Способы

Giant proteins that move DNA: bullies of the genomic playground *Nicholas R. Cozzarelli, Gregory J. Cost, Marcelo Nollmann, Thierry Viard and James E. Stray** NATURE REVIEWS \| MOLECULAR CELL BIOLOGY VOLUME 7 \| AUGUST 2006 \| 581 doi:10.1038/nrm1982
As genetic material DNA is wonderful , but as a macromolecule it is unruly, voluminous and fragile. Without the action of DNA replicases, topoisomerases, helicases, translocases and recombinases, the genome would collapse into a topologically entangled random coil that would be useless to the cell. We discuss the organization, movement and energetics of these proteins that are crucial to the preservation of a molecule that has such beautiful biological but challenging physical properties. Рис.1. \| Conformational changes during type II topoisomerase action. Рис.2. \| DNA translocation by FtsK is globally unidirectional but locally bidirectional. Рис.3. \| Stochastic initiation and movement of the replication fork. Box 1 \| DNA topology for beginners Box 2 \| Equilibrium in DNA-molecule distribution Box 3 \| Changes in DNA twist generated by DNA translocation Табл.1 General properties of DNA-moving and DNA-binding proteins DNA motors DNA-binding enzymes that use energy to move a segment of DNA processively from one point to another or to track along DNA. Septum The protein ring at the midpoint of a bacterial cell that demarcates the site of future cell division. Replisome A multiprotein complex that is involved in DNA replication. Ground state/transition state The most stable/least stable (lowest-energy/highest-energy) state of a chemical reaction. B-form DNA A right-handed double-helical conformation of DNA that is the most common form seen in solution. Decatenase/catenase An enzyme that removes/adds catenanes. Endergonic reaction A reaction that consumes or traps energy. Exergonic reaction A reaction that produces or releases energy. Catenane A topologically linked circular molecule. dif A 28-nucleotide sequence near the terminus of DNA replication in E. coli that is the recognition site for the XerC and XerD recombinases. AAA+ family of ATPases (ATPases with associated activities). A large family of ATP hydrolases that is typified by a highly conserved catalytic motif. The members of the family greatly vary in both form and function. Kinetochore A large multiprotein complex that assembles onto the centromere of the chromosome and links the chromosome to the microtubules of the mitotic spindle.	Информационное содержимое в данной длины ДНК ограничено простотой четверичного генетического кода. Соответственно, калька нуклеиновых кислот даже у простейшего организма значительно выше длины, чем сам организм. Проблема ДНК упаковки прекрасно оценена^1,2. Столь же важной является цель перемещения ДНК во время репликации и репарации, во время процесса упрощения ДНК топологии и во время сегрегации хромосом. Здесь обсуждаются высоко специализированные белки, которые движут ДНК, часто в определенном направлении со значительной скоростью и аккуратностью. Сюда входят DNA replicases, helicases, translocases, topo isomerases и recombinases. Рост геномов происходил наравне с увеличением клеточной сложности и был связан с управлением эволюции белков, обсуждаемых в данном обзоре. Напр., потребность в type II topoisomerases, которая разделяет и снова соединяет дуплексы ДНК, чтобы позволить др. пройти^3,4, необходима для для быстрого разрешения топологической запутанности крупных хромосом. Рассмотрим 4 движения относительно оси двойной спирали ДНК: ротацию вокруг оси, трансляцию вдоль оси, трансляцию латеральнее оси и разделение нитей ДНК. Ротация скручивает спираль ДНК и ведет к избыточному или недостаточному закручиванию. DNA translocases движутся вдоль оси ДНК. Боковые движения необходимы, чтобы выравнивать в линию ДНК и способствовать гомологичной рекомбинации и осуществляются за счет type II topoisomerases, действия которых позволяют расходиться хромосомам несмотря на индуцируемую репликацией запутанность вновь синтезируемых хромосом. Наконец, полная конверсия двунитчатой ДНК в однонитчатую ДНК необходима для дупликации любого генома, что обеспечивается replicative helicases. The theory of non-relativity: DNA moves Белок. который перемещается по молекуле ДНК может также рассматриваться как движетель ДНК. До недавнего времени считалось, что энзимы мигрируют продольно на десятки тысяч пар оснований (bp) вдоль ДНК, которая в основном стационарна. Напр., едавнее timelapse флюоресцентно-микроскопическое исследование показало, что белок DisA (или белок в комплексе с ним), который участвует у Bacillus subtilis в реакции на повреждения ДНК, является неспецифическим ДНК-связывающим белком, который формирует одиночный фокус in vivo и, , по-видимому, быстро сканирует хромосому, останавливаясь в местах повреждений ДНК⁵. Др. энзимы, как было предположено, используют сходный механизм для сканирования матрицы ДНК⁶. Неожиданно в некоторых др. случаях белковые комплексы не перемещаются по ДНК, а скорее ДНК движется через них. В этих случаях белки, которые перемещают ДНК могут рассматриваться скорее как насосы ДНК скорее, чем ДНК-направляющие энзимы. Это различие имеет значение для механизмов их действия. В зависимости от того, что движется, последствия могут быть драматически отличными. Напр,. относящаяся к делу референсная рамка в клеточной биологии является клеткой. Создание новой клеточной границы является фундаментальным и бесповоротным актом клеточного деления. Движение ДНК внутри клетки регулируется и д.б. аккуратным в отношении этого события. Крупные ДНК моторы, как было показано, закреплены на клеточной мембране, как в случае прокариотических ДНК транслоказ FtsK и SpoIIIE7-13. Такое закрепление фиксирует их позицию относительно клеточной границы и гарантирует, что ДНК будет двигаться относительно их. Эти процессы используют быструю и направленную транслокацию большого количества ДНК (~106 bp у Escherichia coli) на большое расстояние, а перемещения белковых комплексов, которые незначительные по сравнению со смещением ДНК. SpoIIIE является такой транслоказой. Её роль заключается в упаковке ДНК в предспору во время споруляции B. subtilis. SpoIIIE, как было показано, формирует стационарные фокусы на перегородке споруляции in vivo и прокачивает ДНК из материнской клетки в предспору¹⁴. RNA polymerase (RNAP), как было показано, перемещает ДНК, если фиксирована на твердой поверхности¹⁵. Чтобы двигать ДНК in vivo, RNAP д. быть стационарной и эта возможность подтверждена^16,17. Результаты экспериментов, базирующихся на ингибировании транскрипции у B. subtilis согласуются с неподвижностью RNAP¹⁸. Недавно актин-подобный цитоскелетный белок (MreB), как было установлено, взаимодействует с RNAP in vivo и in vitro, это открывает возможность взаимодействия, которое д. подкрепить физическую основу для RNAP движения. Эти эксперименты подтверждают модель, согласно которой RNAP скорее движет ДНК, чем движется сама вдоль ДНК. Сходным образом E. coli replisome, мультибелковый комплекс в ~106-Da, который ответственен за репликацию ДНК, и который, как подозревалось, приводит в движение самого себя вдоль ДНК. Однако, недавно было показано с помощью иммунофлюоресцентной микроскопии, что replisome перемещается лишь на незначительное расстояние в отношении длины реплицируемой ДНК^19-21. Необходимо помнить, что replisome содержит двух типов ДНК моторы, DNA polymerase и DNA helicase. Было предположено, что т.к. синтез ДНК примерно в 10 раз быстрее, чем синтез РНК, то replisome д. быть, по крайней мере, столь же мощной, что и RNA polymerase²², которая может развивать силы в ~25 pN¹⁵. Итак, вклад двух моторов - одного для разворачивания ДНК и одного для полимеризации её - взаимосвязан. Было предположено, что дополнительным преимуществом стационарной реплисомы д.б. способность быстро разделять вновь реплицированные сестринские хроматиды²². Была также предположена стационарность репликонов у высших эукариот²³. Когда происходит сборка крупных и сложных белковых комплексов, то очевидно, что клетка предпочитает перемещать ДНК через комплекс скорее, чем перетаскивать комплекс через клеточнвую среду. 800-kD gorillas: DNA movers are large TABLE 1 сравнивает и делает контрастными свойства энзимов, которые активно переносят и упорядочивают ДНК с белками, которые обладают больше статичной и/или структурной ролью. Отметим различия в размерах между двумя классами - многие ДНК-перемещающие белки обладают общей молекулярной массой свыше миллиорна Da, тогда как более пассивные ДНК-связывающие белки, такие как транскрипционные регуляторы Fis, H-NS и BAF униформно малы. Эти пассивные ДНК-связывающие белки могут всё ещё играть роль в компакции ДНК, когда они мультимеризуются, но они, по-видимому, собираются в неупорядоченным образом^24-27. Интуитивно понятоно, что большие связывающие поверхности д. , по-видимому, создавать преимущества, когда они перемещают крупные участки ДНК. Такие поверхности могут быть обеспечены с помощью крупных субъединиц и/или комбинации многих более мелких субъединиц (см. TABLE 1). Почему перемещающие ДНК белки не только крупные, но и также часто мультимерные? Чтобы увязать относительно крупный размер даже в самых малых геномах, ДНК-движущие и ДНК-метаболизирующие энзимы д.б. быстрыми. Скорость большинства из этих энзимов медленная по сравнению с их скоростью катализа. Напр., упорядоченная сборка субъединиц replisome является время затратной по сравнению со скоростью синтеза ДНК²⁸. Мультимеризация, по-видимому, помогает превращать события, которые в ином случае д. были бы приводить к диссоциации (и нуждались бы в медленной повторной сборке) со многими паузами. Энергия связывания индисидуальных мономеров с ДНК или одного с др. низка, это делает возможной легкую ассоциацию и диссоциацию. Напротив, энергия ассоциации мультимерного комплекса д. б. значительно больше, делая её стабильной, но динамичной. Итак, в противоположность статичным ДНК-связывающим энзимам, которые м. мультимеризоваться вдоль ДНК в обоих направлениях, геометрия ассоциации ДНК-движущих белков, по-видимому, критическая для завершения синтеза ДНК, реорганизации ДНК или перемещения ДНК во времени. Многие энзимы, которые понуждают ДНК, обладают ДНК-моторной активностью и дополнительной функцией. Replicases купируют разделяющую на нити ДНК (helicase) активность с полимеризацией мононуклеотидов. Транслоказы FtsK и SpoIIIE купируют мембран-закрепляющий флексибельный линкерный регион с их translocase доменом. ДНК транслокация с помощью helicase RecBCD купирована с её нуклеазной активностью. Наконец, topoisomerases купируют разрывы и лигацию ДНК с латеральной трансляцией одиночной или двойной нити ДНК посредством тела энзима. В целом крупные размеры таких 'gorilla-like' ДНК двигателей возникают благодаря их сложной организации и являются эволюционным следствием их сфабрикованности из множественных функциональных доменов в необходимый клеточный инструмент. Avoiding equilibrium by using energy В своём классическом тексте Что есть жизнь Э. Шредингер описывает жизнь как локальное нарушение второго закона термодинамики²⁹. Клетки вынуждены предоставлять огромное количество энергии, чтобы копировать, упорядочивать и разделять ДНК. Но еще больше энергии утилизируется, чем замечает глаз. William Jencks был первым, кто понял, что энергия выполняет расширенную и сложную роль³⁰. При формулировке т.наз. Circe effect энзимов он постулировал, что сильные притягивающие силы связывания д.б. сбалансированы за счет отталкивающих сил, которые воздействуют на части субстрата, которые являются модифицированными. Так, чем более эффективна тесная ассоциация субстрата, тем свободная энергия связывания толкает субстраты в высоко дестабилизированные активные сайты условий, приводя тем самым или к дестабилизации основного состояния или к стабилизации переходного состояния³⁰. Сходным образом для энзимов, которые движут ДНК, связывание в высвобождение нуклеотидов часто является важным для завлекания энзимов в каталитически искусные состояния, такие как сам гидролиз ATФ. АТФ вносит огромный вклад не только в генерацию сил, но и также в поступательность и направленность обусловленного энзимами движения. В конечном итоге он купирует движущие вперед силы с постоянным необратимым и направленным оборотом, который помещает ДНК в соотв. место в соотв. время - обычно далеко от её топологического равновесия. Ниже мы обсудим некоторые примеры, которые осветят энергетические различия, описанные выше. Потребление энергии предопределяет обратимость реакции, но он может также влиять на баланс вступающих в реакцию (reactants) и продуктов. Энергетика движения ДНК во время распутывания особенно интересна, в частности в отношении роли ДНК топоизомераз. Topoisomerases решают все топологические проблемы, которые связаны с физической структурой двойной спирали ДНК путем внесения временных однонитчатых разрывов (посредством type I энзимов) или разрывов двойной нити (посредством type II энзимов) в ДНК и способствования тем самым прохождению ДНК через созданную брешь³¹ (FIG. 1). E. coli gyrase, напр., вносит (-) суперспирали в (+) и (-) суперскрученные спирали ДНК. Эта реакция использует инверсию DNA crossing со специфическим sign (см. BOXES 1,2)³² и она нуждается в энергии, чтобы совершать работу против вращающего момента (силы ротации) в (-) суперскрученной ДНК. Процесс гидролиза АТФ использует необратимое превращение химической энергии в энтропию. Итак, потребление АТФ не только создает энергию для реакции, но и также гарантирует её термодинамическую необратимость. ДНК моторы часто используют связывание АТФ, чтобы вызывать специфические структурные изменения в энзиме и обеспечить реакции расправления. В случае gyrase, связывание ATФ устраняет DNA crossing со специфической геометрией и гарантирует введение (скорее, чем relaxation) (-) суперспирали. Реляксация ДНК с помощью topoisomerases снижает механическое натяжение и является поэтому энергетически предпочтительной. В самом деле, все type I topoisomerases (за исключением обратной gyrase) используют топологические стрессы своих субстратов в качестве энергии, для завершения реакции реляксации³¹. Topoisomerase IV (topo IV) может преимущественно relax (+) over (-) спутанности (crossings) ДНК и является главной decatenase у E. coli. Интересно, что, topo IV нуждается в АТФ, чтобы достигать реляксации (+) суперскрученной ДНК. Почему? Энергия от АТФ необходима для достижения крупных скоординированных конформационных изменений в белок-ДНК комплексах и также для набора энзимов при подготовке к новому каталитическому циклу^33-35. Следствия потребления энергии являются также фундаментальными для реакции в системах, где энзимы нуждаются в комбинированных активностях. Недостаточно известно, что Ham Smith открыл DNA helicases. Он сделал это приняв во внимание необходимость АТФ для перемещений ДНК. Высоко-энергетические фосфатные связи deoxynucleoside triphosphates (dNTPs) необходимы для синтетических реакций, таких как полимеризация ДНК, т.к. необходима энергия для endergonic реакции образования связей. Но было удивительно, что некоторые дегративные реакции, такие как те, что с RecBCD, нуждаются в АТФ даже если ДНК деполимеризация является exergonic. Smith постулировал, что энзимы, такие как RecBCD, используют энергию АТФ, чтобы денатурировать нити ДНК перед перевариванием с помощью nuclease. Он проверил этот механизм и многие энзимы, как оказалось, денатурируют свой субстрат перед внесением ковалентных изменений³⁶. В этих случаях энергия АТФ существенна для создания конформационных изменений ДНК, которые необходимы для генерации финального продукта. Из-за пассивности ферментативного механизма ATP независимых type I topoisomerases, они только relax суперскрученную ДНК к её значению термодинамического равновесия. Напротив, АТФ-зависимые type II topoisomerases катализируют топологические изменения в ДНК, которые приводят к неравновесным распределениям топоизомераз. Напр., topo IV у прокариот и topo II у эукариот упрощают топологию ДНК, редуцируя число узелков и catenanes ниже их равновесных уровней³⁷ (см.BOX 2). Избирательные преимущества очевидны, т.к. даже одиночные catenane связки, которые остаются в конце репликации являются летальными^38,39. Сходным образом у бактерий с циркулярными хромосомами, gyrase переводит ДНК в неравновесные уровни высокой (-) суперскрученности. Эта under-winding ДНК делает ДНК компактной и облегчает также плавление нитей ДНК, которое необходимо для транскрипции и репарации. Movement via directed stochasticity В противовес интуиции ДНК-движущие энзимы часто функционируют стохастически скорее, чем детерминистически. Это действие в данный момент не всегда в согласии с общим процессом. Всё что необходимо, это безошибочное, необратимое решение, чтобы процесс достиг успеха в конце концов. Этот принцип приложим к разнообразным феноменам, которые будут обсуждены ниже. The DNA translocase FtsK illustrates such stochastic movement and its advantages. As a result of an unequal number of crossing-over events during homologous recombination, ~15% of replication cycles in E. coli produce a circular dimeric chromosome. This would be lethal, except that a pair of site-specific recombinases, XerC and XerD, resolves the dimer at specific sites near the terminus of replication called dif sites40. The dif sites can be far apart, and one role of the FtsK translocase is to bring them together at the septum, where FtsK is attached to the cell membrane. Crucially, FtsK moves DNA both forward and backward on a local scale41,42, but with an overall directionality that brings the dif sites to the septum42 (FIG. 2). How does FtsK find the dif sites? It was recently shown that the search is governed by the 5'-GNGNAGGG-3' sequence, which is known as FRS (FtsK recognition sequence) or KOPS (FtsK orienting polar sequence)^43,44. When FtsK encounters a FRS/KOPS from the 5'-3' direction, no change in the direction of DNA translocation occurs. When encountering this sequence from the opposite direction, FtsK reverses the direction of DNA translocation in ~40% of the cases43. These sequences are oppositely skewed in both halves of the E. coli genome (from the origin to the dif site) such that ~80% are oriented in a direction that will direct FtsK to the dif site. An advantage of direction-dependent recognition of FRS/KOPS is that chromosome movement will proceed correctly no matter where translocation begins. The seemingly low fidelity of translocation reversal (~40%) upon encounter of a FRS/KOPS is no accident. In fact, if the turnaround probability were 100%, then FtsK would become trapped between inverted FRS/KOPS. The theoretical turnaround probability that leads to the fastest movement to a dif site is ~30%, which is close to the observed probability⁴³. Efficient movement of the dif sites to the septum allows the resolution of the chromosome dimer by XerC and XerD recombination, the fail-safe, non-reversible conclusion that allows the directed stochasticity of FtsK translocation to work so well. Amusingly, the microscale stochasticity of movement by translocases is mirrored in their nanoscale catalytic mechanism. Translocases of the AAA+ family of ATPases are often hexamers, with the substrate positioned in the centre of the ring. ATP hydrolysis by each translocase subunit was until recently presumed to occur either sequentially around the ring or by all subunits together. Recent work with the protein translocase ClpX shows that, in fact, the monomers fire randomly and that translocation can occur with only a single active protomer⁴⁵. It is possible that this property can be extended to related DNA translocases. Another instance in which stochastic action helps large proteins move DNA around is during eukaryotic cell division. The mitotic microtubule spindle both pulls chromosomes towards its poles and pushes them towards the cell centre⁴⁶. Microtubule attachment to chromosomes at the kinetochore is mostly a result of a process of steady microtubule polymerization followed by rapid depolymerization, which is termed dynamic instability⁴⁷. Each time a microtubule repolymerizes, it extends in a slightly different direction, probing a different portion of the cell. Multiple iterations of this process consume prodigious quantities of energy, but ultimately result in the capture of every chromosome. This process is a threedimensional analogue of the one-dimensional search mechanism of FtsK, and it highlights the importance of reversibility in such processes. Similar to FtsK reversal, microtubule depolymerization is crucial for finding the kinetochore, and it provides a fail-safe conclusion that is monitored by the spindle-attachment checkpoint. DNA movement by the E. coli replisome also has stochastic aspects. Some early models for DNA replication emphasized its strict bidirectionality22. Certainly in bacteria it was thought that replication began at the same time to the left and right of the origin of replication oriC. We know now that replication initiation begins in a random fashion left or right of oriC and that the probability of initiation decreases exponentially with distance from oriC⁴⁸. As shown in FIG. 3a, replication in all organisms starts out unidirectionally until the opposite fork fires, and then becomes bidirectional until one of the forks stalls or collides with an oncoming fork. So, replication is often bidirectional, but is unidirectional at initiation and termination. Replication termination is stochastic as well, and occurs simply as a result of collision between forks. A rigidly defined bidirectionality is not just unnecessary but is counterproductive, as replication synchrony could not reasonably be maintained between forks due to fork pausing and DNA repair. So, there need not be strong selection pressure for strictly bidirectional initiation. More generally, it was thought that there was a unique sequence, the origin, that was the starting point for every round of replication in all organisms. The sequence that specifies origins of replication differs among species and is in no case deterministic. Even in tiny phage T7, more than one sequence can be the origin, and, in bacteria, mutations that inactivate oriC are readily suppressed by various mechanisms49. In higher eukaryotes, each round of replication initiates at different positions with almost no regard for sequence specificity. The result of the relaxed requirements that allow for the variable placement of origins has the advantage of not interfering with the evolution of the rest of the chromosome. Polymerase progress can be stochastic even within one replication fork. When the fork encounters DNA damage, it can be blocked from further synthesis. One mechanism of lesion bypass involves replication-fork reversal to form a 'chicken-foot' structure (FIG. 3b)50,51. Polymerization of the paired, newly synthesized strands allows for the extension of DNA synthesis past the lesion. Reversal of one replication fork therefore actually promotes DNA replication in general. The discontinuous movements of the enzymes discussed above do not share a mechanistic commonality. The ability to 'capture' molecules that have successfully arrived at a precise location following movement presumably allowed this simple and robust strategy to arise several times throughout the course of evolution. DNA movement and topology A common but unexpected feature of all DNA translocases is that motion of the DNA leads to changes in its topology. Any enzyme that moves DNA along its axis exerts a force that not only stretches but also twists DNA (that is, torque or rotational force). These effects are comparable in terms of energetic costs. Movement of DNA along its axis has been far better appreciated than that of twist because the distance DNA moves longitudinally can involve a great length of DNA, whereas the rotational movement that accompanies twist occurs within the 20-Е diameter of DNA. A second reason why twist and torque changes have been underappreciated is that until recently they were not directly measurable. Single-molecule-manipulation techniques have allowed for the direct measurement of torque and twist52, and have already led to the elucidation of the mechanochemical cycle of DNA gyrase⁵³. To consider the topological consequences of DNA movement quantitatively, we introduce the equation that was derived by White and Calugareanu (Lk = Tw + Wr), whereby the linking number (Lk) is the sum of two geometric properties, twist (Tw) and writhe (Wr), that describe independent, yet interconvertable, structural features of DNA54-56 (BOX 1). As a topological parameter, Lk can only be changed by breakage and reunion of one or both strands of DNA, and therefore any change in Tw by an enzyme that moves DNA must be balanced by an exact compensatory change in Wr. Translocases move DNA using different mechanisms and step sizes (that is, the distance translocated in one cycle of activity), but they always produce a change in twist (BOX 3). The reason is simple. The DNA is moved by the successive binding of the enzyme to some part of the DNA. An enzyme that moves by exactly tracking the DNA helix will have to rotate around the DNA once for every helical pitch, or as viewed by the enzyme, the DNA will have to be rotated as a bolt through a nut. Even when the translocase has a symmetric oligomeric structure that lets it swap DNA contacts between protomers, unavoidable mismatches between DNA pitch and enzyme geometry will introduce twist. Although these changes in twist have been previously reported (for example, for RNA polymerase I⁵⁷), they have only recently been measured directly⁵⁸. Single-moleculemanipulation techniques can now be used to measure the degree of supercoiling that is introduced per translocated distance. Using these methods, it was determined that RNA polymerase tracks the DNA helix without slippage as it moves at ~15 bp/s^58,59, and therefore introduces ~1.5 supercoils/s. By contrast, T7 DNA polymerase translocates at ~100 bp/s60. Assuming that the tracking of the DNA helix involves no slippage, T7 polymerase would induce a moderate amount of supercoiling (~10 supercoils/ s). The DNA translocase domain of FtsK has been shown to introduce only one supercoil per Ў"150 bp translocated41. However, its fast translocation (~6,000 bp/s⁴²) implies that it would induce a staggering ~40 supercoils/s in the absence of slipping. At a distance from the translocase ( >200 bp, for example), these changes in DNA twist and writhe can be swiftly removed by DNA topoisomerases, which are able to relax DNA supercoiling at ~6 supercoils/s, thereby avoiding side effects such as stalling of the replication fork. Close to the translocase, transient changes in twist and writhe might play a role in activating, inhibiting or dislocating other protein complexes that are bound to the DNA. For example, eukaryotic chromatin remodelling factors of the SWI2/SNF2 family of ATPases, such as the RSC complex61, Mot1 (REFS 62,63) or Rad54 (REF. 64), are proposed to function as ATP-driven motors that destabilize pre-existing protein CDNA complexes by transiently disrupting protein-DNA interactions. Translocation rotates the DNA and can locally and/or globally change its writhe and twist. Such changes can be beneficial or deleterious to the cell. Local changes can help to clear road blocks or remodel pre-existing proteinЁC DNA complexes. Global changes can have deadly consequences (such as replication-fork stalling) if topological stress is not reduced by topoisomerases. Concluding remarks Белки, которые движут ДНК, обладают многими общими признаками, которые объясняют ряд их свойств. Наши ранние восприятия о движениях ДНК были слишком упрощены или неверны. Мы нашли примеры, где ДНК перемещается через энзимы, которые оперируют на ней. Наиболее странным оказалось, что эти энзимы позволяют дуплексной ДНК буквально проскальзывать или нарезаться (slice) через них во время транспортировки. Двигатели ДНК оказались большими, что, по-видимому, обусловлено комбинацией трех факторов. Мы отметили, что белок-ДНК интерфейс наиболее подходящий, если большой; что эти белки часто нуждаются в сборке на или окружают ДНК и тем самым мультимеризуются; и что большинство обладает множественными ферментативными функциями слитыми в один большой энзим. ДНК-движущие энзимы используют АТФ для многих разнообразных, иногда не очевидных, причин. Эта энергия используется для транспорта огромных длин ДНК несмотря на бремя, которое включает связанные белки или РНК. Однако, для изоэнергетических реакций, которые включают большинство из реакций по прохождению ДНК, и которые осуществляются type II topoisomerases и для exonuclease активности RecBCD, роль АТФ может быть незначительна. Мы увидели, что двигетели ДНК реализуют ряд преимуществ благодаря действию стохастическим образом. Очевидно, что FtsK translocase может двигать в любом направлении за счет АТФ, но она использует генетический barcode, чтобы двигать ДНК в правильном направлении. Мы проверяли, как движущаяся ДНК приводит к изменениям в топологии ДНК. Крутящий момент (torque) неизбежно вносится с помощью translocases, когда её охват не совпадает со спиральной резьбой ДНК. Действие topoisomerases необходимо для восстановления исходной топологии. Мы проводим параллели между некоторыми пленительными белками, которые движут ДНК, и и в результате возникают некоторые важные безответные вопросы. В достижении геномной организации происходила ли координация между гигантами? Мы знаем, напр., что время репликации тонко контролируется^65,66. У B. subtilis было показано. что биохимическая сеть, которая состоит из, по крайней мере, Spo0J, Soj и Spo0A, ответственна opf координацию репликации ДНК, разделения хромосом и споруляцию^67-69. Существует ли сходная сеть для регуляции топологии ДНК или хромосомное суперскручивание просто нетто результат ансамблю действия топоизомераз? Генерирует ли gyrase непрерывно (-) суперспирали только, чтобы они удалялись с помощью topo I, или существует энергетически более приемлемое решение? ДНК-движущие энзимы тянут, толкают, сворачивают и разворачивают чрезвычайно длинную молекулу в очень тесном и сравнительно небольшом объеме. Судьба клетки зависит от тонкой временной и пространственной координации среди ДНК двигателей. Мы знаем очень мало о деталях временной координации в основном из-за трудностей наблюдения за перемещением в реальном времени. Некоторые появляющиеся технологии возможно приведут нас к лучшему пониманию деталей помещения ДНК на её место. Технологии такие, как imaging одиночных молекул в живых клетках в комбинации с FRET-based interaction анализм, дают нам беспрецендентный взгляд на процессы внутри клетки^70-72. Такого типа способности, приложенные к движению ДНК и движению белков по ДНК, дадут ответ на основные, но важнейшие вопросы.

Информационное содержимое в данной длины ДНК ограничено простотой четверичного генетического кода. Соответственно, калька нуклеиновых кислот даже у простейшего организма значительно выше длины, чем сам организм. Проблема ДНК упаковки прекрасно оценена^1,2. Столь же важной является цель перемещения ДНК во время репликации и репарации, во время процесса упрощения ДНК топологии и во время сегрегации хромосом. Здесь обсуждаются высоко специализированные белки, которые движут ДНК, часто в определенном направлении со значительной скоростью и аккуратностью. Сюда входят DNA replicases, helicases, translocases, topo isomerases и recombinases. Рост геномов происходил наравне с увеличением клеточной сложности и был связан с управлением эволюции белков, обсуждаемых в данном обзоре. Напр., потребность в type II topoisomerases, которая разделяет и снова соединяет дуплексы ДНК, чтобы позволить др. пройти^3,4, необходима для для быстрого разрешения топологической запутанности крупных хромосом.

Рассмотрим 4 движения относительно оси двойной спирали ДНК: ротацию вокруг оси, трансляцию вдоль оси, трансляцию латеральнее оси и разделение нитей ДНК. Ротация скручивает спираль ДНК и ведет к избыточному или недостаточному закручиванию. DNA translocases движутся вдоль оси ДНК. Боковые движения необходимы, чтобы выравнивать в линию ДНК и способствовать гомологичной рекомбинации и осуществляются за счет type II topoisomerases, действия которых позволяют расходиться хромосомам несмотря на индуцируемую репликацией запутанность вновь синтезируемых хромосом. Наконец, полная конверсия двунитчатой ДНК в однонитчатую ДНК необходима для дупликации любого генома, что обеспечивается replicative helicases.

The theory of non-relativity: DNA moves

Белок. который перемещается по молекуле ДНК может также рассматриваться как движетель ДНК. До недавнего времени считалось, что энзимы мигрируют продольно на десятки тысяч пар оснований (bp) вдоль ДНК, которая в основном стационарна. Напр., едавнее timelapse флюоресцентно-микроскопическое исследование показало, что белок DisA (или белок в комплексе с ним), который участвует у Bacillus subtilis в реакции на повреждения ДНК, является неспецифическим ДНК-связывающим белком, который формирует одиночный фокус in vivo и, , по-видимому, быстро сканирует хромосому, останавливаясь в местах повреждений ДНК⁵. Др. энзимы, как было предположено, используют сходный механизм для сканирования матрицы ДНК⁶.

Неожиданно в некоторых др. случаях белковые комплексы не перемещаются по ДНК, а скорее ДНК движется через них. В этих случаях белки, которые перемещают ДНК могут рассматриваться скорее как насосы ДНК скорее, чем ДНК-направляющие энзимы. Это различие имеет значение для механизмов их действия.

В зависимости от того, что движется, последствия могут быть драматически отличными. Напр,. относящаяся к делу референсная рамка в клеточной биологии является клеткой. Создание новой клеточной границы является фундаментальным и бесповоротным актом клеточного деления. Движение ДНК внутри клетки регулируется и д.б. аккуратным в отношении этого события. Крупные ДНК моторы, как было показано, закреплены на клеточной мембране, как в случае прокариотических ДНК транслоказ FtsK и SpoIIIE7-13. Такое закрепление фиксирует их позицию относительно клеточной границы и гарантирует, что ДНК будет двигаться относительно их. Эти процессы используют быструю и направленную транслокацию большого количества ДНК (~106 bp у Escherichia coli) на большое расстояние, а перемещения белковых комплексов, которые незначительные по сравнению со смещением ДНК. SpoIIIE является такой транслоказой. Её роль заключается в упаковке ДНК в предспору во время споруляции B. subtilis. SpoIIIE, как было показано, формирует стационарные фокусы на перегородке споруляции in vivo и прокачивает ДНК из материнской клетки в предспору¹⁴.

RNA polymerase (RNAP), как было показано, перемещает ДНК, если фиксирована на твердой поверхности¹⁵. Чтобы двигать ДНК in vivo, RNAP д. быть стационарной и эта возможность подтверждена^16,17. Результаты экспериментов, базирующихся на ингибировании транскрипции у B. subtilis согласуются с неподвижностью RNAP¹⁸. Недавно актин-подобный цитоскелетный белок (MreB), как было установлено, взаимодействует с RNAP in vivo и in vitro, это открывает возможность взаимодействия, которое д. подкрепить физическую основу для RNAP движения. Эти эксперименты подтверждают модель, согласно которой RNAP скорее движет ДНК, чем движется сама вдоль ДНК.

Сходным образом E. coli replisome, мультибелковый комплекс в ~106-Da, который ответственен за репликацию ДНК, и который, как подозревалось, приводит в движение самого себя вдоль ДНК. Однако, недавно было показано с помощью иммунофлюоресцентной микроскопии, что replisome перемещается лишь на незначительное расстояние в отношении длины реплицируемой ДНК^19-21. Необходимо помнить, что replisome содержит двух типов ДНК моторы, DNA polymerase и DNA helicase. Было предположено, что т.к. синтез ДНК примерно в 10 раз быстрее, чем синтез РНК, то replisome д. быть, по крайней мере, столь же мощной, что и RNA polymerase²², которая может развивать силы в ~25 pN¹⁵. Итак, вклад двух моторов - одного для разворачивания ДНК и одного для полимеризации её - взаимосвязан. Было предположено, что дополнительным преимуществом стационарной реплисомы д.б. способность быстро разделять вновь реплицированные сестринские хроматиды²². Была также предположена стационарность репликонов у высших эукариот²³. Когда происходит сборка крупных и сложных белковых комплексов, то очевидно, что клетка предпочитает перемещать ДНК через комплекс скорее, чем перетаскивать комплекс через клеточнвую среду.

800-kD gorillas: DNA movers are large

TABLE 1 сравнивает и делает контрастными свойства энзимов, которые активно переносят и упорядочивают ДНК с белками, которые обладают больше статичной и/или структурной ролью. Отметим различия в размерах между двумя классами - многие ДНК-перемещающие белки обладают общей молекулярной массой свыше миллиорна Da, тогда как более пассивные ДНК-связывающие белки, такие как транскрипционные регуляторы Fis, H-NS и BAF униформно малы. Эти пассивные ДНК-связывающие белки могут всё ещё играть роль в компакции ДНК, когда они мультимеризуются, но они, по-видимому, собираются в неупорядоченным образом^24-27.

Интуитивно понятоно, что большие связывающие поверхности д. , по-видимому, создавать преимущества, когда они перемещают крупные участки ДНК. Такие поверхности могут быть обеспечены с помощью крупных субъединиц и/или комбинации многих более мелких субъединиц (см. TABLE 1).

Почему перемещающие ДНК белки не только крупные, но и также часто мультимерные? Чтобы увязать относительно крупный размер даже в самых малых геномах, ДНК-движущие и ДНК-метаболизирующие энзимы д.б. быстрыми. Скорость большинства из этих энзимов медленная по сравнению с их скоростью катализа. Напр., упорядоченная сборка субъединиц replisome является время затратной по сравнению со скоростью синтеза ДНК²⁸. Мультимеризация, по-видимому, помогает превращать события, которые в ином случае д. были бы приводить к диссоциации (и нуждались бы в медленной повторной сборке) со многими паузами. Энергия связывания индисидуальных мономеров с ДНК или одного с др. низка, это делает возможной легкую ассоциацию и диссоциацию. Напротив, энергия ассоциации мультимерного комплекса д. б. значительно больше, делая её стабильной, но динамичной. Итак, в противоположность статичным ДНК-связывающим энзимам, которые м. мультимеризоваться вдоль ДНК в обоих направлениях, геометрия ассоциации ДНК-движущих белков, по-видимому, критическая для завершения синтеза ДНК, реорганизации ДНК или перемещения ДНК во времени.

Многие энзимы, которые понуждают ДНК, обладают ДНК-моторной активностью и дополнительной функцией. Replicases купируют разделяющую на нити ДНК (helicase) активность с полимеризацией мононуклеотидов. Транслоказы FtsK и SpoIIIE купируют мембран-закрепляющий флексибельный линкерный регион с их translocase доменом. ДНК транслокация с помощью helicase RecBCD купирована с её нуклеазной активностью. Наконец, topoisomerases купируют разрывы и лигацию ДНК с латеральной трансляцией одиночной или двойной нити ДНК посредством тела энзима. В целом крупные размеры таких 'gorilla-like' ДНК двигателей возникают благодаря их сложной организации и являются эволюционным следствием их сфабрикованности из множественных функциональных доменов в необходимый клеточный инструмент.

Avoiding equilibrium by using energy

В своём классическом тексте Что есть жизнь Э. Шредингер описывает жизнь как локальное нарушение второго закона термодинамики²⁹. Клетки вынуждены предоставлять огромное количество энергии, чтобы копировать, упорядочивать и разделять ДНК. Но еще больше энергии утилизируется, чем замечает глаз. William Jencks был первым, кто понял, что энергия выполняет расширенную и сложную роль³⁰. При формулировке т.наз. Circe effect энзимов он постулировал, что сильные притягивающие силы связывания д.б. сбалансированы за счет отталкивающих сил, которые воздействуют на части субстрата, которые являются модифицированными. Так, чем более эффективна тесная ассоциация субстрата, тем свободная энергия связывания толкает субстраты в высоко дестабилизированные активные сайты условий, приводя тем самым или к дестабилизации основного состояния или к стабилизации переходного состояния³⁰.

Сходным образом для энзимов, которые движут ДНК, связывание в высвобождение нуклеотидов часто является важным для завлекания энзимов в каталитически искусные состояния, такие как сам гидролиз ATФ. АТФ вносит огромный вклад не только в генерацию сил, но и также в поступательность и направленность обусловленного энзимами движения. В конечном итоге он купирует движущие вперед силы с постоянным необратимым и направленным оборотом, который помещает ДНК в соотв. место в соотв. время - обычно далеко от её топологического равновесия. Ниже мы обсудим некоторые примеры, которые осветят энергетические различия, описанные выше.

Потребление энергии предопределяет обратимость реакции, но он может также влиять на баланс вступающих в реакцию (reactants) и продуктов. Энергетика движения ДНК во время распутывания особенно интересна, в частности в отношении роли ДНК топоизомераз. Topoisomerases решают все топологические проблемы, которые связаны с физической структурой двойной спирали ДНК путем внесения временных однонитчатых разрывов (посредством type I энзимов) или разрывов двойной нити (посредством type II энзимов) в ДНК и способствования тем самым прохождению ДНК через созданную брешь³¹ (FIG. 1). E. coli gyrase, напр., вносит (-) суперспирали в (+) и (-) суперскрученные спирали ДНК. Эта реакция использует инверсию DNA crossing со специфическим sign (см. BOXES 1,2)³² и она нуждается в энергии, чтобы совершать работу против вращающего момента (силы ротации) в (-) суперскрученной ДНК. Процесс гидролиза АТФ использует необратимое превращение химической энергии в энтропию. Итак, потребление АТФ не только создает энергию для реакции, но и также гарантирует её термодинамическую необратимость. ДНК моторы часто используют связывание АТФ, чтобы вызывать специфические структурные изменения в энзиме и обеспечить реакции расправления. В случае gyrase, связывание ATФ устраняет DNA crossing со специфической геометрией и гарантирует введение (скорее, чем relaxation) (-) суперспирали. Реляксация ДНК с помощью topoisomerases снижает механическое натяжение и является поэтому энергетически предпочтительной. В самом деле, все type I topoisomerases (за исключением обратной gyrase) используют топологические стрессы своих субстратов в качестве энергии, для завершения реакции реляксации³¹.

Topoisomerase IV (topo IV) может преимущественно relax (+) over (-) спутанности (crossings) ДНК и является главной decatenase у E. coli. Интересно, что, topo IV нуждается в АТФ, чтобы достигать реляксации (+) суперскрученной ДНК. Почему? Энергия от АТФ необходима для достижения крупных скоординированных конформационных изменений в белок-ДНК комплексах и также для набора энзимов при подготовке к новому каталитическому циклу^33-35. Следствия потребления энергии являются также фундаментальными для реакции в системах, где энзимы нуждаются в комбинированных активностях. Недостаточно известно, что Ham Smith открыл DNA helicases. Он сделал это приняв во внимание необходимость АТФ для перемещений ДНК. Высоко-энергетические фосфатные связи deoxynucleoside triphosphates (dNTPs) необходимы для синтетических реакций, таких как полимеризация ДНК, т.к. необходима энергия для endergonic реакции образования связей. Но было удивительно, что некоторые дегративные реакции, такие как те, что с RecBCD, нуждаются в АТФ даже если ДНК деполимеризация является exergonic. Smith постулировал, что энзимы, такие как RecBCD, используют энергию АТФ, чтобы денатурировать нити ДНК перед перевариванием с помощью nuclease. Он проверил этот механизм и многие энзимы, как оказалось, денатурируют свой субстрат перед внесением ковалентных изменений³⁶. В этих случаях энергия АТФ существенна для создания конформационных изменений ДНК, которые необходимы для генерации финального продукта. Из-за пассивности ферментативного механизма ATP независимых type I topoisomerases, они только relax суперскрученную ДНК к её значению термодинамического равновесия. Напротив, АТФ-зависимые type II topoisomerases катализируют топологические изменения в ДНК, которые приводят к неравновесным распределениям топоизомераз. Напр., topo IV у прокариот и topo II у эукариот упрощают топологию ДНК, редуцируя число узелков и catenanes ниже их равновесных уровней³⁷ (см.BOX 2). Избирательные преимущества очевидны, т.к. даже одиночные catenane связки, которые остаются в конце репликации являются летальными^38,39. Сходным образом у бактерий с циркулярными хромосомами, gyrase переводит ДНК в неравновесные уровни высокой (-) суперскрученности. Эта under-winding ДНК делает ДНК компактной и облегчает также плавление нитей ДНК, которое необходимо для транскрипции и репарации.

Movement via directed stochasticity

В противовес интуиции ДНК-движущие энзимы часто функционируют стохастически скорее, чем детерминистически. Это действие в данный момент не всегда в согласии с общим процессом. Всё что необходимо, это безошибочное, необратимое решение, чтобы процесс достиг успеха в конце концов. Этот принцип приложим к разнообразным феноменам, которые будут обсуждены ниже.

The DNA translocase FtsK illustrates such stochastic movement and its advantages. As a result of an unequal number of crossing-over events during homologous recombination, ~15% of replication cycles in E. coli produce a circular dimeric chromosome. This would be lethal, except that a pair of site-specific recombinases, XerC and XerD, resolves the dimer at specific sites near the terminus of replication called dif sites40. The dif sites can be far apart, and one role of the FtsK translocase is to bring them together at the septum, where FtsK is attached to the cell membrane. Crucially, FtsK moves DNA both forward and backward on a local scale41,42, but with an overall directionality that brings the dif sites to the septum42 (FIG. 2). How does FtsK find the dif sites? It was recently shown that the search is governed by the 5'-GNGNAGGG-3' sequence, which is known as FRS (FtsK recognition sequence) or KOPS (FtsK orienting polar sequence)^43,44. When FtsK encounters a FRS/KOPS from the 5'-3' direction, no change in the direction of DNA translocation occurs. When encountering this sequence from the opposite direction, FtsK reverses the direction of DNA translocation in ~40% of the cases43. These sequences are oppositely skewed in both halves of the E. coli genome (from the origin to the dif site) such that ~80% are oriented in a direction that will direct FtsK to the dif site. An advantage of direction-dependent recognition of FRS/KOPS is that chromosome movement will proceed correctly no matter where translocation begins. The seemingly low fidelity of translocation reversal (~40%) upon encounter of a FRS/KOPS is no accident. In fact, if the turnaround probability were 100%, then FtsK would become trapped between inverted FRS/KOPS. The theoretical turnaround probability that leads to the fastest movement to a dif site is ~30%, which is close to the observed probability⁴³. Efficient movement of the dif sites to the septum allows the resolution of the chromosome dimer by XerC and XerD recombination, the fail-safe, non-reversible conclusion that allows the directed stochasticity of FtsK translocation to work so well.

Amusingly, the microscale stochasticity of movement by translocases is mirrored in their nanoscale catalytic mechanism. Translocases of the AAA+ family of ATPases are often hexamers, with the substrate positioned in the centre of the ring. ATP hydrolysis by each translocase subunit was until recently presumed to occur either sequentially around the ring or by all subunits together. Recent work with the protein translocase ClpX shows that, in fact, the monomers fire randomly and that translocation can occur with only a single active protomer⁴⁵. It is possible that this property can be extended to related DNA translocases.

Another instance in which stochastic action helps large proteins move DNA around is during eukaryotic cell division. The mitotic microtubule spindle both pulls chromosomes towards its poles and pushes them towards the cell centre⁴⁶. Microtubule attachment to chromosomes at the kinetochore is mostly a result of a process of steady microtubule polymerization followed by rapid depolymerization, which is termed dynamic instability⁴⁷. Each time a microtubule repolymerizes, it extends in a slightly different direction, probing a different portion of the cell. Multiple iterations of this process consume prodigious quantities of energy, but ultimately result in the capture of every chromosome. This process is a threedimensional analogue of the one-dimensional search mechanism of FtsK, and it highlights the importance of reversibility in such processes. Similar to FtsK reversal, microtubule depolymerization is crucial for finding the kinetochore, and it provides a fail-safe conclusion that is monitored by the spindle-attachment checkpoint. DNA movement by the E. coli replisome also has stochastic aspects. Some early models for DNA replication emphasized its strict bidirectionality22. Certainly in bacteria it was thought that replication began at the same time to the left and right of the origin of replication oriC. We know now that replication initiation begins in a random fashion left or right of oriC and that the probability of initiation decreases exponentially with distance from oriC⁴⁸. As shown in FIG. 3a, replication in all organisms starts out unidirectionally until the opposite fork fires, and then becomes bidirectional until one of the forks stalls or collides with an oncoming fork. So, replication is often bidirectional, but is unidirectional at initiation and termination. Replication termination is stochastic as well, and occurs simply as a result of collision between forks. A rigidly defined bidirectionality is not just unnecessary but is counterproductive, as replication synchrony could not reasonably be maintained between forks due to fork pausing and DNA repair. So, there need not be strong selection pressure for strictly bidirectional initiation. More generally, it was thought that there was a unique sequence, the origin, that was the starting point for every round of replication in all organisms. The sequence that specifies origins of replication differs among species and is in no case deterministic. Even in tiny phage T7, more than one sequence can be the origin, and, in bacteria, mutations that inactivate oriC are readily suppressed by various mechanisms49. In higher eukaryotes, each round of replication initiates at different positions with almost no regard for sequence specificity. The result of the relaxed requirements that allow for the variable placement of origins has the advantage of not interfering with the evolution of the rest of the chromosome.

Polymerase progress can be stochastic even within one replication fork. When the fork encounters DNA damage, it can be blocked from further synthesis. One mechanism of lesion bypass involves replication-fork reversal to form a 'chicken-foot' structure (FIG. 3b)50,51. Polymerization of the paired, newly synthesized strands allows for the extension of DNA synthesis past the lesion. Reversal of one replication fork therefore actually promotes DNA replication in general.

The discontinuous movements of the enzymes discussed above do not share a mechanistic commonality. The ability to 'capture' molecules that have successfully arrived at a precise location following movement presumably allowed this simple and robust strategy to arise several times throughout the course of evolution.

DNA movement and topology

A common but unexpected feature of all DNA translocases is that motion of the DNA leads to changes in its topology. Any enzyme that moves DNA along its axis exerts a force that not only stretches but also twists DNA (that is, torque or rotational force). These effects are comparable in terms of energetic costs. Movement of DNA along its axis has been far better appreciated than that of twist because the distance DNA moves longitudinally can involve a great length of DNA, whereas the rotational movement that accompanies twist occurs within the 20-Е diameter of DNA. A second reason why twist and torque changes have been underappreciated is that until recently they were not directly measurable. Single-molecule-manipulation techniques have allowed for the direct measurement of torque and twist52, and have already led to the elucidation of the mechanochemical cycle of DNA gyrase⁵³.

To consider the topological consequences of DNA movement quantitatively, we introduce the equation that was derived by White and Calugareanu (Lk = Tw + Wr), whereby the linking number (Lk) is the sum of two geometric properties, twist (Tw) and writhe (Wr), that describe independent, yet interconvertable, structural features of DNA54-56 (BOX 1). As a topological parameter, Lk can only be changed by breakage and reunion of one or both strands of DNA, and therefore any change in Tw by an enzyme that moves DNA must be balanced by an exact compensatory change in Wr.

Translocases move DNA using different mechanisms and step sizes (that is, the distance translocated in one cycle of activity), but they always produce a change in twist (BOX 3). The reason is simple. The DNA is moved by the successive binding of the enzyme to some part of the DNA. An enzyme that moves by exactly tracking the DNA helix will have to rotate around the DNA once for every helical pitch, or as viewed by the enzyme, the DNA will have to be rotated as a bolt through a nut. Even when the translocase has a symmetric oligomeric structure that lets it swap DNA contacts between protomers, unavoidable mismatches between DNA pitch and enzyme geometry will introduce twist.

Although these changes in twist have been previously reported (for example, for RNA polymerase I⁵⁷), they have only recently been measured directly⁵⁸. Single-moleculemanipulation techniques can now be used to measure the degree of supercoiling that is introduced per translocated distance. Using these methods, it was determined that RNA polymerase tracks the DNA helix without slippage as it moves at ~15 bp/s^58,59, and therefore introduces ~1.5 supercoils/s. By contrast, T7 DNA polymerase translocates at ~100 bp/s60. Assuming that the tracking of the DNA helix involves no slippage, T7 polymerase would induce a moderate amount of supercoiling (~10 supercoils/ s). The DNA translocase domain of FtsK has been shown to introduce only one supercoil per Ў"150 bp translocated41. However, its fast translocation (~6,000 bp/s⁴²) implies that it would induce a staggering ~40 supercoils/s in the absence of slipping. At a distance from the translocase ( >200 bp, for example), these changes in DNA twist and writhe can be swiftly removed by DNA topoisomerases, which are able to relax DNA supercoiling at ~6 supercoils/s, thereby avoiding side effects such as stalling of the replication fork.

Close to the translocase, transient changes in twist and writhe might play a role in activating, inhibiting or dislocating other protein complexes that are bound to the DNA. For example, eukaryotic chromatin remodelling factors of the SWI2/SNF2 family of ATPases, such as the RSC complex61, Mot1 (REFS 62,63) or Rad54 (REF. 64), are proposed to function as ATP-driven motors that destabilize pre-existing protein CDNA complexes by transiently disrupting protein-DNA interactions.

Translocation rotates the DNA and can locally and/or globally change its writhe and twist. Such changes can be beneficial or deleterious to the cell. Local changes can help to clear road blocks or remodel pre-existing proteinЁC DNA complexes. Global changes can have deadly consequences (such as replication-fork stalling) if topological stress is not reduced by topoisomerases.

Concluding remarks

Белки, которые движут ДНК, обладают многими общими признаками, которые объясняют ряд их свойств. Наши ранние восприятия о движениях ДНК были слишком упрощены или неверны. Мы нашли примеры, где ДНК перемещается через энзимы, которые оперируют на ней. Наиболее странным оказалось, что эти энзимы позволяют дуплексной ДНК буквально проскальзывать или нарезаться (slice) через них во время транспортировки.

Двигатели ДНК оказались большими, что, по-видимому, обусловлено комбинацией трех факторов. Мы отметили, что белок-ДНК интерфейс наиболее подходящий, если большой; что эти белки часто нуждаются в сборке на или окружают ДНК и тем самым мультимеризуются; и что большинство обладает множественными ферментативными функциями слитыми в один большой энзим.

ДНК-движущие энзимы используют АТФ для многих разнообразных, иногда не очевидных, причин. Эта энергия используется для транспорта огромных длин ДНК несмотря на бремя, которое включает связанные белки или РНК. Однако, для изоэнергетических реакций, которые включают большинство из реакций по прохождению ДНК, и которые осуществляются type II topoisomerases и для exonuclease активности RecBCD, роль АТФ может быть незначительна.

Мы увидели, что двигетели ДНК реализуют ряд преимуществ благодаря действию стохастическим образом. Очевидно, что FtsK translocase может двигать в любом направлении за счет АТФ, но она использует генетический barcode, чтобы двигать ДНК в правильном направлении.

Мы проверяли, как движущаяся ДНК приводит к изменениям в топологии ДНК. Крутящий момент (torque) неизбежно вносится с помощью translocases, когда её охват не совпадает со спиральной резьбой ДНК. Действие topoisomerases необходимо для восстановления исходной топологии.

Мы проводим параллели между некоторыми пленительными белками, которые движут ДНК, и и в результате возникают некоторые важные безответные вопросы. В достижении геномной организации происходила ли координация между гигантами? Мы знаем, напр., что время репликации тонко контролируется^65,66. У B. subtilis было показано. что биохимическая сеть, которая состоит из, по крайней мере, Spo0J, Soj и Spo0A, ответственна opf координацию репликации ДНК, разделения хромосом и споруляцию^67-69. Существует ли сходная сеть для регуляции топологии ДНК или хромосомное суперскручивание просто нетто результат ансамблю действия топоизомераз? Генерирует ли gyrase непрерывно (-) суперспирали только, чтобы они удалялись с помощью topo I, или существует энергетически более приемлемое решение? ДНК-движущие энзимы тянут, толкают, сворачивают и разворачивают чрезвычайно длинную молекулу в очень тесном и сравнительно небольшом объеме. Судьба клетки зависит от тонкой временной и пространственной координации среди ДНК двигателей. Мы знаем очень мало о деталях временной координации в основном из-за трудностей наблюдения за перемещением в реальном времени. Некоторые появляющиеся технологии возможно приведут нас к лучшему пониманию деталей помещения ДНК на её место. Технологии такие, как imaging одиночных молекул в живых клетках в комбинации с FRET-based interaction анализм, дают нам беспрецендентный взгляд на процессы внутри клетки^70-72. Такого типа способности, приложенные к движению ДНК и движению белков по ДНК, дадут ответ на основные, но важнейшие вопросы.

Giant proteins that move DNA: bullies of the genomic playgroundNicholas R. Cozzarelli*, Gregory J. Cost, Marcelo Nollmann, Thierry Viard and James E. StrayNATURE REVIEWS | MOLECULAR CELL BIOLOGY VOLUME 7 | AUGUST 2006 | 581 doi:10.1038/nrm1982

Giant proteins that move DNA: bullies of the genomic playground
**Nicholas R. Cozzarelli*, Gregory J. Cost, Marcelo Nollmann, Thierry Viard and James E. Stray**
NATURE REVIEWS | MOLECULAR CELL BIOLOGY VOLUME 7 | AUGUST 2006 | 581 doi:10.1038/nrm1982