Нервная Система

Detection of Mammalian microRNA Expression by In Situ Hybridization With RNA Oligonucleotides M.Deo, J-Y. Yu, K-H.Chung, M.Tippens, D.L.Turner Dev.Dyn. - 2006.- V.235, No 9, P. 2538-2548
Разработан новый метод, который позволяет выявлять преимущественно зрелые miРНК скорее, чем предшественники miРНК или первичные транскрипты. Выявили паттерн экспрессии для некоторых miРНК, экспрессирующихся в развивающейся и взрослой нервной системе мышей, включая miR-124a, miR-9, miR92 и miR204. В то время как miR-124a экспрессируется в нейронах, miR-9 экспрессируется в нейральных предшественниках и некоторых нейронах, а miR-204 экспрессируется в хороидном сплетении, пигментном эпителии сетчатки и цилиарных телах. miR-204 локализуется в интроне гена TRPM3, а TRPM3 мРНК ко-экспрессируется с miR-204 в хороидном сплетении. Установлено также. что первичные транскрипты для miR-124a и miR-9 экспрессируются в виде паттерна, сходного с таковым для зрелых miРНК.	В последние годы сотни генов малых не кодирующих РНК, известных как microRNA (miРНК), были идентифицированы у млекопитающих и др. животных (Lagos-Quintana et al., 2001,2002; Lau et al., 2001; Lee, Ambros, 2001; Mourelatos et al., 2002; Dostie et al., 2003; Lim et al., 2003a; Bentwich et al., 2005; Berezikov et al., 2005; Sewer et al., 2005; Xie et al., 2005). miРНК обычно в 20-24 нуклеотида (nt) длиной и обеспечивают сиквенс-специфическое связывание белок-miРНК комплекса частично или полностью с комплементарными последовательностями мРНК мишеней. Затем комплекс белок-miРНК негативно регулирует генную экспрессию на уровне стабильности и/или трансляции мРНК (Yekta et al., 2004; Bagga et al., 2005; Liu et al., 2005; Petersen et al., 2006). Синтез miРНК является многоступенчатым. Первоначально miРНК транскрибируются с помощью РНК полимеразы II в виде первичных транскриптов (pri-miРНК), которые расщепляются с помощью Drosha эндонуклеазы, чтобы высвободить примерно в 60-nt stem-loop предшественник (pre-miРНК; Lee et al., 2003; Gregory et al., 2004; Zeng et al., 2005). Stem-loop предшественник экспортируется из ядра и подвергается процессингу с помощью Dicer эндонуклеазы, чтобы высвободить mature miРНК, которая может инкорпорироваться в комплекс с членами семейства белков Argonaute (Hutvagner et al., 2001; Ketting et al., 2001; Lee et al., 2002; Mourelatos et al., 2002; Meister et al., 2004). Ткане-специфическое клонирование, Northern blot и microarray анализ показал, что большинство miРНК млекопитающих экспрессируется в специфических тканях (Lagos-Quintana et al., 2002, 2003; Dostie et al., 2003; Krichevsky et al., 2003). Многие miРНК экспрессируются преимущественно или исключительно в развивающейся и/или взрослой нервной системе, указывая тем самым, что регуляция miРНК может играть важную роль в нейрогенезе или функции нейронов у млекопитающих. Функциональный анализ выявил miРНК, которые регулируют судьбы и дифференцировку нейрональных клеток у беспозвоночных (Johnston et al., 2005), а недавние исследования подтвердили роль для некоторых miРНК в дифференцировке нейронов у млекопитающих (Krichevsky et al., 2006; Vo et al., 2005; Wu, Belasco, 2005). Одним из ограничений анализа функций miРНК в нервной системе млекопитающих является трудность в выявлении паттернов экспрессии специфических miРНК. В большинстве исследований установлена экспрессия miРНК путем анализа РНК, выделенных из вырезанной ткани, подходом с ограниченным пространственным разрешением. Альтернативно используется у беспозвоночных и позвоночных подход внесения генетически закодированной сенсорной молекулы, которая экспрессируется широко, но ингибируется только в клетках, в которых присутствуют специфические miРНК (Brennecke et al., 2003; Mansfield et al., 2004; Smirnova et al., 2005). Хотя этот метод нуждщается в трансгенных животных, чтобы визуализировать экспрессию in vivo . Недавно сообщалось, что нерадиоактивная in situ гибридизация с locked nucleic acid (LNA) зондом , меченным digoxigenin hapten, может быть использована для выявления miРНК (Sokol, Ambros, 2005; Wienholds et al., 2005; Kloosterman et al., 2006; Nelson et al., 2006). Мы независимо разработали гибридизацию in situ для детекции miРНК, базирующуюся на РНК нуклеотидных зондах, сцепленных с fluorescein hapten. DISCUSSION Мы использовали синтетические fluorescein-меченные РНК олигонуклеотиды в качестве гибридизационных зондов, которые позволили использовать RNase переваривание, чтобы удалять не связанные зонды. Fluorescein-меченные ДНК олигонуклеотидные зонды также выявляли эндогенные miРНК, но со значительно более высоким фоном тканевых срезов, возможно из-за неспецифического связывания зондов. Чтобы обеспечить специфичность последовательностей, мы использовали TMAC-based отмывки, сходные с теми, что используются для аллель-специфичных олигонуклеотидных зондов (Litt et al., 1998). Для наиболее распространенной miРНК miR-124a мы нашли, что два одиночных нуклеотида не правильно соединяясь (mismatches) с зондом, существенно подавляли гибридизацонный сигнал. Используя этот метод, мы установили паттерн экспрессии для нескольких специфичных для нейронов miРНК. Мы сфокусировались на детекции экспрессии miРНК в срезах тканей и культуре клеток, тогда как гибридизация in situ с LNA зондами (Kloosterman et al., 2006; Nelson et al., 2006) применима к целым рыбкам данио рерио или мышам (Wienholds et al., 2005; Kloosterman et al., 2006)? к срезам головного мозга людей (Nelson et al., 2006) и эмбрионам дрозофилы (Sokol. Ambroa, 2005). В противоположность нашим результатам было сообщено, что РНК или ДНК олиго зонды неспособны выявлять miРНК. Это расхождение может быть связано с использованием др. условий и/или с зондами с др. метящей эффективностью. Также как мы наблюдали с РНК зондами, зонды LNA были способны различать близко родственные miРНК последовательности, а паттерны экспрессии, наблюдаемые с помощью этого метода, по-видимому, сходны. Единственное различие между двумя методами, что мы использовали TMAC отмывание, чтобы получить Tm для зондовых дуплексов независимо от состава оснований, это позволяло готовить зонды для разных miРНК в идентичных условиях... Паттерны экспрессии первичных транскриптов и зрелых miРНК были сходными, это указывает на то, что продукция этих miРНК регулируется в основном на уровне транскрипции. Мы установили, что miR-124a экспрессируется в дифференцирующихся и зрелых нейронах почти во всей ЦНС. Напротив, miR-9? по-видимому, экспрессируется в предшественниках нейронов большей части ЦНС, хотя она экспрессируется и дифференцированных клетках в телэнцефалоне. Гибридизация с зондами для др. miРНК дала разные паттерны как в эмбриональном. так и взрослом головном мозге. Паттерны экспрессии, наблюдаемые для miR-124a, miR-9 и miR-92 в срезах Е11.5 и Е14.5 эмбрионов мышей, по-видимому, согласуются паттернами, наблюдаемыми с помощью LNA зондов целых мышиных Е10.5 эмбрионов и эмбрионов рыбок данио (Wienholds et al., 2005; Kloosterman et al., 2006). Паттерны экспрессии для MiR-124a и miR-9 в головном мозге взрослых мышей, по-видимому, сходны с экспрессией в головном мозге взрослых людей, выявленной с помощью LNA зондов (Nelson et al., 2006), за исключением того, что мы наблюдали экспрессию miR-9 в субвентрикулярной зоне у мышей. Это может отражать различия во взрослом нейрогенезе между грызунами и людьми (Bedard, Parent, 2004). Функциональная роль большинства нейральных miРНК млекопитающих, включая miR-124a и miR-9, ещё не установлена. Предполагается, что miR-124a играет роль в обеспечении качественных особенностей нейронов, путем запуска деградации не-нейрональных мРНК (Lim et al., 2005; Conaco et al., 2006). Krichevsky et al., (2005) сообщили, что избыточная экспрессия miR-124a и miR-9/9* совместно в эмбриональных стволовых клетках усиливала нейрональную дифференцировку в направлении нейронов относительно глии, тогда как блокирование функции miR-9 в этой системе снижало количество нейронов относительно глии. Их наблюдения подтверждают, что miR-124a и miR-9 играют роль в выборе клеточной нейрональной судьбы. Наши результаты показывают, что степень экспрессии miR-9 в вентрикулярной зоне становится более ограниченной по ходу развития ЦНС, за исключением телэнцефалона. Интригующая возможность заключается в том, что ограничение экспрессии miR-9 может вносить вклад в онтогенетический сдвиг с генерации нейронов к генерации глиальных клеток. Мы установили, что в мышиных Р19 клетках, дифференцирующиеся в нейроны, избыточная экспрессия miR-124a усиливает выросты нейритов, в то время как блокирование функции miR-12a задерживает выросты нейритов, оба эти эффекта наблюдались и в кортикальных нейронах, дифференцирующихся in vitro. Эти наблюдения подтверждают роль miR-124a в регуляции нейрональной дифференцировки. miR-204 сначала была выделена из глаз, мы наблюдали, что miR-204 высоко экспрессируется в RPE и цилиарных телах. miR-204 также специфически экспрессируется в хороидном сплетении. Хороидное сплетение и цилиарные тела участвуют в секреции жидкости (цереброспинальной жидкости и aqueuos humor, соотв.), указывая тем самым, что miR-204 выполняет регуляторную роль в этом процессе. miR-204 локализуется в интроне гена TRPM3 и TRPM3 также экспрессируется в хороидном сплетении. TRPM3 кодирует катионный канал, но его биологическая функция неизвестна. Субнабор miРНК, располагающихся внутри интронов белок кодирующих генов (Rodriguez et al., 2004) и анализ данных микромассивов показали, что экспрессия некоторых интронных miРНК коррелирует с экспрессией мРНК с того же локуса (Baskerville, Bartel, 2005). Однако, у дрозофилы, по крайней мере, некоторые интронные miРНК могут не коррелировать с соотв. мРНК (Aboobaker et al., 2005).

В последние годы сотни генов малых не кодирующих РНК, известных как microRNA (miРНК), были идентифицированы у млекопитающих и др. животных (Lagos-Quintana et al., 2001,2002; Lau et al., 2001; Lee, Ambros, 2001; Mourelatos et al., 2002; Dostie et al., 2003; Lim et al., 2003a; Bentwich et al., 2005; Berezikov et al., 2005; Sewer et al., 2005; Xie et al., 2005). miРНК обычно в 20-24 нуклеотида (nt) длиной и обеспечивают сиквенс-специфическое связывание белок-miРНК комплекса частично или полностью с комплементарными последовательностями мРНК мишеней. Затем комплекс белок-miРНК негативно регулирует генную экспрессию на уровне стабильности и/или трансляции мРНК (Yekta et al., 2004; Bagga et al., 2005; Liu et al., 2005; Petersen et al., 2006). Синтез miРНК является многоступенчатым. Первоначально miРНК транскрибируются с помощью РНК полимеразы II в виде первичных транскриптов (pri-miРНК), которые расщепляются с помощью Drosha эндонуклеазы, чтобы высвободить примерно в 60-nt stem-loop предшественник (pre-miРНК; Lee et al., 2003; Gregory et al., 2004; Zeng et al., 2005). Stem-loop предшественник экспортируется из ядра и подвергается процессингу с помощью Dicer эндонуклеазы, чтобы высвободить mature miРНК, которая может инкорпорироваться в комплекс с членами семейства белков Argonaute (Hutvagner et al., 2001; Ketting et al., 2001; Lee et al., 2002; Mourelatos et al., 2002; Meister et al., 2004).

Ткане-специфическое клонирование, Northern blot и microarray анализ показал, что большинство miРНК млекопитающих экспрессируется в специфических тканях (Lagos-Quintana et al., 2002, 2003; Dostie et al., 2003; Krichevsky et al., 2003). Многие miРНК экспрессируются преимущественно или исключительно в развивающейся и/или взрослой нервной системе, указывая тем самым, что регуляция miРНК может играть важную роль в нейрогенезе или функции нейронов у млекопитающих. Функциональный анализ выявил miРНК, которые регулируют судьбы и дифференцировку нейрональных клеток у беспозвоночных (Johnston et al., 2005), а недавние исследования подтвердили роль для некоторых miРНК в дифференцировке нейронов у млекопитающих (Krichevsky et al., 2006; Vo et al., 2005; Wu, Belasco, 2005).

Одним из ограничений анализа функций miРНК в нервной системе млекопитающих является трудность в выявлении паттернов экспрессии специфических miРНК. В большинстве исследований установлена экспрессия miРНК путем анализа РНК, выделенных из вырезанной ткани, подходом с ограниченным пространственным разрешением. Альтернативно используется у беспозвоночных и позвоночных подход внесения генетически закодированной сенсорной молекулы, которая экспрессируется широко, но ингибируется только в клетках, в которых присутствуют специфические miРНК (Brennecke et al., 2003; Mansfield et al., 2004; Smirnova et al., 2005). Хотя этот метод нуждщается в трансгенных животных, чтобы визуализировать экспрессию in vivo . Недавно сообщалось, что нерадиоактивная in situ гибридизация с locked nucleic acid (LNA) зондом , меченным digoxigenin hapten, может быть использована для выявления miРНК (Sokol, Ambros, 2005; Wienholds et al., 2005; Kloosterman et al., 2006; Nelson et al., 2006). Мы независимо разработали гибридизацию in situ для детекции miРНК, базирующуюся на РНК нуклеотидных зондах, сцепленных с fluorescein hapten.

DISCUSSION

Мы использовали синтетические fluorescein-меченные РНК олигонуклеотиды в качестве гибридизационных зондов, которые позволили использовать RNase переваривание, чтобы удалять не связанные зонды. Fluorescein-меченные ДНК олигонуклеотидные зонды также выявляли эндогенные miРНК, но со значительно более высоким фоном тканевых срезов, возможно из-за неспецифического связывания зондов. Чтобы обеспечить специфичность последовательностей, мы использовали TMAC-based отмывки, сходные с теми, что используются для аллель-специфичных олигонуклеотидных зондов (Litt et al., 1998). Для наиболее распространенной miРНК miR-124a мы нашли, что два одиночных нуклеотида не правильно соединяясь (mismatches) с зондом, существенно подавляли гибридизацонный сигнал. Используя этот метод, мы установили паттерн экспрессии для нескольких специфичных для нейронов miРНК.

Мы сфокусировались на детекции экспрессии miРНК в срезах тканей и культуре клеток, тогда как гибридизация in situ с LNA зондами (Kloosterman et al., 2006; Nelson et al., 2006) применима к целым рыбкам данио рерио или мышам (Wienholds et al., 2005; Kloosterman et al., 2006)? к срезам головного мозга людей (Nelson et al., 2006) и эмбрионам дрозофилы (Sokol. Ambroa, 2005). В противоположность нашим результатам было сообщено, что РНК или ДНК олиго зонды неспособны выявлять miРНК. Это расхождение может быть связано с использованием др. условий и/или с зондами с др. метящей эффективностью. Также как мы наблюдали с РНК зондами, зонды LNA были способны различать близко родственные miРНК последовательности, а паттерны экспрессии, наблюдаемые с помощью этого метода, по-видимому, сходны. Единственное различие между двумя методами, что мы использовали TMAC отмывание, чтобы получить Tm для зондовых дуплексов независимо от состава оснований, это позволяло готовить зонды для разных miРНК в идентичных условиях...

Паттерны экспрессии первичных транскриптов и зрелых miРНК были сходными, это указывает на то, что продукция этих miРНК регулируется в основном на уровне транскрипции.

Мы установили, что miR-124a экспрессируется в дифференцирующихся и зрелых нейронах почти во всей ЦНС. Напротив, miR-9? по-видимому, экспрессируется в предшественниках нейронов большей части ЦНС, хотя она экспрессируется и дифференцированных клетках в телэнцефалоне. Гибридизация с зондами для др. miРНК дала разные паттерны как в эмбриональном. так и взрослом головном мозге. Паттерны экспрессии, наблюдаемые для miR-124a, miR-9 и miR-92 в срезах Е11.5 и Е14.5 эмбрионов мышей, по-видимому, согласуются паттернами, наблюдаемыми с помощью LNA зондов целых мышиных Е10.5 эмбрионов и эмбрионов рыбок данио (Wienholds et al., 2005; Kloosterman et al., 2006). Паттерны экспрессии для MiR-124a и miR-9 в головном мозге взрослых мышей, по-видимому, сходны с экспрессией в головном мозге взрослых людей, выявленной с помощью LNA зондов (Nelson et al., 2006), за исключением того, что мы наблюдали экспрессию miR-9 в субвентрикулярной зоне у мышей. Это может отражать различия во взрослом нейрогенезе между грызунами и людьми (Bedard, Parent, 2004).

Функциональная роль большинства нейральных miРНК млекопитающих, включая miR-124a и miR-9, ещё не установлена. Предполагается, что miR-124a играет роль в обеспечении качественных особенностей нейронов, путем запуска деградации не-нейрональных мРНК (Lim et al., 2005; Conaco et al., 2006). Krichevsky et al., (2005) сообщили, что избыточная экспрессия miR-124a и miR-9/9* совместно в эмбриональных стволовых клетках усиливала нейрональную дифференцировку в направлении нейронов относительно глии, тогда как блокирование функции miR-9 в этой системе снижало количество нейронов относительно глии. Их наблюдения подтверждают, что miR-124a и miR-9 играют роль в выборе клеточной нейрональной судьбы. Наши результаты показывают, что степень экспрессии miR-9 в вентрикулярной зоне становится более ограниченной по ходу развития ЦНС, за исключением телэнцефалона. Интригующая возможность заключается в том, что ограничение экспрессии miR-9 может вносить вклад в онтогенетический сдвиг с генерации нейронов к генерации глиальных клеток. Мы установили, что в мышиных Р19 клетках, дифференцирующиеся в нейроны, избыточная экспрессия miR-124a усиливает выросты нейритов, в то время как блокирование функции miR-12a задерживает выросты нейритов, оба эти эффекта наблюдались и в кортикальных нейронах, дифференцирующихся in vitro. Эти наблюдения подтверждают роль miR-124a в регуляции нейрональной дифференцировки.

miR-204 сначала была выделена из глаз, мы наблюдали, что miR-204 высоко экспрессируется в RPE и цилиарных телах. miR-204 также специфически экспрессируется в хороидном сплетении. Хороидное сплетение и цилиарные тела участвуют в секреции жидкости (цереброспинальной жидкости и aqueuos humor, соотв.), указывая тем самым, что miR-204 выполняет регуляторную роль в этом процессе. miR-204 локализуется в интроне гена TRPM3 и TRPM3 также экспрессируется в хороидном сплетении. TRPM3 кодирует катионный канал, но его биологическая функция неизвестна. Субнабор miРНК, располагающихся внутри интронов белок кодирующих генов (Rodriguez et al., 2004) и анализ данных микромассивов показали, что экспрессия некоторых интронных miРНК коррелирует с экспрессией мРНК с того же локуса (Baskerville, Bartel, 2005). Однако, у дрозофилы, по крайней мере, некоторые интронные miРНК могут не коррелировать с соотв. мРНК (Aboobaker et al., 2005).

Detection of Mammalian microRNA Expression by In Situ Hybridization With RNA OligonucleotidesM.Deo, J-Y. Yu, K-H.Chung, M.Tippens, D.L.Turner Dev.Dyn. - 2006.- V.235, No 9, P. 2538-2548

Detection of Mammalian microRNA Expression by In Situ Hybridization With RNA Oligonucleotides
M.Deo, J-Y. Yu, K-H.Chung, M.Tippens, D.L.Turner
Dev.Dyn. - 2006.- V.235, No 9, P. 2538-2548