Плацентарный lactogen высвобождается из плаценты во время беременности и может полностью компенсировать Prl, делая возможным альвеолярный морфогенез у Prl-/- мышей [36].

Molecular modulators of Prl induced alveolar morphogenesis

Члены Prl-сигнального пути существенны для нормального альвеолярного морфогенеза [37]. Prlr димеризация происходит после связывания Prl и ведет к фосфорилированию ассоциированной Janus kinase (Jak2) [38,39], которая в свою очередь фосфорилирует специфические остатки на Prlr [40]. Затем рекрутируется Stat5 на рецептор и фосфорилируется с помощью Jak2 [41]. Фосфорилированный Stat5 затем транслоцируется в ядро, где он может активировать транскрипцию множественных генов [42], вовлекается в разнообразные процессы во время альвеолярного морфогенеза, включая становление полярности эпителия и межклеточные взаимодействия, взаимодействия стромального эпителия и экспрессию белков молока во время лактации (Figure 2c). Обе изоформы Stat5, Stat5a и Stat5b, после нокаута у мышей вызывают лобулоальвеолярные дефекты [43-45]. Фенотип наиболее тяжелый у комбинированных нокаутных Stat5a/Stat5b животных. Один класс генов, активируемых с помощью prolactin-сигнального пути, это члены suppressor of cytokine signalling (Socs), которые действуют, чтобы закрыть Prl-сигнальный путь. Socs1 нокаутные мыши обнаруживают преждевременной развитие во время беременности, а Socs1+/- мыши могут восстанавливать лобулоальвеолярные дефекты, присутствующие у Prlr+/- мышей, из-за Prlr гапло-недостаточности [46]. Сходным образом, потеря Socs2 также может восстанавливать лактацию Prlr+/- самок [47].

Выяснение профилей транскриптов в Prlr нокаутных молочных железах идентифицировало панель генов. которые необходимы Prlr-обеспечиваемой передаче сигналов для увеличения экспрессии во время ранней беременности [46,48] (Figure 2c). Идентифицированы два члена семейства коллагенов и laminin. Эти молекулы являются компонентами клеточной адгезии внеклеточного матрикса и играют важную роль в передаче epithelial-stromal сигналов, необходимых для полной лобулоальвеолярной дифференцировки и экспрессии генов [4,7]. Морфогенез альвеол, индуцированный Prl затрагивает и установление полярности и межклеточных коммуникаций. Поддержание клеточной полярности регулируется с помощью закрытия плотных соединений, а экспрессии белков плотных соединений Claudin-3 и Claudin-7 снижена в Prlr-/- трансплантатах молочных желез [46]. Белок щелевых соединений Connexin 26 также идентифицирован, он участвует в обмене малых ионов и метаболитов [49]. Недавно было показано, что Connexin-26 важен для полного лобулоальвеолярного развития и для предупреждения апоптоза альвеолярных клеток [50].

Wnt4 также подавляется в трансплантатах Prlr-/-, указывая тем самым, что он является потенциальной мишенью в передаче сигналов Prlr [46]. Нижестоящая мишень Wnt, β-catenin, обладает специфическим действием как в просветном. так и миоэпителиальном компартментах эпителия и как компонент межклеточных соединений, , по-видимому, играет роль в передаче сигналов к клетками эпителия просвета [51,52]. В самом деле, активация β-catenin в клетках базального эпителия ведет к преждевременной дифференцировке эпителия просвета во время беременности и сохраняет пролиферацию, приводящую в результате к опухолям. Эти опухоли состоят преимущественно из недифференцированных базальных клеток, которые умножаются в ответ на активацию β-catenin, указывая тем самым, что эта молекула участвует в принятии решений о судьбе клеток в молочных железах [52].

Ген, кодирующий RankL также идентифицирован как потенциально регулируемый с помощью Prl [46,53]. Ccnd1 нулевые мутанты обнаруживают достоверную задержку пролиферации альвеолярных клеток и нарушение лактации, эффект автономен для эпителиальных клеток [54]. Интересно, что Prl может индуцировать экспрессию Ccnd1 посредством индукции insulin growth factor 2, независимо от индукции RankL [55]. Сходство между Prl- и Pg-обусловленными эффектами на передачу сигналов RankL и Wnt служит дальнейшим доказательством кооперации этих путей для пролиферации альвеолярных клеток во время ранней беременности (Figure 2a).

Профили генной экспрессии у Prl-/- идентифицировали также уникальные мишени развития молочных желез. Экспрессия tryptophan hydroxylase, скорость-ограничивающего энзима в биосинтезе серотонина, усиливается с помощью Prl во время беременности и лактации. Накопление serotonin обусловлено застоем молока после отнимания от груди или экспериментально посредством уплотнения сосков, ингибирующего экспрессию генов молока и может индуцировать инволюцию посредством механизма, который позволяет Prl прекращать лактацию после отъема от груди [56].

Transcription factors involved in alveolar morphogenesis

Prl и Pg и др. факторы индуцируют транскрипцию генов посредством активации транскрипционных факторов мишеней. Сюда входят Stat5 и рецепторы стероидного гормона, как упоминалось выше, которые соединяются с ДНК и обусловливают транскрипцию генов, участвующих во многих аспектах альвеолярного морфогенеза. Далее, некоторые из этих генов мишеней являются транскрипционными факторами, которые действуют, индуцируя экспрессию генов или групп генов, участвующих в лобулоальвеолярном развитии. Напр., транскрипционный фактор Srebf1, который был идентифицирован в экспериментах по выявлению профилей транскриптов на трех мышиных моделях, лишен секреторной активации [33]. Srebf1 контролирует экспрессию ряда ключевых генов липидного метаболизма [57], которые снижают свою экспрессию одновременно со снижением экспрессии Srebf1 [33]. Некоторые транскрипционные фактолры, которые, по-видимому, вовлечены в альвеолярный морфогенез, включают гомеобоксные гены, helix-loop-helix гены, Stats, Tcf/Lef семейство, NF-κB, Ceb/p семейство, семейство ядерных факторов и Ets транскрипционные факторы. Регуляция клеточной пролиферации во время развития молочных желез с помощью гомеобоксных генов, helix-loop-helix генов, stats и ets транскрипционных факторов была рассмотрена в обзоре ранее [58].

Pg и Prl, как предполагается, влияют на экспрессию β-catenin посредством индукции Wnt пути, как обсуждалось ранее. β-Catenin регулирует активность Tcf/Lef семейства транскрипционных факторов, которые, по-видимому, обеспечивают передачу сигналов β-catenin и, следовательно, могут играть роль во время альвеолярного морфогенеза [59]. Ингибирование β-catenin ведет к альвеолярному апоптозу и существенно снижает способность продуцировать молоко. Мыши, лишенные Lef-1, демонстрируют неспособность формировать альвеолярные почки на эмбриональный день 13. Экспрессия Lef-1 была ко-экспрессирована с β-catenin, и был выявлен сходный паттерн экспрессии в ответ на белок. родственный parathyroid гормону [60]. Т.о., Lef-1 может опосредовать действие β-catenin, хотя его эффекты во время альвеолярного морфогенеза все еще неясны.

NF1 семейство транскрипционных факторов также играет роль в функциональной дифференцировке, т.к. оно регулирует транскрипцию генов белка молока, таких как гены. кодирующие acidic protein, α-lactalbumin и β-lactoglobulin [61]. Изоформа NF1-C2 из этого семейства индуцирует экспрессию генов молока, кодирующих carboxyl ester lipase и сывороточный кислый белок. Prl регулирует экспрессию белка NF1-C2 в NmuMG клетках и его экспрессия редуцируется в ядрах просветных Prlr-/- клеток в середине беременности, указывая тем самым, что NF1-C2 может регулироваться с помощью передачи сигналов Prl во время беременности и участвует в экспрессии генов молока при подготовке к лактации [62].

Транскрипционные факторы helix-loop-helix Id1 и Id2 обнаруживают варьирующую экспрессию в молочных железах. Экспрессия Id1 увеличивается во время ранней беременности, остается низкой во время лактации и возрастает снова при инволюции. В отличие от Id1, уровень Id2 остается высоким во время лактации, указывая, что эти изоформы выполняют специфические функциональные роли во время альвеолярного морфогенеза [63]. Id1 специфически экспрессируется увеличивающимся эпителием во время альвеолярной пролиферативной фазы и обратным образом коррелирует с экспрессией β-casein; следовательно, очевидно, что он является важным фактором во время ранней альвеолярной пролиферации. Id1 регулирует также Clusterin, который участвует в регуляции межклеточных взаимодействий. Кроме того, лобулоальвеолярное развитие тяжело нарушается у Id2 knockout мышей. Снижение пролиферации и увеличение апоптоза наблюдается в молочном эпителии, лишенном Id2, что приводит к неспособности формировать альвеолярные структуры и , следовательно, к неспособности лактации [64]. Id2 способствует также дифференцировке в MEC культуре, указывая тем самым, что Id2 является существенным для дифференцировки эпителия молочных желез [63].

Транскрипционный фактор NF-κB, рассмотренный ранее, существенен для Pg индуцированной пролиферации альвеолярных клеток, он приводит к транскрипции Ccnd1 [20,25]. NF-κB может также индуцировать транскрипцию многих генов, участвующих в регуляции апоптоза. Уровни NF-κB, индуцированные во время беременности, снижаются во время лактации и снова индуцируются во время, указывая на участие в ремоделировании молочных желез. Предполагается также, что NF-κB является важным 'checkpoint' апоптоза, чьё действие зависит от ассоциации со специфическими транскрипционными регуляторами. Т.о., NF-κB является важным транскрипционным фактором, контролирующим и пролиферацию и апоптоз в эпителии во время беременности [65].

Семейство C/ebp белков, по-видимому, важные регуляторы альвеолярного морфогенеза (rev. [66]). C/ebpβ and C/ebpδ изоформы увеличиваются во время беременности и снижаются во время лактации, указывая, что играют критическую роль в альвеолярном морфогенезе и ранней экспрессии генов молока. Трансплантационные экспреименты показали, что C/ebpβ необходим эпителиальным клеткам для нормального лобулоальвеолярного развития, а C/ebpβ нокаутные мыши имеют фенотип, сходный с таковым Pgr, Prlr, Stat5a/b, Ccnd1, Id2 и RankL knockouts [66]. Интересно, что экспрессия Pgr драматически увеличивается в молочных железах C/ebpβ нулевых мышей и кроме того экспрессия Pgr необычно униформна в эпителии [67]. Эти эффекты ассоциируют с 10-кратным снижением скорости пролиферации. Однако, не обнаруживается изменений экспрессии C/ebpβ в молочных железах Pgr нокаутных мышей, указывая тем самым, что C/ebpβ стоит иерархически выше Pgr и возможно контролирует пространственное распределение эпителиальных клеток, что влияет на пролиферацию альвеолярных предшественников [67]. C/ebpβ нулевой эпителий существенно увеличивает передачу сигналов Tgf-β и Smad2, а этот путь, как известно, ингибирует клеточную пролиферацию [68]. Ход клеточного цикла у C/ebpβ нулевых MECs блокируется на ст. перехода G1/S, предупреждая эти клетки от пролиферации в ответ на уровни Pg и эстрогена во время ранней беременности [69]. Следовательно, C/ebpβ важен для контроля выбора клеточной судьбы в молочных железах, включая ослабление экспрессии Pgr, приводящее к результате к дифференцировке эпителиальных клеток молочных желез во время беременности.

Экспрессия Ets подсемейства транскрипционных факторов Pea3 увеличена в начале беременности, но снижается во время средины беременности до низких уровней во время лактации и инволюции, подтверждая их роль в индукции выростов протоков во время ранней беременности. Три члена подсемейства Pea3 экспрессируются как миоэпителием, так и просветными клетками, хотя их экспрессия варьирует во время беременности, подтверждая множественные сигнальные роли во время альвеолярного морфогенеза. Экспрессия всех членов семейства сохраняется в миоэпителии во время беременности, хотя экспрессия ER81 члена снижается в эпителии просвета спустя 7 дней после зачатия. Повышенные количества делящихся клеток наблюдаются на терминальных концах почек у Pea3 нокаутных мышей, а трансплантаты молочных желез из Pea3 нокаутного эпителия обнаруживают пониженное ветвление молочных желез во время беременности, подтверждая роль Pea3 в дифференцировке клеток предшественников [70].

Other factors involved in alveolar morphogenesis

Семейство рецепторных тирозин киназ ErbB (epidermal growth factor) и их лиганды являются важными медиаторами всех аспектов развития молочных желез. Существуют 4 рецептора: epidermal growth factor receptor/ErbB/Her1, ErbB2/Her2/neu, ErbB3/Her3 и ErbB4/Her4, которые активируются с помощью различных лигандов, индуцирующих активацию посредством димеризации и перекрестного фосфорилирования. ErbB лиганды обладают общим доменом в 50 аминокислот, который является гомологом epidermal growth factor. Мыши, экспрессирующие укороченный доминантно негативный аллель ErbB2 не обладают фенотипом вплоть до поздней беременности, когда альвеолы оказываются неспособны к экспансии и раздуванию, указывая тем самым, что ErbB2 является критическим для секреторной активации [71]. Условная делеция ErbB4 внутри молочных желез во время беременности демонстрирует критическую роль этого рецептора во время альвеолярного морфогенеза [72]. Экспансия альвеол снижена с 13.5 дня после спаривания в эпителии молочных желез, лишенного ErbB4, в результате наблюдается неполное развитие альвеол и неспособность вскармливать детенышей из-за снижения экспрессии молочных генов. Альвеолярная пролиферация ослаблена и отсутствует фосфорилирование Stat5. Лиганд для ErbB4 neuregulin/heregulin-1 (Nrg) способствует лобулоальвеолярному развитию и экспрессии генов молока, если используется в эксплантах молочных желез [73], подтверждая роль этого лиганда в лобулоальвеолярном развитии. Кроме того, мыши, лишенные alpha формы Nrg обнаруживают фенотип. сходный с таковм ErbB4 knockout, с редукцией альвеолярной пролиферации и дифференцировки, проявляющейся пониженной экспрессией β-casein [74].

Др. ErbB лиганды также, по-видимому, обладают перекрывающимися функциями в развитии молочных желез. Amphiregulin нулевые животные обнаруживают пониженное развитие альвеол, хотя фенотип значительно более тяжелый у тройных мутантов, включающих нокауты Tgfα и epidermal growth factor (все лиганды из семейства ErbB), что указывает на перекрывание и компенсаторные роли этих лигандов во время альвеолярного морфогенеза [75]. Тройные мутанты формируют плохо организованные и дифференцированные альвеолы, со сниженной экспрессией молочных белков и часто детеныши, рождаемые этими матерями погибают. Потеря Amphiregulin ассоциирует также с редукцией фосфорилирования Stat5. Установлено, что amphiregulin подавляется в Prlr-/- эпителии [46], указывая тем самым, что amphiregulin может модулироваться с помощью передачи сигналов Prlr. Всё это указывает на важную роль ErbB рецепторов и лигандов в морфогенезе альвеол. Перекрывающиеся фенотипы, наблюдаемые у Prlr, Pgr и ErbB нокаутных мышей, подтверждают возможность некоторого взаимодействия между этими рецепторами, которые еще полностью не выяснены.

Рецептор клеточной поверхности β1 integrin, который присутствует на клетках эпителия просвета, является существенным медиатором сигналов внеклеточного матрикса посредством их лигандов collagen и laminin [76]. Молочный эпителий мышей, лишенных β1 integrin в клетках просвета, обнаруживает пониженную пролиферацию и дизорганизацию альвеол [77]. Focal adhesion kinase, которая является важной в белковых комплексах, которые соединяют внеклеточный матрикс с актиновым цитоскелетом, также редуцирована у таких мышей. Условная делеция β1 integrin во время ранней беременности демонстрирует, что молекула важна для формирования лобулоальвеолярных структур и для функциональной дифференцировки [78]. В таких молочных железах, эпителий просвета становится диссоциированным от базальной мембраны и клеточная полярность нарушается, т.к. клетки просветного эпителия выпячиваются в пространство просвета альвеол. Кроме того, Prl-стимулируемая экспрессия молочных белков посредством фосфорилирования Stat5 в основном отсутствует в клетках первичного молочного эпителия, лишенных β1-integrin, указывая, что она существенна для Prl-индуцируемой активации Stat5 [79].

Цитокин Tgf-β1 является важным регулятором пролиферации клеток молочных желез во время беременности [68]. Tgf-β1 ограничивается клетками эпителия просвета и может контролировать клеточную пролиферацию посредством фосфорилирования Smad вследствие активации Tgf-β рецептора [80]. Tgf-β1 гетерозиготные мыши обладают ускоренным лобулоальвеолярным развитием, обусловленным повышенной пролиферацией, указывая тем самым, что экспрессия Tgf-β1 ограничена пролиферацией альвеолярных клеток. Пролиферация эпителиальных клеток увеличивается более чем в 15 раз у Tgf-β1 нулевых, лишенных яичников животных, обработанных эстрогеном и Pg по сравнению с мышами дикого типа [81]. У животных. обработанных эстрогеном и Pg, экспрессия Tgf-β1 ограничена эпителиальными клетками, позитивными по стероидным рецепторам, указывая тем самым, что Tgf-β1 может играть важную роль в ограничении пролиферации эпителиальных клеток в эти х клетках [82].

The ets transcription factor Elf5

Наши эксперименты по профилированию транскриптов идентифицировали ряд транскрипционных факторов, которые обнаруживают ограниченную экспрессию в ответ на потерю Prlr, но профилирование клеток, базирующееся на модели позитивного действия Prl, идентифицировало ets транскрипционный фактор Elf5 [47]. Ets транскрипционные факторы идентифицируются с помощью высоко консервативного ДНК связывающего домена (ets домен), который соединяется с сайтами, содержащими в центре мотив GGA [83]. Ets транскрипционные факторы регулируют экспрессию генов во время дифференцировки множественных тканей, включая сосудистые, лимфоидные, мышечные и костные (rev. [84]). Elf5 (e74-like factor 5 или ESE-2) является специфичным для эпителия членом подсемейства Elf транскрипционных факторов Ets и очень близок к специфичному для эпителия Elf3 (ESE-1) и Ehf (ESE-3) [85,86]. Предполагаемые белковые продукты мышиного Elf5 и человеческого ESE-2 на 95% идентичны и экспрессируются в виде двух изоформ, продуцируемыми с альтернативных стартовых точек. Такая высокая консервация последовательностей указывает на сходную консервацию функции [86].

Elf5 экспрессируется специфически в просветных клетках молочных тканей [47], его экспрессия увеличивается драматически во время беременности до уровней, которые превышают те, что наблюдаются в др. тканях. Elf5 может также соединяться с ets-подобным доменом в проксимальной части промотора сывороточного кислого белка и индуцировать его экспрессию независимо от лактогенных гормонов, указывая, что Elf5 может быть важным медиатором дифференцировки альвеол во время середины беременности [87]. Elf5-/- мыши погибают in utero из-за дефектов плацентации [88]. Elf5+/- мыши не вскармливают из-за неспособности альвеолярного развития, а у некоторых мышей, у которых альвеолы формируются, их дифференцировка в функциональные секреторные единицы тяжело нарушена [89]. Пролиферация эпителиальных клеток молочных желез редуцирована в течение всего альвеолярного морфогенеза и секреторной активации и эпителиальные трансплантаты молочных желез демонстрируют, что этот эффект является клеточно автономным. Уровни Elf5 редуцированы в железах Prlr+/- , но подобной редукции экспрессии Prlr не наблюдается у Elf5+/-, указывая. что Elf5 находится иерархически ниже Prlr [89]. MECs из Prlr-/- молочных желез не способны формировать лобулоальвеолы во время беременности, если трансплантируются в cleared жировую подушку хозяина с нормальной эндокринной средой. Ретровирусная повторная экспрессия Elf5 в Prlr-/- MECs сопровождающая трансплантацию в cleared жировую подушку приводит к нормализации альвеолярного морфогенеза [47]. MECs, экспрессирующие высокие уровни Elf5 пролиферируют и дифференцируются в расширенные, заполненные молоком альвеолы [47]. Т.о., повторная экспрессия Elf5 в Prlr-/- MECs может полностью компенсировать потерю сигнального Prlr каскада. Prlr-/- MECs, экспрессирующие низкие уровни Elf5 обнаруживают развитие, которое проходит период формирования альвеол, но не не способно к секреторной инициации, воспроизводя ситуацию, наблюдаемую у Elf5+/- и Prlr+/- мышей. Elf5 является ключевым медиатором структурного и функционального развития лобулоальвеол [47]. Elf5 , по-видимому, является мастером-регулятором переключения альвеол, необходимого для альвеолярного морфогенеза.

Conclusion

It is apparent that a large number of genes can influence alveolar morphogenesis during pregnancy, some of which are shown in Figure 2. A better understanding of the components of the alveolar switch, and thus the regulation of mammary cell proliferation and differentiation, has direct application to the regulation of lactation in agricultural species and the prevention and control of breast cancer. The key question is how the expression of these numerous proteins is organised and regulated by the alveolar switch. One potential model is a hierarchy of transcription factors that are each responsible for regulating an aspect of development. A precedent for this model is provided by the action of the transcription factor Srebf1, which regulates the expression of lipogenic enzymes during secretory initiation [33]. In this model, Elf5 would be placed close to the origin of the hierarchy, as a master regulator of the transcriptional cascade controlling alveolar morphogenesis.