Редактирование РНК является сайт-специфической модификацией последовательности РНК, чтобы дать продукт, отличающийся от того, что кодируется ДНК матрицей. Большинство редактирований РНК в клетках человека является редактированием adenosine на inosine (A-to-I), которое связано с конверсией A-to-I в dsRNA [25,26]. A-to-I редактирование РНК катализируется с помощью adenosine deaminases acting on RNA (ADARs). Большинство мест A-to-I редактирования РНК находятся в dsRNA структурах, формируемых между инвертированными повторяющимися последовательностями в интронных или межгенных РНК [25,27-30]. Следовательно, двунитчатые предшественники miRNAs могут быть субстратом для A-to-I редактирования. В самом деле, недавно было показано, что pri-miRNA транскрипт miRNA miR-22 человека является предметом A-to-I редактирования РНК в ряде тканей мышей и людей [31]. Хотя степень A-to-I редактирования ни зка (менее 5% относительно всех проанализированных аденозинов), однако целенаправленно затрагиваемые аденозины были в позициях, предсказывающих влияние на биогенез и функцию miR-22. Это открывает возможность того, что редактирование РНК может быть в целом очень важным для функции гена miRNA [31]. В данной работе мы систематически исследовали присутствие редактирования РНК в miRNAs.
To search for RNA-editing sites in human miRNAs, PCR product sequencing was performed from matched total cDNA and genomic DNA isolated from adult human brain, heart, liver, lung, ovary, placenta, skeletal muscle, small intestine, spleen and testis. Primers were designed to amplify pri-miRNA sequences flanking all 231 human miRNAs in miRBase [6]. Of these, 99 miRNA containing sequences were successfully sequenced in both directions and from duplicate PCR products from total cDNA of at least one tissue. Total cDNA sequence traces were compared with genomic DNA sequence traces from the same individual, and A-to-I editing was identified as an A in the genomic DNA sequence compared with a novel G peak at the equivalent position in the total cDNA sequence.
In total, 12 of the 99 miRNA-containing sequences (13%) were subject to A-to-I RNA editing according to A-to-G differences between matched genomic DNA and total cDNA sequence traces from at least one tissue (Figure 1). These sequences were next oriented with respect to the strand of transcription of the miRNAs. In six cases the A-to-G changes were in the same orientation as the miRNA, and overlap the stem-loop structure of the miRNA, consistent with RNA editing of the pri-miRNA precursor transcript. In an additional case, A-to-I editing was observed in a novel stem-loop structure in sequence adjacent to the unedited miRNA miR-374. This novel stem-loop structure may represent a novel miRNA (Figure 2, novel hairpin). In the remaining five cases, the A-to-G changes were from the opposite strand to the miRNA (that is, U-to-C changes in the miRNA sequence). Although U-to-C editing of miRNA sequences cannot be ruled out, no editing of this type has previously been observed and no enzymes capable of catalyzing this conversion are known. The most likely explanation is that these are A-to-I edits in a transcript derived from the DNA strand complementary to the annotated miRNA gene. Consistent with this hypothesis, all of these sequences overlap, or are adjacent to, genes transcribed from the opposite strand to the annotated miRNA gene. To distinguish these sequences from the edited pri-miRNAs, these sequences are referred to here as edited antisense pri-miRNAs (Table 1). One of the antisense pri-miRNAs contains editing sites overlapping the intended miRNA (miR-144) and miR-451, a recently identified miRNA that was not deliberately included in our list of 231 miRNAs.
Collectively the 13 sequences were edited at 18 sites. Ten out of the 13 were edited at a single site. miR-376a and antisense miR-451 were each edited at two sites, and antisense miR-371 was edited at four sites. The extent of editing varied with editing site and with tissue, ranging from around 10% (for example, miR-151 in multiple tissues) to around 70% (antisense miR-371 in placenta). Overall, the levels of RNA editing observed were considerably higher than the approximately 5% editing previously reported for the -1 position of miR-22 [31]. Editing of miR-22 was not detectable by our method, presumably because the low levels of editing of this miRNA fall below our limits of detection. All miRNAs were found to be edited in multiple tissues, with the extent of editing varying from tissue to tissue (Figure 1).
All novel A-to-I editing sites were found within the dsRNA stems of the predicted stem-loop structures (Figure 2). Of the seven editing sites in pri-miRNAs, four were in the 22-nucleotide mature miRNA. Three of these were within nucleotides 2 to 7, which are thought to be important for conferring binding-site specificity between the miRNA and its target sites [3]. Five out of seven editing sites in pri-miRNAs were at single nucleotide A:C mismatches flanked by paired bases. Similarly, five out of seven editing sites were in 5'-UAG-3' trinucleotides. These results are consistent with local structural and sequence preferences of RNA editing determined from A-to-I editing sites in inverted repeat sequences [25]. Three of the ten editing sites in antisense pri-miRNAs were in 5'-UAG-3' trinucleotides. Six of the ten editing sites were at A:C mismatches. Only one was at a single A:C mismatch, however, with the remainder at extended mismatches involving more than one consecutive nucleotide.
Discussion
Мы идентифицировали новые A-to-I места редактирования в 6 из 99 pri-miRNAs, это указывает на то, что, по крайней мере, 6% всех miRNAs человека могут быть мишенями для редактирования РНК. Мы оказались способны определить только относительно высокие уровни редактирования, как это иллюстрируется нашей неспособностью выявить редактирование miR-22, так что эти подсчеты скорее занижены. Более того, наш метод не является нить-специфичным и не может отличать множественные перекрывающиеся транскрипты от одного и того же геномного локуса. Т.о., в областях транскрипционной сложности, скорее всего будет то, что чувствительность нашего метода будет снижена. Напр., даже miRNAs, которые на 100% редактируются будут, по-видимому, оставаться не отредактированными, если транскрибируются на низких уровнях по сравнению с нередактируемыми перекрывающимися транскриптами с противоположных нитей. Мы также оказались неспособны выявить редактирование РНК, если оно происходит после процессинга pri-miRNA (напр., с помощью сплайсинга), так что сайты связывания для PCR primers удаляются.
Помимо редактирования pri-miRNAs, 6 антисмысловых pri-miRNA транскрипта, происходящих с противоположной нити по отношению к annotated miRNA, оказались предметом A-to-I редактирования. Имеется множество объяснений ждя очевидного редактирования противоположной нити по отношению к annotated miRNA. Одна из возможностей, что эти последовательности действительно обусловлены U-to-C редактированием pri-miRNA. Однако, не известны U-to-C RNA редактирующие энзимы, способные катализировать такую реакцию и несмотря на обширные поиски мест редактирования РНК описано единственное место U-to-C редактирования РНК [32]. Следовательно, скорее всего, что эти последовательности представляют редактируемый транскрипт с противоположной нити по отношению к annotated miRNA. Эти транскрипты д.б. др. miRNA, транскрибируемыми и processed с геномной нити, противоположной annotated miRNA, или они д.б. неким др. классом транскриптов, напр., интроном гена, перекрывающегося с annotated miRNA, но транскрибируемым с противоположной нити ДНК. Альтернативно, возможно, что pri-miRNAs, была неправильно annotated с неправильной нитью генома.
Чтобы оценить возможность того, что редактирование антисмысловых pri-miRNAs обусловлено неправильной annotation miRNAs с неправильной геномной нити, мы исследовали предыдущие экспериментальные данные, полученные для этих miRNAs. Одна из редактируемых антисмысловых последовательностей pri-miRNA происходит с нити ДНК оппозитной computationally предсказанной miR-215 [33]. Методом использованным, чтобы спрогнозировать miR-215, были успешно предсказаны 81 из 109 известных miRNAs из эталонного набора, но около 20% (17/81) были предсказаны на неправильной нити генома [33]. Наши данные и направление перекрывания транскриптов подтверждают, что miR-215 может быть аннотирована с неправильной геномной нити.
Редактируемые антисмысловые miRNA последовательности также происходят с нити ДНК, оппозитной экспериментально верифицированной miRNA, miR-133a [34]. Эта miRNA присутствует в геноме в двух копиях (miR-133a-1 и miR-133a-2). Копия miR-133a-2 располагается внутри гена, транскрибируемого в том же самом направлении, что и аннотированный ген miRNA. Напротив, копия miR-133a-1 перекрывает ген, транскрибируемый с противоположной нити. Клонирование и анализ экспрессии miR-133a [34] предоставляет доказательства, что, по крайней мере, одна копия miR-133a транскрибируется. Как результат этой находки обе копии miR-133a были аннотированы в соответствии с последовательностью клонируемой копии. Учитывая направление перекрывающих транскриптов, однако, остается возможным, что miR-133a-1 транскрибируется с противоположной нити относительно miR-133a-2, и дает др. miRNA. В самом деле, наши результаты, подтверждают, что miR-133a-1 может неправильно аннотироваться. Сходным образом, обе копии экспериментально верифицированной miR-194 (miR-194-1 и miR-194-2) были аннотированы с соответствии с последовательностью клонируемой копии [34]. Наши данные и присутствие перекрывающихся транскриптов на оппозитной нити подтверждают, что miR-194-1 также может быть некорректно аннотирована с неправильной геномной нити. В случае mir-133a и mir-194, две копии могут генерировать miRNAs, которые в точности комплементарны одна другой. Ранее было подтвержено, что пары комплементарных miRNAs играют роль в регуляции miRNA путем формирования miRNA:miRNA дуплексов [35]. Наши результаты подтвердили, что редактирование РНК может добавлять ещё один уровень регуляции путем нарушения комплементарности в miRNA:miRNA дуплексах.
Дальнейшие две редактируемые антисмысловые последовательности miRNA (antisense mir-144 и antisense mir-451) перекрывают miRNAs, которые аннотированы на базе их сходства с мышиными miRNAs, и не были клонированы и не было показано с помощью northern blotting, что экспрессируются в тканях человека. Остальные антисмысловые последовательности miRNA перекрывают mir-371, которая была оценена путем клонирования и northern blotting в тканях человека и , следовательно, корректно аннотируется.
Присутствие редактируемых нуклеотидов в pri-miRNA транскриптах указывает на то, что редактирование РНК происходит рано в биогенезе miRNA. Последующие процессы, которые распознают последовательности или структурные свойства предшественников miRNA, могут, следовательно, в принципе подвергаться РНК редактированию. Сюда входит расщепление pri-miRNA с помощью Drosha, экспорт pre-miRNA в ядро с помощью exportin-5, расщепление pre-miRNA с помощью Dicer и выбор нити miRNA для включения в microprocessor комплекс. В самом деле, недавно было продемонстрировано, что РНК редактирование pri-miRNAs может приводить в результате к супрессии процессинга с помощью Drosha и к последующей деградации не подвергшейся процессингу отредактированной pri-miRNA [36]. Хотя остается неясным, может ли miRNA, чьи пары оснований с её мишенью посредством I:U колеблются (wobble), быть функциональной, др. возможность состоит в том, что РНК редактирование может менять сайт-мишень комплементарности.
Чтобы исследовать эффект РНК редактирования miRNAs на target-site complementarity, мы исползовали miRanda программное обеспечение [37], чтобы предсказать сайты связывания редактируемых miRNAs в 3' UTRs и сравнить их с предсказываемыми сайтами связывания эквивалентных не редактируемых miRNAs. Для каждой из 4-х pri-miRNAs с сайтом редактирования в зрелой 22mer, the set of predicted targets of edited miRNAs differs from the predicted targets of edited miRNAs (Table 1). Для трех miRNAs, у которых редактируемый adenosine находится в позиции 2 из семи оснований от 5' конца miRNA (miR-151, miR376a и miR-379), более половины мишеней редактируемых miRNA являются уникальными для редактируемых miRNA. В случае miR-99a различия малы, только 5/75 (6%) предсказанных мишеней отличались между редактированными и не редактированными miRNAs. Во всех случаях, верхняя десятка предсказанных мишеней у редактируемых miRNA отличалась от верхней десятки предсказанных мишеней у не редактированных miRNA (data not shown).
Мы идентифицировали Gene Ontology (GO) terms в категории 'cellular process' [38], которые были избыточно представлены в прогнозируемых мишенях редактированных и не редактированных miRNAs по сравнению со всеми Ensembl генами (Figure 3). Для трех miRNAs, которые редактируются с 5' seed области (miR-151, miR-376a и miR-379), сравнение избыточно представленных GO terms, ассоциированных с предсказываемыми мишенями редактированных и не редактированных копий выявляет определенные различия (Figure 3). Особенно интересны добавочные термины, которые становятся избыточно представленными (over-represented); сюда входит регуляция запрограммированной клеточной гибели, биосинтез, РНК метаболизм, пролиферация клеток и транскрипция (Figure 3).
РНК редактирование может , следовательно, вносить вклад в разнообразие miRNA путем генерации множественных разнообразных miRNAs из инициального пула идентичных miRNA транскриптов. Напр., общее количество предсказываемых мишеней Hsa-mir-151 увеличивается с 143 до 229, если принять во внимание как редактируемые, так и не редактируемые miRNAs. Редактирование miRNAs может одновременно облегчить и улучшить эффекты регуляции генов с помощью miRNAs путем изменения концентрации индивидуальных miRNAs.
Conclusion
We have performed the first systematic survey of RNA editing of human miRNAs. We have identified RNA editing sites in at least 6% of human miRNAs that may impact on miRNA processing, including edits that alter miRNA binding sites and contribute to miRNA diversity. Furthermore, our results suggest that some miRNA genes may have been incorrectly annotated to the wrong strand of the genome. This has implications for the interpretation of existing miRNA experiment data and future experimental design.
Сайт создан в системе
uCoz
