Мезодерма позвоночных продуцирует широкий спектр тканей, включая мышцы, сердца, сосудистую сеть, кровь, почки, гонады. дермис и хрящи, а также играет основную роль в морфогенетических движения при гаструляции. Изучение формирования бластодермы началось с классических экспериментов Pieter Nieuwkoop's на эмбрионах амфибий почти 40 лет тому назад. Nieuwkoop показал, что эксплантированная ткань со дна эмбриона на ст. бластулы (вегетативная шапочка) может превращать проспективные клетки эктодермы, взятые с верхушки эмбриона (анимальной шапочки) в мезодермальные ткани, обычно располагающиеся на экваторе, демонстрируя тем самым, что мезодерма формируются с помощью механизма, наз. индукцией¹.

Индукция означает процесс, в котором внеклеточные сигналы заставляют менять одну клеточную судьбу на др. в определенной группе клеток. С классической точки зрения, индукция происходит, когда одна группа клеток передает сигнал др. группе клеток, которая отвечает изменением своей судьбы. На практике это может оказаться сложнее. У рыбок данио рерио, напр., проспективные мезодермальные клетки вовлекаются в испускании и восприятии индуцирующих сигналов.

До плодотворных экспериментов Nieuwkoop's первое индуктивное событие у эмбрионов амфибий считалось связанным с использованием сигналов на ст. гаструлы, которые возникают в организаторе и формируют паттерн мезодермы и эктодермы (rev. REF. 2). Хотя последующие эксперименты привели к подразделению индукции мезодермы на события инициации, поддержания и формирования паттерна, здесь я использую термин индукция мезодермы в широком смысле, чтобы охватить все эти три ступени, происходящие конкурентно у эмбрионов поздней бластулы/ранней гаструлы. Оригинальный подход Nieuwkoop's предоставил ценный инструмент для изучения передачи эмбриональных сигналов, который всё ещё используется. Т.к. анимальные шапочки могут быть легко изолированы и расти в простых буферных растворах и т.к. превращение эксплантов анимальных шапочек в мезодерму может быть легко отслежено на макроскопическом уровне, то этот подход предоставляет ценное средство для идентификации первых факторов, индуцирующих мезодерму (rev. REF. 3). С разработкой более сложных методов для измерения генной экспрессии и и манипуляции с рядом эндогенных передач сигналов у Xenopus, использование подхода эксплантов анимальной шапочки для понимания базовой биологии индуктивных процессов постоянно расширяется.

Хоья область индукции мезодермы была начата исследованиями амфибий, сегодня невозможно обсуждать это важный вопрос без использования данных на рыбках данио рерио, которые внесли важные новые открытия в эту область. Сравнение двух видов, которым уделяется основное внимание в этом обзоре, предоставляет интересную информацию на законсервированные аспекты индукции мезодермы, а также изменения в механизмах индукции, приспособленных к разным эмбриологическим признакам. Исследования на Xenopus и данио рерио предоставили также ценную основу для понимания индукции мезодермы у др. видов, таких как птицы и млекопитающие.

Forming the mesoderm

У эмбрионов данио рерио и Xenopus индукция мезодермы создает зону мезодермальных клеток на экваторе эмбриона (часто называемой маргинальной зоной). В то время как мезодерма и энтодерма регионально самостоятельны у Xenopus, у рыбок данио предшественники энтодермы и мезодермы перемешаны (FIG. 1). Кроме того, в то время как все клетки ранней гаструлы Xenopus вносят вклад в финальный эмбрион, у рыб данио эмбрион располагается на верхушке из желточной клетки, которая не подвергается дроблению. Это различие в архитектуре между двумя видами имеет важное следствие для механизма индукции мезодермы.

Помимо установления мезодермальной зоны осуществляется паттерн индуктивных процессов в эмбрионе вдоль того, что обычно называют 'the dorsal-ventral axis', а также анимально-вегетативной осью (FIG. 1). Так 'dorsal' сторона продуцирует как переднюю (голова), так и дорсальную (хорда) судьбу, в то время как 'ventral' сторона продуцирует как заднюю (хвост), так и вентральную (напр. pronephros) судьбу, поэтому экваториальная ось эмбриона на ст. пре-гаструлы лучше всего обозначить как 'dorsoanterior-ventroposterior axis' (для обсуждения сложности мечения прегаструлярной оси см REF. 4). Независимо от номенклатуры, происходят сложные морфогенетические движения во время гаструляции, приводящие мезодермальные клетки в их корректную позицию внутри post-gastrula эмбриона.

Хотя карты судеб часто рисуются для мезодермы поздней бластулы/ранней гаструлы, демаркированной на регионы определенной судьбы, тщательное клональное мечение эмбрионов рыбок данио на этой стадии демонстрирует, что мезодермальные производные вне области организатора сильно перемешаны^5,6. Сходным образом недавнее исследование у Xenopus показало, что многие клетки эмбриона ранней гаструлы экспрессируют маркер для др. домена, чем предсказан картой судеб⁷. Этот результат, по-видимому, отражает тот факт, что эмбриональные клетки подвергаются действию множественных сигналов (включая передачу сигналов факторов и их ингибиторов), т.к. они мигрируют в эмбрион; следовательно, их конечная судьба может представлять собой сумму этих внешних влияний скорее, чем их позицию в определенной временной точке.

Signalling factors in mesoderm induction

Возможно, что все семейства сигнальных факторов, которые важны для индукции мезодермы, идентифицированы, хотя не все из критических индивидуальных факторов еще могут быть определены. Неожиданным свойством является сложность сигнальных факторов, которые используются эмбрионов для индукции мезодермы (TABLE 1). С точки зрения эмбриона могут существовать эволюционные преимущества обладания множественными факторами с перекрывающимися функциями. С точки зрения экспериментатора, однако, эта степень перекрывания может делать исследования потери функции сильно затрудненными.

В качестве первого приближения можно сказать: семейство Nodal участвует в инициации формирования мезодермы, FGFs (Fibroblast growth factors) и Wnts участвуют в поддержании состояния мезодермы, а BMPs (Bone morphogenetic proteins) участвуют в формировании паттерна мезодермы. Это, однако, сильное упрощение, что эти факторы действительно действуют так. Напр., в различных экспериментальных моделях FGFs, BMPs и Wnts, как было установлено, достаточны для инициации образования мезодермы^8-13, a члены семейства Nodal, как было показано, участвуют в формировании паттерна мезодермы^14,15. Эти результаты указывают на то, что внеклеточные сигналы не обязательно жестко разделены функционально относительно индукции мезодермы и вместо этого показано, что эти сигналы могут работать частично перекрывающимся образом, чтобы формировать и создавать паттерн мезодермы. Т.к. семейство Nodal функционирует в качестве основного инициирующего стимула индукции мезодермы¹⁶, поэтому оно будет главным фокусом обсуждения ниже (для более тщательно обсуждения ролей Wnts, BMPs и FGFs см REFS 17-19). Описание внутриклеточных сигнальных путей, которые используются каждым из этих факторов, можно найти в BOX 1.

Models for mesoderm induction in fish and frogs

Недавние исследования показали, как индуцирующий мезодерму сигнал, описанный Nieuwkoop¹, локализуется в вентральном полушарии эмбрионов Xenopus. Во время оогенеза транскрипты, которые кодируют T-box транскрипционный фактор VegT, локализуются на вегетативном полюсе посредством сложного процесса, который использует специфические РНК-связывающие факторы и цитоскелетные элементы (rev. 20). При оплодотворении транскрипты VegT высвобождаются из вегетативного полюса и медленно диффундируют вверх. Т.к. плоскость третьего деления дробления проходит через экватор эмбриона до того как транскрипты покинут вегететивное полушарие, поэтому транскрипты VegT залавливаются здесь и поэтому последующая трансляция белка VegT ограничивается вегетативной половиной. Во время старта зиготической транскрипции на стадии 4,000 клеток, которая наз. mid-blastula transition, VegT активирует транскрипцию Xenopus nodal related (Xnr) генов, которые затем инициируют образование мезодермы^21-25 (FIG. 2).

У рыбок данио рерио Nodal гены squint (sqt; известный также как ndr1) и cyclops (cyc; известный также как ndr2) (BOX 1) инициируют образование мезодермы, но их транскрипция активируется неизвестными сигналами, происходящими во внеэмбриональном желточном синцитиальном слое (yolk syncytial layer (YSL; rev. 26) (FIG. 2). Идентифицирован ортолог VegT у рыбок данио и хотя он играет важную роль в формировании мускулатуры туловища, он не является материнским и он не активирует экспрессию гена nodal²⁷. Всё ещё неясно, как YSL-специфический сигнал действительно продуцируется, хотя кажется мало вероятным использование того же самого механизма, который использован Xenopus VegT. YSL даже не формируется в качестве самостоятельной единицы вплоть до приблизительно стадии в 1,000 клеток, а YSL ядра и цитоплазма имеют тоже самое происхождение, что и лежащие поверх эмбриональные клетки (наз. бластомерами), которые формируют мезодерму. Следовательно, если транскрипты ограничены вегетативным полюсом во время оогенеза и высвобождаются при оплодотворении, то они возможно д. наследоваться как YSL, так и бластомерами. Возможно, что существует механизм, который закрепляет транскрипты (или белки) в желтке и удерживает их неактивными до тое пор, пока не сформируется YSL; согласно этой точки зрения фактор д. высвобождаться в YSL и активироваться, чтобы инициировать образование мезодермы.

Nodal signalling: are gradients important?

Как описывается ниже эмбрион потенциально имеет градиенты активности Nodal вдоль dorsal-ventral и animal-vegetal осей. Существование, значение и роль этих градиентов Nodal в индукции мезодермы главный предмет споров. У Xenopus, несколько линий доказательств показывает, что передача сигналов Nodal более сильная на дорсальной, чем вентральной стороне pre-gastrula эмбриона. У эмбрионов Xenopus 'dorsalizing' активность перемещается от вегетативного полюса в направлении одной из сторон эмбриона вскоре после оплодотворения (rev. 28), a доказательства из экспериментов, в которых раннюю вегетативную цитоплазму удаляли из эмбриона, показали, что имеется сходный механизм и у рыб данио^29,30. Суммарный результат этих движений заключается в стабилизации β-catenin, компонента внутриклеточного Wnt пути (BOX 1), на будущей дорсальной стороне эмбриона (FIG. 3). Эта асимметричная стабилизация β-catenin существенна для формирования всех дорсальных и передних структур (REFS 31,32; rev 28,33).

Среди множества мишеней для β-catenin находятся члены семейства генов Nodal, называемых Xenopus nodal-related факторы; по этой причине, гены Xnr экспрессируются раньше и/или на более высоком уровне на дорсальной стороне эмбриона (FIG. 3). Напр., Xnr5 и Xnr6 транскрибируются на дорсальной стороне эмбриона в ответ на β-catenin уже на ст. 256 клеток, т.е. до того как большинство эмбриональных генов начнет транскрибироваться на ст. перехода к средней бластуле³⁴. Эти два гена Xnr , а также Xnr1, Xnr2 и Xnr4, которые впервые транскрибируются на ст. перехода к средней бластуле, экспрессируются в виде дорсо-вентрального градиента на ст. поздней бластулы^35,36. Следовательно, передача сигналов Nodal по крайней мере временно усилена дорсально, на что указывает повышенное фосфорилирование (а также активация) Nodal внутриклеточного фактора Smad2 (BOX 1) на дорсальной стороне эмбрионов ст. поздней бластулы^37,38. Однако, на ранних стадиях гаструлы уровни фосфорилированных Smad2 одинаковы вдоль дорсо-вентральной оси^37,38. Следовательно, имеется период времени, в течение которого передача сигналов Nodal асимметрична вдоль дорсо-вентральной оси и это важно для установления асимметричной экспрессии генов вдоль этой оси.

У рыбок данио рерио Nodal ген sqt, как было предположено, непосредственно активируется с помощью β-catenin, приводя к дорсальной экспрессии sqt в течение короткого времени перед своей экспрессией по всей мезодерме39. Служит или нет это причиной временной дорсо-вентральной асимметрии в уровнях фосфорилирования Smad2, пока не установлено.

Др. потенциальным механизмом для регуляции асимметричной экспрессии nodal у рыб данио был описан недавно. Материнские sqt транскрипты, по-видимому, транспортируются на дорсальную сторону эмбрионов раб данио уже на 4-клеточной стадии, что позволяет белку Sqt накапливаться дорсально до начала зиготической транскрипции⁴⁰. Morpholino-обеспечиваемые нокдаун эксперименты показали, что потеря материнского и зиготического Sqt вызывает более тяжелый фенотип, чем потеря только зиготического Sqt. Однако, эмбрионы. которые генетически лишены материнского и зиготического Sqt имели более тяжелые дефекты, чем эмбрионы лишенные только зиготического Sqt⁴¹, a эмбрионы, лишенные только материнского Sqt не обнаруживали дефектов раннего формирования паттерна (S. Dougan, personal communication). Следовательно, значение локализованного материнского sqt может зависеть от генетического фона эмбриона и/или эпигенетических эффектов.

Некоторые эксперименты на Xenopus, с использованием Activin в качестве стимулятора пути Nodal, показали, что вариации в уровне активности Nodal могут регулировать формирование дорсо-вентрального паттерна с низкими уровнями, индуцирующими вентральные судьбы, и с высокими уровнями, индуцирующими дорсальные судьбы^42-44. Эти результаты согласуются с идеей, что активность Nodal выше в дорсальной, чем вентральной части, по крайней мере, у предгаструлярных эмбрионов.

Несмотря на это трудно с определенностью оценить, действительно ли путь Nodal регулирует формирование дорсо-вентрального паттерна. Исследования лягушек с использованием разных доз синтетического Nodal-специфического ингибитора (укороченный белок Cerberus) думается указывают на то, что вентральная часть мезодермы наиболее легко элиминируется с помощью небольшого снижения передачи сигналов Nodal, в то время как дорсальная мезодерма элиминируется только высокими дозами антагониста Nodal³⁵. Это единственные данные, которые подтверждают важность дорсо-вентрального градиента Nodal у Xenopus. Сходным образом, пока нет доказательств, что снижение передачи сигналов Nodal на дорсальной стороне приводит к респецификации дорсальной судьбы в вентральную. Неожиданно редукция передачи сигналов Nodal с использованием различных sqt и cyc мутантов у рыб данио вызывает противопложный результат; дорсальный регион оказался более чувствительным к потере передачи сигналов Nodal⁴⁵. В этом случае редукция передачи сигналов Nodal приводит к снижению формирования дорсальной мезодермы, но не к респецификации в вентральную судьбу. Следовательно, нет удовлетворительных доказательств этой точки зрения, что временной/пространственный градиент передачи сигналов Nodal регулирует различия в дорсо-вентральных судьбах мезодермы у рыб или лягушек.

Исследования рыбок данио показали, что градиенты Nodal участвуют в формировании паттерна мезодермы вдоль анимально-вегетативной оси. Различия в уровнях Nodal, как полагают, отделяют головную мезодерму от хорды внутри организатора^14,45, и разделяют предшественники вентрикулярного и атриального миокарда⁴⁶. Эта концепция в целом согласуется с исследованиями на Xenopus, показавшими, что частичное ингибирование Nodal или Activin вызывает дефекты головы, не затрагивая хорду^47-50, а также с существованием вегетативно-анимального градиента фосфорилированных Smad2, указывая тем самым, что градиент Nodal может также формировать паттерн вдоль анимально-вегетативной оси у лягушек^37,38. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы установить до какой степени различия в уровнях передач сигналов Nodal специфицируют судьбы разных мезодермальных тканей in vivo.

The enigmatic Vg1

У Xenopus член семейства Transforming growth factor-β (TGFβ) Vg1 бцл первоначально идентифицирован как прекрасный кандидат на роль кандидата происходящего из вегетативного полушария сигнала Nieuwkoop signal (REF. 51; rev. 52). Vg1 транскрипты локализуются на вегетативном полюсе одинаково с VegT. Более того, зрелая область Vg1 pro-белка, прикрепленная к разным pro-доменам, может функционировать как мощный агент, индуцирующий мезодерму. Однако, первоначально идентифицированный Vg1 про-протеин не обладал активностью, а эндогенно зрелый Vg1 не обнаружим у эмбрионов Xenopus. Хотя имеются доказательства, что Vg1 играет важную роль в индукции мезодермы у эмбрионов кур^53,54, a Vg1-родственный белок Growth/differentiation factor 3 (Gdf3) существенен для формирования мезодермы у мышей⁵⁵, вплоть до недавнего времени считалось, что Vg1 является критическим только для установления лево-правосторонней асимметрии у Xenopus^56-58. Однако, Birsoy et al. показали. что эмбрионы с деплецией Vg1 лишены структур головы и хорды, что скорее всего обусловлено снижением экспрессии генов Шпемановского организатора, в частности ингибиторов BMP и Wnt¹⁵. Более того, эти авт. инактивировали про-протеин Vg1, продемонстрировав существование второго аллеля Vg1, который активен как индуцирующий агент¹⁵. Хотя эта работа повторно установила Vg1 в качестве важного члена семейства Nodal мезодермальных индукторов, встает вопрос, почему столь много членов в этого семейства используются у Xenopus (TABLE 1). У рыбок данио vg1 транскрипт является материнским, но не локализован⁵⁹, и поэтому нет доказательств, что он участвует в индукции мезодермы или в формировании лево-правостороннего паттерна. Следовательно, у них Vg1 является существенным для передачи сигналов Nodal как у лягушек, кур и мышей, он или функционирует как повсеместный фактор или процессинг про-протеина для созревания лиганда регулируется пространственно.

Beyond Nodals: maintenance and patterning

Доказательства, полученные на рыбах и лягушках демонстрируют, что голова (передняя часть) регулируется по иному в отличие от туловища и хвоста (задняя часть). Напр., ингибирование передачи сигналов FGF в обеих системах элиминирует туловище и хвост, не вызывая тяжелых дефектов головы, указывая тем самым, что эти две области используют разные регуляторные circuits^60,61 (FIG. 4). Индукция мезодермы в голове активирует различные транскрипционные факторы и секретирует ингибиторы путей BMP, Wnt и Nodal, которые существенны для формирования паттерна эмбрионов³³. Тем временем индукция мезодермы в туловище активирует сигнальные факторы семейств FGF и Wnt (BOX 1; TABLE 1), вместе с некоторыми транскрипционными факторами. Среди транскрипционных факторов присутствуют, по крайней мере, три члена T-box семейства, Xbra (у лягушек) или No tail (Ntl; у рыб), VegT (у лягушек) или Spadetail (Spt; у рыб) и Tbx6 (у рыб и лягушек), которые функционируют комбинаторно, чтобы регулировать формирование мезодермы⁶². В то время как рыбки данио, которые лишены функции spt (известного также как tbx16) или ntl, имеют крупные дефекты в туловище или хвосте, соотв., рыбы, лишенные обоих T-box генов, неспособны формировать мезодерму туловища и хвоста, демонстрируя, что эти факторы функционируют рано и взаимоперекрываясь на инициальных стадиях индукции мезодермы⁶³. Среди мишеней T-box генов имеются FGFs, которые участвуют в ауторегуляторной петле для поддержания экспрессии T-box генов^64-66 (FIG. 4). Зиготическая передача сигналов Wnt не только ограничивает размеры Шпемановского организатора67, но она также необходима для поддержания экспрессии T-box генов^68-70 (FIG. 4). Почему и FGFs и Wnts необходимы для поддержания мезодермы, пока неясно.

Помимо Nodals, Wnts и FGFs, некоторые члены семейства BMP и их ингибиторов участвуют в формировании паттерна мезодермы (REFS 71,72; rev. 73)(BOX 1; TABLE 1). Неожиданно оказалось, что как дорсальная, так и вентральная сторона эмбриона одновременно экспрессирует BMPs и BMP ингибиторы, указывая тем самым, что регуляция формирования паттерна мезодермы с помощью BMPs сложна. Эмбрионы рыбок данио рерио, которые мутантны по bmp2b или эмбрионы лягушек с деплецией Bmp4 и Bmp7 не способны формировать хвост^26,74-76,это согласуется с предположением, что BMPs являются важными регуляторами развития хвоста^77,78 (FIG. 4).

Многие линии доказательств указывают на то, что эмбриональная мезодерма лягушек и рыб подразделена на три принципиальных домена: голову, туловище и хвост. Как обсуждалось выше, туловище и хвост нуждаются в передаче сигналов FGF и функциональных T-box генах, тогда как голова - нет. Туловище и хвост также находятся под отдельным контролем, хотя регуляция формирования хвоста, по-видимому, отличается у рыб и лягушек. У Xenopus, инициация выроста хвоста использует пути передачи сигналов BMP и Notch, вместе с характерными изменениями в экспрессии генов по мере формирования хвоста^79-82. Хотя передача сигналов BMP также необходима для формирования хвоста у рыб^75,76,78, нет доказательств участия в этом процессе передачи сигналов Notch и не описаны какие-либо изменения в экспрессии генов, когда начинает развиваться хвост. Однако, образование хвоста у данио рерио безусловно использует путь, который отличается от такового при формировании головы или туловища, так как эмбрионы рыбок данио с дефицитом передачи сигналов Nodal формируют в основном нормальные хвосты, даже если отсутствует мезодерма туловища и головы⁸³.

Деплеция дорсально экспрессирующегося BMP лиганда Admp (Anti-dorsalizing morphogenetic protein) у Xenopus и рыбок данио дакже дает эмбрионов с дефектами в развитии задних частей^84-86. Более того, новый важный анализ эмбрионов Xenopus, которые лишены дорсального (Admp) и вентральных (Bmp2, Bmp4 and Bmp7) BMPs, показал, что взаимодействия между BMPs и их ингибиторами на дорсальной и вентральной сторонах эмбриона существенны для установлениея нормального дорсо-вентрального паттерна^86,87. Пока неясно, как специфицируются задняя дорсальная (хвостовая мезодерма), задняя вентральная (задние кровяные островки) и вентральная (пронефросы) судьбы (FIG. 1). Хотя передача сигналов BMP необходима для формирования судеб вентральной мезодермы, нет убедительных доказательств, что градиент передачи сигналов BMP различен между разными тканями, которые формируются на вентральной стороне. Необходимы дальнейшие исследования.

Temporal aspects of mesoderm induction

Индукция мезодермы происходит в течение нескольких часов во время которых эмбриональные клетки подвергаются воздействию сдвигающихся концентраций индуцирующих сигналов и их ингибиторов. Даже если клетки начинают принимать решение в отношении выбора судьбу головы, это решение может измениться, если будут получены новые внешние влияния. Но как только клетка становится необратимо детерминированной к специфической судьбе, она становится детерминированной.

Важной областью исследования, связанной с пониманием, когда клетки способны отвечать на различные индуцирующие мезодерму сигналы и когда они становятся детерминированными к определенной судьбе. Детальный анализ детерминации клеток у Xenopus показал, что клетки эмбрионов ранней гаструлы лабильны, экспрессируют гены, которые маркируют множественные зародышевые слои и регионы⁸⁸. В конце гаструляции, однако, клетки, по-видимому, более детерминированы к специфической судьбу, на что указывает экспрессия генов. Как и когда клетки становятся детерминированными всё ещё в основном неизвестно. Один механизм, который лимитирует способность сигналов типа Nodal, затрагивающих мезодерму после стадии средней гаструлы у Xenopus затрагивает фосфорилирование остатков в средине белка Smad2, это удерживает Smad2 вне ядра и следовательно, предупреждает его от активации экспрессии генов⁸⁹.

Многие исследования на Xenopus и данио рерио изучали, как сигнальные пути влияют на экспрессию эмбриональных генов, используя избыточную экспрессию специфических сигнальных молекул, избыточную экспрессию доминантно-негативных рецепторов, morpholino олигонуклеотидов и эмбрионов рыб, которые мутантны по одному из компонентов определенного сигнального пути. Хотя эти результаты были информативны, они не предоставили информацию о важной временной потребности в сигнальных путях, т.к все эти подходы меняли пути передачи сигналов в течение всего процесса индукции мезодермы. К счастью, разработаны новые подходы, которые позволяют определять время действия, необходимое разным сигнальным факторам. Относительно специфичные химические соединения, которые ингибируют пути FGF (SU5402 (REF. 90)) и Nodal (SB505124 (REF. 91)) коммерчески доступны. Напр., ингибитор FGF используется для исследования широкого разнообразия процессов, включая регуляцию T-box генов с помощью FGF в мезодерме рыбок данио, нейральную индукцию у Xenopus, развитие переднего головного мозга у Xenopus и развитие зубов у рыбк данио^64,92-94. Также разработаны альтернативные подходы трансгенных zebrafish, которые экспрессируют ингибиторы канонических путей Wnt и BMP под хит-шоковым контролем^95,96. Напр., это было использовано, чтобы показать, что основная роль передачи сигналов BMP в формировании паттерна мезодермы происходит во время поздней бластулы и ранней гаструлы, но что передача сигналов BMP продолжает оперировать во время стадий средней и поздней гаструлы, чтобы специфицировать формирование вентрального хвостового плавника⁹⁵. Сходные исследования с секретируемыми натуральными ингибиторами передач сигналов FGF у лягушек показали, что пути передачи сигналов FGF функционируют во время стадии гаструлы прежде всего, чтобы регулировать экспрессию мезодермальных генов, в то время как передача сигналов FGF в основном регулирует морфогенез после стадии гаструлы⁹⁷. Такого типа временной анализ представляет основу для изучения изменений в экспрессии мезодермальных генов, чтобы понять, как и почему мезодерма меняет свою способность отвечать на индуцирующие сигналы.

Combinatorial signalling

Мезодермальные клетки отвечают на какофонию сигналов, но каким-то образом они должны интегрировать эту информацию, чтобы принять решение о принятии специфической судьбы. Как разные сигнальные пути комбинируют. чтобы регулировать экспрессию генов в мезодерме всё ещё плохо изучено. Разные сигнальные пути могут до некоторой степени регулировать любую из др. внутриклеточных сетей, но, скорее всего, большинство взаимодействий происходит за счет изменений в экспрессии генов. Хотя и имеются некоторые доказательства для генов, которые непосредственно регулируются множественными сигнальными путями (напр., передача сигналов Wnt and Nodal регулируют промотор Xenopus twin⁹⁸, а передача сигналов BMP и Wnt регулирует zebrafish промотор tbx6¹¹), но по большей части неизвестно, сколько мезодермальных генов регулируется за счет одного пути и сколько регулируется более, чем одним путем. Промоторный анализ возможен у рыбок данио и Xenopus с использованием плазмидной ДНК, хотя это лучше всего достигается при использовании технологии, которая позволяет продуцировать трансгенных эмбрионов Xenopus в F₀ поколении⁹⁹; хотя эти методы всё ещё затруднительны. Более того, за исключением сайтов связывания для фактора Tcf (транскрипционный активатор в пути Wnt; BOX 1), всё ещё невозможно легко распознавать элементы, которые отвечают на FGF, Nodal или BMP пути, т.к. каждый из этих путей регулирует особые ДНК-связывающие белки и обычно неясно, какой связывающий белок взаимодействует со специфическим промотором. По этим причинам немногие мезодермальные промоторы изучены детально, что делает молекулярную сеть индукции мезодермы неполной.

В недавней работе пролит свет на новый интересный пример комбинаторной передачи сигналов в мезодерме, который не был с очевидностью установлен при изучении промоторов. Как отмечалось выше, T-box транскрипционный фактор Xbra является критическим регулятором формирования задней части мезодермы. Специфичность Xbra-обусловленной регуляции экспрессии генов изменяется путем связывания его с Smad1, внутриклеточным медиатором BMP пути¹⁰⁰ (BOX 1). Т.к. передача сигналов BMP высокая на вентральной и низкая на дорсальной стороне, то мишени для Xbra-обусловленной активации скорее всего разные на дорсальной и вентральной сторонах эмбриона. Было бы интересно посмотреть, как в целом такого типа механизм используется для регуляции активности транскрипционных факторов в разных регионах эмбриона.

Mesoderm induction in chicks and mice

Базовый процесс индукции мезодермы в целом законсервирован среди всех позвоночных, хотя базовая эмбриональная архитектура различна между видами (см. REF. 3). Непосредственное сравнение кур и мышей с рыбами и лягушками выявляет интересные сходства и различия. Напр., у кур комбинация передачи сигналов TGFβ, фактора Vg1 и канонического Wnt (Wnt8c), как полагают, инициируется формирование инициальной осевой структуры, первичной полоски, хотя следует предостеречь, что пока нет данных по потере функции, чтобы выяснить точную роль передачи сигналов Vg1у эмбрионов кур⁵⁴ (FIG. 5a). Интригует, что одна из самых ранних мишеней Vg1 и Wnt8c является куриный ген Nodal¹⁰¹, который обнаруживает параллелизм, с наблюдениями у рыб и лягушек, что экспрессия Nodal является ключевой ступенью в процессе индукции мезодермы. Однако, важное отличие заключается в том, что куриные внеэмбриональные структуры, называемые гипобластом, которые первоначально расположены под будущей первичной полоской, секретируют ингибитор Nodal, Cerberus, который блокирует функцию Nodal¹⁰². И только когда гипобласт физически смещается из задней части эмбриона, где формируется первичная полоска, Nodal способен участвовать в формировании первичной полоски вместе с Fgf8 и Chordin¹⁰³ (FIG. 5a). Этот механизм смещения гипобласта, как полагают, является важным для гарантии, что первичная полоска будет сформирована только в задней части эмбриона^102,103. Возможно также, что градированиые перемещения ингибиторов Nodal от первичной полоски формируют градиент активности Nodal внутри самой полоски¹⁰².

У мышей понимание индукции мезодермы осложнено тем фактом, что первичная полоска формируется на одной стороне эмбриона (проксимальной к месту имплантации и в области будущего заднего конца эмбриона), в то время как отдельный важный сигнальный центр, anterior visceral endoderm (AVE), первоначально формируется дорсальнее места имплантации и затем смещается к противоположной стороне от первичной полоски (будущий передний конец эмбриона; FIG. 5b). Сложная серия сигнальных взаимодействий, которая затрагивает передачу сигналов Nodal, BMP и Wnt, закладывает эти два центра (rev. 104).

Gdf3, Vg1-подобный ген, экспрессируется оченть рано у эмбрионов мышей, параллельно с очень ранней экспрессией Vg1 лягушек, рыб и кур.Как и в случае vg1 рыбок данио, но в отличие от Vg1 у лягушек и рыб, экспрессия Gdf3 униформна в клетках, которые д. дать эмбрион⁵⁵. Неожиданно, Gdf3-нулевые мутантные мыши часто жизнеспособны, приблизительно треть их обнаруживает ряд морфологических дефектов, которые может быть объяснены альтерациями передачи сигналов Nodal⁵⁵. В целом эти результаты согласуются с экспериментами потери функции у лягушек и показывают, что Xenopus Vg1 работает совместно с Nodal факторами¹⁵, и он отличается от исследований на курах, показавших, что Vg1 является ключевым инициатором экспрессии Nodal и образования первичной полоски^53,54,103. Эти различия могут отражать пути, в которых используются эти разные TGFβ факторы, и которые вовлечены в становление мезодермы у эмбрионов, имеющих разную топологию.

Недавние исследования подтвердили мнение, что первичная полоска мышей первоначально устанавливается в виде радиального паттерна и затем оказывается в определенном локальном сайте в проксимальной задней части эпибласта, предположительно посредством ингибирующих активностей AVE¹⁰⁵. Вместо этого авт. установили, что Wnt3, который существенен для формирования первичной полоски и мезодермы и для экспрессии Nodal¹⁰⁶, первоначально экспрессируется в тканях, соседствующих с проксимальной задней областью эпибласта до того как AVE перемещается в будущую переднюю область, а не в виде радиального паттерна по всей проксимальной области, как считалось до этого. Wnt3 затем регулирует нижестоящие гены, такие как Nodal и T-box ген Brachyury (и потенциально самого себя Wnt3) в соседней проксимальной задней части эпибласта (FIG. 5b). Как экспрессия Wnt3 первоначально ограничивается проксимальной задней частью остается неизвестным.

Интересный параллелизм с функцией гипобласта кур, AVE секретирует ингибиторы передачи сигналов Nodal, Cerberus-like и Lefty1, которые важны для ограничения первичной полоски задним концом эмбриона путем ограничения области, в которой может функционировать передача сигналов Nodal^107,108 (FIG. 5b). Более того, эти ингибиторы Nodal существенны для формирования нормального паттерна полоски, т.к. мутанты, которые лишены обоих ингибиторов Nodal, обнаруживают экспансию передней мезодермы и соотв. потерю задней мезодермальной ткани¹⁰⁸. AVE экспрессирует также ингибиторы передачи сигналов Wnt¹⁰⁹, которые также лимитируют домен передачи сигналов Wnt3. Следовательно, важная роль AVE заключается в секреции ингибиторов, которые ограничивают первичную полоску на одной стороне эмбриона. Из-за различий в экспериментальных подходах, часто используемых у разных видов, прямое сравнение индукции мезодермы между позвоночными осложнено. Несмотря на это возможно, сделать некоторые базовые обобщения.

Во-первых, одни и те же семейства сигнальных факторов используются всеми позвоночными, такие как T-box гены, хотя имеются некоторые существенные различия, того, как эти молекулярные игроки используются (TABLE 1). Во-вторых, локализованные материнские детерминанты не играют роли или их роль редуцирована в спецификации оси и индукции мезодермы у амниот, a полярность эмбрионов амниот не фиксирована вплоть до того, когда начинается гаструляция. В-третьих, внеэмбриональные структуры играют важную роль в ранних внутриклеточных сигнальных процессах у амниот, в то время как внеэмбриональные структуры, YSL, инициируют только Nodal путь, а лягушки не имеют внеэмбриональных структур. Наконец, эффект ингибирования сигнальных путей у эмбрионов мышей продуцирует значительно более тяжелые эффекты, чем у рыб и лягушек, Напр., ингибирование передачи сигналов BMP^110,111 или элиминация Wnt3 (REF. 106) у эмбрионов мышей приводит к неспособности образования мезодермы, тогда как ингибирование этих путей у рыб и лягушек вызывают лишь укорочения тела. Schier and Talbot предполагают, что различия в роли сигнальных факторов у этих разных видов обусловлены значительно большей ролью перекрестной регуляции между сигнальными путями у эмбрионов мышей, чем у рыб и лягушек, так что если один путь ингибирован, то др. затрагиваются также ²⁶.

Future directions

Many studies on mesoderm induction have involved identifying a new gene either through an unbiased screen or homology searches that are based on what is known from other species, and analysing its regulation by the signalling pathways that are discussed in this review. An alternative approach involves altering one of the signalling pathways by molecular or genetic methods and then analysing the expression and function of a handful of marker genes, typically by RT-PCR. Although the zebrafish and Xenopus genomes are still not completely sequenced, it has recently become possible to use genomic methods, such as microarray screens and genome-based expression screens, to analyse mesoderm induction. For example, Xenopus embryos that lack the T-box transcription factor VegT were examined using microarrays, identifying 99 known and novel genes that are activated by VegT, of which 13 were shown to be direct targets of VegT within the mesendoderm¹¹². Among these direct VegT targets, the transcription factors Snail, Hesr1 (hairy/enhancer-of- split related) and Esr4 (enhancer-of-split related 4) were shown to be essential for proper embryonic morphology. A similar approach using the drug SU5402 to block FGF signalling in Xenopus identified 43 FGFregulated genes, of which 26 were novel¹¹³. One of the 43 genes (Xmig6) was shown to be required for muscle differentiation, whereas a novel G-protein coupled receptor (encoded by Xgpcr4) seems to be involved in the morphogenesis of gastrulation. These approaches demonstrate the value of microarrays for finding novel genes that are regulated by the signalling and transcription factors that are involved in mesoderm induction, and for establishing regulatory relationships between known genes. Although initial experiments are likely to identify targets when a pathway is activated or blocked throughout the entire mesoderm-induction period (as with the elimination of VegT in the above example), the development of transgenic fish and frog embryos that contain inducible activators and inhibitors, as well as the use of specific pharmacological reagents, will facilitate the genome-wide examination of changes in gene expression when a signalling pathway is activated or blocked at a specific time in development. Because the functions of the different signalling factors are constantly changing over developmental time as discussed above, the use of microarray analysis combined with the ability to temporally regulate each of the signalling pathways will show how the transcriptional network changes to allow each of the signals to regulate different processes as embryogenesis proceeds.

Microarray analysis is not without its drawbacks. One of the problems is that when whole embryos are analysed, many non-mesodermal cells contribute to the signal. For genes that are expressed broadly throughout the mesoderm this might not be a problem, but many mesodermal fates are represented by only a small subset of cells from the entire embryo. One probable solution is to return to Nieuwkoop’s original assay. When animal caps are removed from embryos and treated with different factors such as Activin, which activates the Nodal signalling pathway, different cell fates are induced depending on the concentration of the factors used (reviewed in REF. 114) (FIG. 6). Although the cell populations in these explants typically are not made up of single cell types, they are enormously enriched in a particular tissue compared with the whole embryo. Moreover, because the explants can be maintained in culture for up to 2 months115, not only can the early events in mesoderm induction be examined, but longer-term changes in gene expression can also be analysed. Although animal cap explants have occasionally been used in zebrafish, they are technically more challenging and it is not yet clear whether the same approach will be useful. In zebrafish the use of transgenic lines that express a fluorescent protein from a cell-type specific promoter combined with fluorescent cell sorting might be a more feasible alternative.

Because mesoderm induction happens early in embryogenesis, it has been particularly easy to manipulate this process by injecting pools of synthetic RNAs into Xenopus embryos to identify genes that regulate mesoderm formation. Previous attempts used pooled libraries of cDNA that is attached to a promoter for the SP6 RNA polymerase (reviewed in REF. 116). Although some interesting genes have been identified in this way, there were several problems with this approach. Even in the most highly normalized library many cDNAs, especially abundant ones, were overrepresented. In addition, particularly for longer mRNAs, many cDNAs are not full length. Because of these problems, it was necessary to inject relatively large pools of synthetic RNAs to sample enough different cDNAs. Because there is a limit to the amount of RNA that can be injected into an embryo, these methods select for genes that produce an effect at very low doses, which might explain why many of the genes found this way encode signalling factors. With increasing information from large-scale sequencing projects, it is now possible to produce a library that contains full-length clones of many genes to test them in small pools by overexpression in the early embryo^116,117. One large-scale approach of this type identified 64 Xenopus genes that affected the mesoderm, from genes that caused defects in the morphogenesis of gastrulation to those that produced an extra axis¹¹⁷. Although some of these genes are well-known factors such as VegT, others are either novel or have not been studied in the context of mesoderm induction before. Given the amount of data that are generated using both classical and genomics-based approaches it is increasingly important to develop databases to connect and cross reference the data. One valuable effort in Xenopus called the Xenopus Mesendoderm Network shows the known molecular interactions as a generegulatory circuit, which can be constantly modified as new data become available118. Because data are of variable reliability and sometimes conflict, curating such a database is a major challenge, but it still represents the best approach for understanding the underlying circuitry in the mesoderm. Other databases with searchable gene-expression patterns not only allow all genes with a mesodermal expression pattern to be found, but also provide connections to the relevant literature (Axeldb for Xenopus and ZFIN for zebrafish).

Conclusions

The field of mesoderm induction has advanced a great deal in the almost 40 years since its origin, identifying the key signalling factors and establishing the groundwork for understanding their roles in forming the mesoderm. Genomic approaches will probably identify additional key players downstream of these signals, including those that are involved not only in cell-fate decisions but also in the equally essential process of mesodermal morphogenesis, which transforms the spherical embryo into the final embryonic body plan.

Because the mesoderm gives rise to many cell fates and because it involves a wide variety of morphogenetic movements, it continues to provide a wealth of important embryological problems to study. With the zebrafish and Xenopus genomes to be completed in the near future, and the use of microarrays, morpholinos, expression screens and zebrafish genetic screens, most if not all the genes involved in this process will probably soon be identified. The future challenge will be to understand how these genes interact to regulate cell fate and morphogenesis. One of the main goals will be to understand how the signalling factors interact to activate specific patterns of gene expression within the mesoderm, and how the roles of the signalling factors can change rapidly over developmental time. The development of methods to temporally regulate each of the signalling pathways within the embryo will be useful in this regard, as will the production of transgenic lines that contain the regulatory elements of specific marker genes that drive the expression of a fluorescent protein, which provides the ability to examine gene expression in living embryos (and using different colours of fluorescent proteins, multiple marker genes can be analysed simultaneously). The large wealth of data that will come from the sequencing projects, along with improved bioinformatics methods for analysing microarray data and finding candidate transcription-factor binding sites, will also be useful in determining how combinatorial gene regulation occurs within the mesoderm.

A second goal will be to understand how the different signalling factors coordinate cell fate and morphogenesis, which will be greatly aided by the increasing knowledge of the intracellular networks used by each of the signalling pathways that are involved in mesoderm induction, and by the ability to precisely manipulate different aspects of these intracellular pathways in the embryo. Moreover, the ability to analyse cells in vivo using fluorescent proteins that are expressed within specific subsets of mesodermal cells, along with improved confocal microscopes, will allow the behaviour of cells within the embryo to be analysed in a much more sophisticated way than has been possible before.

Finally, by comparing the results that have been obtained in Xenopus and zebrafish to those from chick and mouse studies, it will be possible to understand which aspects of mesoderm induction are common among vertebrates, and which have changed during evolution to allow for the specific needs of each species. Building on the classical foundations and using the new methodologies, the mesoderm-induction field will continue to produce new insights into many important embryological questions.

Mesoderm induction: from caps to chipsDavid Kimelman NATURE REVIEWS | GENETICS. VOLUME 7 | No.5, P.360=363 | MAY 2006 |doi:10.1038/nrg1837

Mesoderm induction: from caps to chips
David Kimelman
NATURE REVIEWS | GENETICS. VOLUME 7 | No.5, P.360=363 | MAY 2006 |doi:10.1038/nrg1837