Посещений:
Метилирование Лизинов Гистонов

Функции
THE DIVERSE FUNCTIONS OF HISTONE LYSINE METHYLATION
Cyrus Martin, Yi Zhang
Nature Reviews Molecular Cell Biology 6, No 11, 838-849 (2005); doi:10.1038/nrm1761
Covalent modifications of histone tails have fundamental roles in chromatin structure and function. One such modification, lysine methylation, has important functions in many biological processes that include heterochromatin formation, X-chromosome inactivation and transcriptional regulation. Here, we summarize recent advances in our understanding of how lysine methylation functions in these diverse biological processes, and raise questions that need to be addressed in the future.


Рис.1.
 | Histone lysine methyltransferases, their target sites and methyl-lysine binding domains.


Рис.2.
 | Heterochromatin formation and RNA interference.


Рис.3.
 | H3-K27 methylation in Polycomb silencing and X inactivation.


Рис.4.
 | Histone lysine methylation and transcription.

Boxes


Box 1.
 | Function of H3-K9 methylation and Swi6 in mating-type switching

Box 2 | H4-K20 methylation: roles in cell cycle and DNA repair

The histone methyltransferase SET8/PR-Set7 catalyses the monomethylation of H4-K20 (Refs 122-124). As part of the initial characterization of this enzyme, it was noted that both the levels of SET8/PR-Set7 and H4-K20 methylation fluctuate during the cell cycle. This observation indicates that SET8/PR-Set7 might be involved in some aspect of cell-cycle control. Indeed, loss of function of the Drosophila melanogaster homologue leads to cell-cycle arrest125. In addition, a recent study of the cell-cycle regulator HCF-1 (herpes simplex virus host-cell factor-1) showed that the C-terminal subunit of this protein represses SET8/PR-Set7 expression during mitosis126. Furthermore, small interfering RNA (siRNA)-mediated knockdown of the C-terminal subunit of HCF-1 leads to increased expression of SET8/PR-Set7 concomitant with chromosome segregation defects. Collectively, these findings indicate that progression through the cell cycle requires tight regulation of SET8/PR-Set7 and H4-K20 methylation.
In addition to the maintenance of heterochromatin and cell-cycle control, H4-K20 methylation has been linked to DNA repair. This finding is the result of studies in fission yeast aimed at understanding the function of the H4-K20 methylation. Surprisingly, deletion of SET9 — the enzyme responsible for H4-K20 methylation in this organism — does not result in defective heterochromatin formation as assayed by centromeric silencing22. Instead, a sensitivity to DNA double-strand breaks induced by ionizing radiation is observed. This phenotype seems to be caused by a failure to recruit Crb2, which is required for appropriate responses, to double-strand breaks. Interestingly, the mammalian homologue of Crb2, 53BP1, contains two tudor domains that mediate specific interactions with methyl-H3-K79 (Ref. 21). This observation indicates that Crb2 might be recruited to methyl-H4-K20 through a similar interaction.

Box 3 | H3-K9 methylation and DNA methylation

In addition to the link between H3-K9 methylation and heterochromatin formation, H3-K9 methylation has been connected to DNA methylation, another type of epigenetic modification that is involved in gene silencing. The methylation of cytosine bases in DNA occurs to varying degrees in a wide range of organisms, ranging from plants to mammals127. Gene silencing that is mediated by DNA methylation is known to have important roles in many biological processes, including genomic imprinting and X inactivation. Interestingly, genetic studies have shown in a number of organisms that H3-K9 methylation is a prerequisite for DNA methylation128-130. The obvious question that these experiments raise concerns the nature of the link between the two modifications. Consistent with the possibility that HP1 might recruit DNA methyltransferases through protein–protein interactions130, HP1 is essential for DNA methylation in Neurospora crassa131. Alternatively, in some systems the DNA methyltransferases themselves seem to be directly recruited to loci of H3-K9 methylation and its associated modifications28.

Although these results indicate that histone methylation controls DNA methylation, this relationship seems to be reversed in some instances. For example, it was observed that H3-K9 methylation is drastically reduced at a tumour suppressor gene in cells that were deficient in DNA methyltransferases132. So, in this case, H3-K9 methylation seems to require DNA methylation. The connection between histone and DNA methylation gained further support by research on the function of MBD1, which is a protein that specifically binds to methylated DNA sequences133. MBD1 was found to be associated with the H3-K9 methyltransferase SETDB1, which is the human homologue of mouse ESET (Рис. 1). In addition to SETDB1, MDB1 interacts with CAF1, which is responsible for depositing histones onto newly replicated DNA. On the basis of several experiments, it was proposed that methylated DNA is a signal that directs the methylation of H3-K9 during DNA replication, resulting in the silencing of gene expression.

Links

DATABASES

Swiss-Prot: Chd1 | Chp1 | Crl4 | Dot1 | ESC | E(Z) | EZH2 | G9a | HP1 | LSD1 | SET1 | SUV39H1 | SUZ12 | Swi6 | WDR5

FURTHER INFORMATION
Yi Zhang's laboratory

ДНК в клетках существует в виде хроматина. Основными строительными блоками хроматина являются нуклеосомы, структуры, состоящие из октамеров из 4-х стержневых гистоновых белков, вокруг которых накручено 147 п.н. ДНК1. Гистоновые белки (H2A, H2B, H3 и H4) каждый состоит из глобулярного домена и не структуированного концевого домена. Главным свойством стержневых гистонов является то, что они являются предметом большого количества ковалентных модификаций, включая ацетилирование, метилирование, фосфорилирование и убиквитилирование2. Метилирование гистонов происходит по аргинину и лизину и катализируется энзимами, принадлежащими к трем самостоятельным семействам белков - семейству PRMT1, семейству SET-DOMAIN-содержащих белков и non-SET-доменовых белков DOT1/DOT1L3-6. Здесь будет рассмотрено значение метилирование лизина (rev. 6-8).
Метилирование лизинов гистона происходит в гистонах H3 и H4. 6 лизиновых остатков, содержащихся в этих двух гистонах, являются местами метилирования (Рис. 1a). Каждая из этих лизиновых боковых цепочек может быть mono-, di- или trimethylated. В отличие от ацетилирования, которое в основном коррелирует с активацией транскрипции, метилирование гистоновых лизинов может служить сигналом или активации или репрессии в зависимости места метилирования6. Для определенных процессов, таких как X INACTIVATION, метилирование в одном и том же сайте может приводить к разным исходам в заисимости от количества добавленных метильных групп. Идентифицировано несколько энзимов, которые катализируют сайит-специфическое метилирование лизинов гистонов (Рис. 1a). Их характеристика выявила важные функции метилирования гистонов и во многих жр. биологических процессах от формирования гетерохроматина до регуляции транскрипции.


Histone methylation and the 'histone code'


В своей расправленной форме хроматин выглядит как ряд из нуклеосом, но в ядре, хроматиновые волокна, которые формируют хромосому, подвергаются нескольким уровням укладки (folding), в результате чего возрастает степень конденсации9. Известно, что гистоновые концы играют важную роль в процессе такой укладки10. Учитывая это и тот факт, что метилирование гистонов происходит преимущественно в гистоновых хвостах, разумно предположить, что метилирование может регулировать структуру хроматина, влияя непосредственно на укладку высшего порядка волокон хроматина. Это может иметь важное значение для chromatin-templated процессов, таких как транскрипция и репарация ДНК, это указывает на то, что упаковка меняет доступность ДНК для белков, которые обеспечивают эти процессы. Хотя нет доказательств, что метилирование лизина непосредственно затрагивает динамику хроматина, ацетилирование лизиновых остатков, как известно, противодействует укладке хроматина in vitro9. Т.к. ацетилирование нейтрализует позитивный заряд лизина, то предполагается, что эта модификация может оперировать посредством электростатического механизма. Т.к. метилирование лизиновых остатков не меняет его заряда, то любой прямой эффект метилирования лизина на укладку хроматина д. осуществляться посредством не-электростатического механизма (напр., посредством гидрофобных взаимодействий).
Альтернативная гипотеза предполагает, что специфические модификации гистонов, включая и метилирование лизина, являются местами связывания различных белков, которые обеспечивают нежестоящие эффекты11-13. В соответствии с этой гипотезой было установлено, что BROMODOMAINS могут распознавать ацетилированные лизины14,15. Идентифицированы также, по крайней мере, три белковых мотива - CHROMODOMAIN16-20, TUDOR DOMAIN21,22 и WD40-REPEAT DOMAIN23 - которые способны к специфическим взаимодействиям с метилированными остатками лизинов (Рис. 1b). Как описывается ниже, белки, которые содержат эти мотивы, рекрутируются с помощью специфических метилированных лизинов, и эта ступень рекрутирования, по-видимому, играет важную роль в уникальности биологических исходов, которые ассоциированы с разными событиями метилирования. Однако, существуют дополнительные уровни сложности: напр., как упоминалось выше, лизиновые остатки м. принимать одно из трех разных состояний метилирования. Также сродство связывания белка для определенной модификации может испытывать влияние со стороны др. соседних модификаций. Если это так, то это увеличение сложности может подтверждать гипотезу 'histone code', согласно которой утверждается, что разные комбинации модификаций гистонов обеспечивают уникальные клеточные ответы11-13.
Существование гистонового кода остается под вопросом24. Существование кода зависит от определения слова 'код'. Напр., Stephen Henikoff рассматривал недавно этот вопрос и сравнил гистоновый код с простым бинарным кодом, сходным с компьютерным кодом, состоящим из перестановок 0 или 1 (Ref. 25). На базе этого четкого определения, три лизиновых остатка (K4, K36 и K79) на каждой H3 молекуле почкующихся дрожжей д. генерировать 8 возможных перестановок метилирования (для простоты, состояние метилирования не рассматривается). Гипотетически, каждая из этих перестановок может быть распознана разными эффекторными белками, которые и будут приводить к уникальным биологическим последствиям. В противоположность этому ожиданию, недавние данные показали, что некоторые модификации гистонов тесно скоррелированы с др. подобными26,27. Это указывает на то, что ряд перестановок, которые происходят in vivo ограничен, тем самым снижается потенциальное богатство гистонового кода. Однако, доказательства для определенных уровней общения ('cross-talk') между разными ковалентными модификациями гистонов существуют28-30, хотя в целом эти наблюдения неясны.
В заключение, на базе современных данных, трудно придти к окончательному выводу о существовании строгого гистонового кода. Сегодня доступен более исчерпывающий список гистоновых модификаций, коррелятивный анализ этих модификаций по шкале целого генома позволяет подсчитывать количества перестановок (permutations), которые используются в природе. Это, в свою очередь, позволяет сделать заключение, касающееся потенциального существования гистонового кода. Для целей данного обзора, однако, существенно думать об индивидуальных метилированных остатках лизинов, как простых местах доков, которые рекрутируют разные эффекторные белки.


Heterochromatin formation


Гетерохроматин исторически определен как хромосомные области, такие как CENTROMERES и TELOMERES, которые остаются конденсированными в течение всего клеточного цикла31. Собственно формирование гетерохроматина биологически важно: напр., образование центромерного гетерохроматина необходимо для собственно расхождения хромосом во время митозов32. Кроме того, образование гетерохроматина играет также критическую роль в событиях рекомбинации, которые ассоциируют с MATING-TYPE SWITCHING у делящихся дрожжей33 (Box 1).
H3 lysine 9. В последние годы гетерохроматин был определен в молекулярных терминах. Это оказалось возможным благодаря наблюдениям, что интеграция трансгенов в гетерохроматиновые области приводит к феномену молчания, такому как POSITION EFFECT VARIEGATION (PEV)34. Исследования PEV у Drosophila melanogaster привели к идентификации ряда PEV супрессоров, включая Su(var)3-9 (Ref. 35), и его человеческого гомолога SUV39H1, как подзднее было показано, являющегося histone lysine methyltransferase со специфичностью к гистоновому H3 lysine 9 (H3-K9)36. Роль SUV39H1 и ассоциированной с ней H3-K9 methyltransferase активности в функционировании гетерохроматина была продемонстрирована благодаря её ассоциации с гетерохроматиновым белком HP1 (Ref. 37). Последующие исследования показали, что метилирование H3-K9 создает сайт связывания для chromodomain HP1 белков16,18.
Молекулярные события, которые описаны выше, были законсервированы во время эволюции. Напр., у делящихся дрожжей метилирование H3-K9 катализируется с помощью SUV39H1 гомолога Crl4 (Ref. 38). Clr4-обусловленное метилирование H3-K9 служит для рекрутирования Swi6, гомолога у делящихся дрожжей HP1 млекопитающих (Refs 16,18,38). Хотя и Clr4 и Swi6 необходимы для образования гетерохроматина39, функции этих двух белков, ассоциированные с гетерохроматином, неизвестны. Возможно, что Swi6 обеспечивает рекрутирование дополнительных белков, которые необходимы для функционирования специфических регионов гетерохроматина. Сходный механизм недавно был предположен для локусов типа спаривания делящихся дрожжей33 (Box 1).
Хотя роль метилирования H3-K9 в формировании гетерохроматина после рекрутирования Swi6 неопределенна, недавно достигнут определенный прогресс в понимании механизма. с помощью которого Clr4 попадает на гетерохроматиновые области. Сначала было установлено, что путь RNA interference (RNAi) играет роль в формировании гетерохроматина у делящихся дрожжей40,41. Центральными в механизме таргетинга являются два белковых комплекса, известных как RNA-induced transcriptional silencing (RITS) и RNA-directed RNA polymerase (RDRC)42,43 (Рис. 2). RITS состоит из трех белковых субъединиц и ассоциирует с молекулами SMALL INTERFERING RNA (siRNA), которые являются гомологами повторяющихся последовательностей, которые обнаруживаются в местах образования гетерохроматина. В соответствии с современными моделями, молекулы siRNA нацеливают RITS на РНК транскрипты, которые ассоциированы с гетерохроматиновыми локусами. Это, в свою очередь, ведет к рекрутированию Clr4 и метилированию H3-K9. Относительно роли RDRC, данные показывают, что этот комплекс участвует в продукции молекул siRNA, которые ассоциируют с RITS. Очевидно, что RDRC использует врожденную РНК полимеразную активность для превращения ассоциированных с гетерохроматином одно-нитчатых транскриптов в двунитчатые РНК. Эти молекулы затем становятся на путь RNAi, чтобы продуцировать больше siRNAs, которые, преимущественно, ассоциируют с RITS и усиливают поставку этого комплекса на центромерные повторы. Интересно, что RDRC, попадающие в места образования гетерохроматина, нуждаются в RITS, указывая тем самым на существование само-усиливающей петли44,45.
В целом, это впечатляющая модель. Однако, одинаково со всеми опытными моделями, имеется несколько аспектов, которые требует дальнейшего разъяснения. Напр., один из компонентов RITS, Chp1, содержит chromodomain, который взаимодействует специфически с methyl-H3-K9 (Ref. 46). Кроме того, Clr4, и преимущественно метилирование H3-K9, необходимы для ассоциации Chp1 и RITS с гетерохроматином47. Эти наблюдения находятся в конфликте как с последовательностью событий, представленных выше, так и с концепцией, что RITS функционирует, чтобы рекрутировать Clr4. Одним из возможных объяснений является то, что RITS первоначально помещается на гетерохроматин посредством Clr4-независимого механизма, и что последующее рекрутирование Clr4 ведет к стабилизации связывания RITS с помощью настоящих взаимодействий между Chp1 и methyl-H3-K9 (Ref. 44).
Путь, который ведет к образованию гетерохроматина, по-видимому, эволюционно законсервирован. У мышей два гомолога Clr4, SUV39h1 и SUV39h2, ответственны за метилирование H3-K9 в гетерохроматиновых регионах, таких как перицентромерный гетерохроматин18,48,49. Эта модификация рекрутирует Swi6 гомолог HP1α and HP1β, аналогичным образом. что и у делящихся дрожжей16,18. Однако, вклад пути RNAi в образование гетерохроматина у млекопитающих ещё не установлен.
H4 lysine 20. Помимо метилирования H3-K9, метилирование H4-K20 также является маркером гетерохроматина млекопитающих50. Было установлено, что SUV4-20h1 и SUV4-20h2, два SET-домен содержащих белка, которые локализуются в перицентрических областях, ответственны за эту модификацию. Более того, мутации у D. melanogaster гомолога Su(var)4-20 нарушают образование гетерохроматина, как установлено, за счет супрессии PEV. Интересно, что Suv4-20h1/Suv4-20h2 и специфическая изоформа HP1 способны к непосредственному взаимодействию др. с др., а метилирование H4-K20 исчезает из перицентромерных областей в отсутствие функции Suv3-9h1/Suv3-9h250. Эти наблюдения важны, т.к. они указывают на то, что одной из функций метилирования H3-K9 и связывания HP1 может быть рекрутирование Suv4-20h1/Suv4-20h2 в перицентромерный гетерохроматин. Однако, важно отметить, что этот путь не законсервирован у делящихся дрожжей и может быть ограничен метазоа (Box 2). Важно понять механизм, с помощью которого H4-K20 вызывает свои эффекты. Возможно, что эта модификация, сходная с метилированием H3-K9, является местом связывания неизвестного белка, участвующего a формировании гетерохроматина.
Более аккуратное описание гистоновых модификаций, которые ассоциируют с гетерохроматином млекопитающих, д. включать информацию о статусе метилирования H3-K9 и H4-K20 в этих регионах; т.е., эти остатки являются mono-, di- или trimethylated. У мышей, напр., показано, что перицентрический гетерохроматин специфически обогащен trimethyl-H3-K9 и H4-K20 (Refs 48-50). Напротив, mono- и dimethyl-H3-K9 и H4-K20 обнаруживаются в не-гетерохроматиновых областях, обозначаемых как EUCHROMATIN (Box 2). Значение этого наблюдения не определенно. Наиболее интуитивным ответом может быть то, что статус метилирования диктует рекрутирование специфических связывающих метил белков, которым приписываются уникальные функции. В отношении метилирования H3-K9 имеется согласующееся с разными паттернами локализации мнение, что метилирование осуществляется с помощью изоформ HP1. Итаr, в то время как HP1α b HP1β локализуются в перицентромерном гетерохроматине, изоформа HP1γ локализуется в эухроматине51. Диктует ли статус метилирования или др. факторы локализацию этих белков предстоит выяснить.


Transcriptional silencing


H3-K 9 methylation and euchromatic gene silencing.
Как отмечалось выше, H3-K9 mono- и dimethylation, по-видимому, ограничено эухроматиновыми областями у млекопитающих48,49. Мыши, дефицитные по G9a или G9a-related protein (GLP), две очень близкие histone methyltransferases, обнаруживают тяжелую редукцию метилирования H3-K9 в эухроматиновых областях, это указывает на то, что G9a и GLP являются первичными H3-K9 methyltransferases в этих доменах хроматина52. G9a/GLP-обусловленное метилирование H3-K9, по-видимому, функционирует в замалчивании (silencing) индивидуальных генов. В G9a-дефицитных клетках, напр., некоторые гены, принадлежащие к группе MageA усиливают свою активность53. В дополнение к G9a и GLP, SUV39h1 и SUV39h2 также связаны с молчанием генов, локализованных в эухроматине. Напр., retinoblastoma (Rb) белок, как было установлено, замалчивает некоторые S-фазные гены, рекрутируя SUV39h1 и SUV39h2 на их промоторы54. Важно, что эти histone methyltransferases, по-видимому, репрессируют экспрессию только во время терминальной дифференцировки и не играют роли во время временной экспрессии этих генов в делящихся клетках55. В согласии с этой концепцией и то, что SUV39h-обусловленное метилирование H3-K9 служит в качестве сайта связывания для HP1, HP1 обогащен на промоторе S-фазного гена, cyclin E54. Неясно, как рекрутирование HP1 ведет к молчанию генов, но возможный механизм может использовать направление DNA methyltransferases на эти гены (Box 3).
Недавнее исследование сделало вызов утверждениям общего характера об ассоциации между метилированием H3-K9 и молчанием генов56. Были предоставлены доказательства на нескольких линиях клеток, что кодирующие области ряда активных генов обогащены trimethyl-H3-K9 и изоформой HP1γ. Эти данные трудно примирить с наблюдениями, описанными выше, но вполне возможно разработать модель, которая учтет и эти данные. Напр., предположено, что метилирование H3-K9 м. выполнять разные функции в зависимости от того, происходит оно в кодирующих областях или в промоторах. Так, K9 метилирование, нацеленное на промоторы генов cyclin E и cyclin A2, м. вызывать молчание, тогда как метилирование K9, нацеленное на кодирующие области определенных генов, м. облегчать транскрипцию. Др. возможность в том, что следствие метилирования K9 может быть ген-зависимым. Как упоминалось выше, интеграция трансгенов в гетерохроматин часто вызывает молчание. однако, определенные гены, которые обычно располагаются в гетерохроматине могут быть активными, несмотря на то, что обогащены метилированием H3-K957.
H3 lysine 27 methylation in Hox gene silencing. В дополнение к метилированию H3-K9, метилирование гистона H3-K27 также связано с некоторыми феноменами молчания, включая молчание гомеобоксных генов, X инактивацию и GENOMIC IMPRINTING58. По сути эта система молчания обеспечивается POLYCOMB GROUP (PcG) белков59. PcG-обусловленное молчание генов и метилирование гистонов впервые сошлись, когда было установлено, что комплекс PcG белков катализирует метилирование H3 по lysine 27 (Refs 58,60-63). Состав этого комплекса варьирует, хотя SET-домен содержащий белковый энхансер zeste (E(Z); или его человеческий гомолог EZH2), extra sex combs (ESC; или его человеческий гомолог embryonic ectoderm development (EED)) и suppressor of zeste-12 (SUZ12) присутствуют во всех комплексах, которые были выделены. После этого комплекс стал обозначаться как E(Z) или EZH2 комплекс.
Роль комплекса E(Z) и метилирования H3-K27 в PcG-обусловленном молчании генов впевые была изучена в контексте регуляции гомеозисных генов, хотя сегодня ясно, что PcG белки регулируют также многие др. гены59. Гомеозисные гены кодируют транскрипционные факторы, которые специфицируют качественные особенности эмбриональных тканей 59. Замалчивание этих генов с помощью PcG белков ограничено экспрессией HOX GENES в специфических типах клеток развивающегося эмбриона. Исследования, которые изучали рекрутирование PcG белков на Ubx ген, гомеозисный ген D. melanogaster, привели к предположению модели ступенчатого принуждения к молчанию64 (Рис. 3a). На первой ступени, ДНК-связывающие белки Pleiohomeotic (Pho) и Pleiohomeotic-like (PhoL) ограничены специфическими последовательностями ДНК, которые известны как Polycomb response element (PRE), и локализованы выше гена Ubx. Pho и PhoL, в свою очередь, рекрутируют комплекс E(Z) и ассоциированную с ним methyltransferase активность посредством межбелковых взаимодействий, которые приводят к метилированию H3-K27. Аналогично предположенной функции methyl-H3-K9, methyl-H3-K27, по-видимому, является сайтом связывания для chromodomain-содержащего белка, Polycomb (Pc), который является компонентом Polycomb repressive complex-1 (PRC1)17,19,65. Значение этого взаимодействия было неизвестно, но сегодня установлено, что PRC1-подобный комплекс обладает UBIQUITIN E3 LIGASE активностью, которая является специфичной для гистона H2A66. Эти наблюдения указывают на то, что метилирование H3-K27 и связывание Pc может функционировать по рекрутированию белка с E3 ligase активностью на гены Hox, который будет вызывать в результате ubiquitylation H2A. Эта гипотеза подтверждена в исследованиях, показавших, что связывание Pc и H2A ubiquitylation на PRE элементах устраняются в отсутствие функции E(Z)66. Главный вопрос, на который эти наблюдения не дали ответа, как H2A ubiquitylation связано с молчанием. Одна из возможностей, что эта модификация, подобно др. гистоновым модификациям, позволяет рекрутирование эффекторного белка, который обеспечивает молчание. Альтернативное объяснение, что H2A ubiquitylation может непосредственно вмешиваться в специфическую ступень транскрипции , такую как переход к инициации элонгации.
X inactivation and genomic imprinting.
Помимо молчания гомеозисных генов PcG белки участвуют в др. форме молчания - инактивации X хромосомы у самок67. Центральный механизм X инактивации - это Xist, не-кодирующая РНК, которая экспрессируется с X хромосомы, которая предназначена стать молчащей (Рис. 3b). Эти РНК транскрипты покрывают целиком неактивную Х хромосому (Xi) и приводят к молчанию генов по всей хромосоме. Процесс инактивации Х может быть подразделен на два самостоятельных класса, импринтированная Х инактивация и случайная Х инактивация.
Термин 'imprinted' связан с феноменом молчания, при котором один аллель - или хромосома в случае Х инактивации - молчит преимущественно от одного из родителей. В раннем развитии мышей, imprinted X инактивация, при котором инактивируется отцовская хромосома, происходит во всех клетках эмбриона68,69. Отцовская Х хромосома остается молчащей в тех клетках, которые вносят вклад во вне-эмбриональные ткани, тогда как инактивация Х иная в клетках, которые формируют собственно эмбрион. Постепенно X инактивация восстанавливается в этих клетках, но в этом случае инактивация инициируется случайно или на материнской или отцовской хромосоме Х.
Относительно роли PcG белков в этом процессе, было установлено, что компоненты мышиного EZH2 и PRC1 комплексов временно рекрутируются на неактивную Х хромосому во время инициальной стадии как при импринтированной. так и случайной инактивации Х70-73.Более того, рекрутирование этих белков совпадает с появлением methyl-H3-K27 и убиквитилированных H2A на Xi. Эти находки, вместе с тем фактом, что Х инактивация нарушается в отсутствие EED74 (компонент мышиного комплекса EZH2), указывает тем самым, что сходные механизмы м. обеспечивать как молчание гомеоозисных генов, так и Х инактивацию. В дополнение к этим формам молчания, EED белок также необходим для замалчивания субнабора импринтируемых генов75. Интересно, что Kcnq1ot1 не-кодирующий транскрипт, как полагают, функционирует в рекрутировнии EZH2 комплекса и в метилировании H3-K27 импринтируемых генов76,77. Эти наблюдения в комбинации с недавними находками, что транскрипция посредством PREs необходима для обратимого PcG-обусловленного молчания Hox генов78, открывает возможность, что не-кодирующая РНК м. играть главную роль в PcG-обусловленном молчании генов.
Regulation of H3 lysine 27 methylation.
С разработкой инструментов, которые позволят определять статус метилирования разных лизинов, может быть проанализировано распределение H3-K27 mono-, di- и trimethylated остатков как в крупных доменах хромосом, так и в индивидуальных генах. Базируясь на анализе целых хромосом а также индивидуальных генов, становится очевидным, что trimethyl-H3-K27 довольно много в молчащих гомеозисных генах, инактивной Х хромосоме и импринтируемых генах64,72,73,76,77. Напротив, наблюдается, что monomethyl-H3-K27 локализуется в перициентрическом гетерохроматине в линиях клеток млекопитающих48,49. Более того, в то время как все формы метилирования H3-K27 нуждаются в EED79, SUZ12, по-видимому, безразличен к моно-метилированию H3-K27 in vivo, хотя и не безразличен для ферментативной активности in vitro80,81. Это наблюдение показывает существование альтернативного SUZ12-независимого комплекса EZH2, который может обеспечивать моно-метилирование H3-K27и образование перицентрического гетерохроматина. Сообщалось также, что специфические изоформы EED были способны переключать специфичность к субстрату человеческого EZH2 комплекса, так что энзим мети лировал лизин 26 в линкерном гистоне H1 (Ref. 82). Однако, потенциальная функция этой модификации пока неясна. Всё это указывает на то, что разные EZH2 комплексы с самостоятельными функциями могут существовать in vivo.


Transcriptional activation


В дополнение к транскрипционной репрессии метилирование гистоновых лизинов, как было установлено, участвует и в активации транскрипции. Главные сайты метилирования лизина, которые ассоциируют с активностью генов, включают K4, K36 и K79 гистона H3. Интересно, что метилирование всех трех сайтов, по-видимому, непосредственно связано с процессом транскрипции. В случае метилирования H3-K4 и H3-K36, энзимы, ответственные за обе модификации, физически ассоциируют с RNA polymerase II (RNAPII) во время элонгации, давая в результате метилирование гистона в кодирующих областях83-86 (Рис. 4). Помимо lysine methyltransferases, ферментативные комплексы, которые обеспечивают ubiquitylation H2B, также прикрепляются к RNAPII87. Убиквитилирование H2B необходимо для метилирования H3-K4 и H3-K79, это говорит о том, что последнее также купировано с транскрипцией генов30,88-90.
Исследования почкующихся дрожжей показали, что ген-специфические активаторы рекрутируют комплекс ubiquitylation complex, который состоит из Rad6 и Bre1, на промоторы генов91-93. Этот комплекс затем нагружается на RNAPII и затем переносится в кодируемую область транскрибируемого гена. Неизвестно, как H2B ubiquitylation облегчает метилирование гистонов. Однако, 'wedge' модель предполагает, что довольно крупная молекула ubiquitin, которая составляет ~50% от молекулярного веса среднего гистона, действует на открытую нуклеосомную структуру и делает её доступной для methyltransferases94. Альтернативно, возможно, что модификация ubiquitin служит, чтобы рекрутировать др. белок(и), которые необходимы для метилирования. Кандидаты на эту роль включают Rpt4 и Rpt6, две протеосомные ATPases, которые необходимы для метилирования H3-K4 и H3-K7995. Было предположено, что эти белки могут функционировать как хапероны, путем утилизации энергии, производимой при гидролизе АТФ, чтобы расправить гистон H3, чтобы тем самым повысить его доступность.
Ассоциация SET1 и SET2 с RNAPII указывает на то, что метилирование H3-K4 и H3-K36 может быть результатом генной активности, по крайней мере, тогда, когда ген инициально становится активным. Эти наблюдения и тот факт, что метилированные лизины гистонов относительно стабильны, указывают на то, что метилирование K4, K36 и K79 может маркировать гены, которые активны. Это может иметь несколько важных следствий для регуляции генов. Напр., возможно, что эти модификации могут функционировать, чтобы поддержать транскрипцию в ситуациях, в которых факторы, который инициируют транскрипцию, подавляются или больше не функционируют. В таком сценарии разные метилированные лизины могут быть, как полагают, типа молекулярных 'door stop', чтобы удерживать гены от включения. Исследования функций метилирования H3-K4, в частности, показали, что это может происходить посредством рекрутирования факторов, которые вовлечены в регуляцию транскрипции генов20,23.
H3 lysine 4.
Анализ разных состояний метилирования H3-K4 и их распределений у разных организмов указывает на то, что как dimethyl- так и trimethyl-H3-K4 модификации многочисленны в активно транскрибируемых генах27,83,96,97. Эти разные состояния метилирования, однако, не перекрываются полностью. Так, dimethyl модификация, по-видимому, обычно распределена по всему телу активных генов, тогда как trimethyl модификация локализуется специфически на 5' конце этих генов. Этот общий паттерн метилирования подтвержден с помощью исследований всего геном с высоким разрешением98.
У S. cerevisiae lysine methyltransferase, названная Set1, ответственна за все три состояния метилирования H3-K4, это указывает на то. что эти состояния и их самостоятельные пространственные паттерны д. быть результатом регуляции ферментативной активности и/или таргетинга Set1 (Refs 99,100). В самом деле, паттерн три-метилирования H3-K4, по-видимому, связан с ассоциацией Set1 со специфической фосфорилированной формой elongating RNAPII (Рис. 4), которая ограничивается 5' регионами генов83. Единственная возможность заключается в том, что взаимодействия между SET1 и ассоциирующими с ним белами вызывают конформационные изменения в каталитической сайте SET1, превращающие энзим в trimethylase. Прецендентом такого белка является мышиный ATFa-associated modulator (mAM), который, когда ассоциирует с ESET, превращает ESET из H3-K9 dimethylase в trimethylase101. Потенциальная область, в которой Set1 может быть вовлечен в подбные гипотетические взаимодействия, является auto-inhibitory домен, который, по-видимому, специфически ингибирует H3-K4 trimethylation102. Др. возможность заключается в том, что Set1 является предметом для пост-трансляционной модификации, которая превращает энзим в trimethylase, когда ассоциирует с RNAPII. Т.к. было продемонстрировано, что Bur1 kinase комплекс необходим для H3-K4 trimethylation у S. cerevisiae103, то время продвинуть данную гипотезу на ступень дальше и предположить, что может использоваться событие фосфорилирования.
Понимание, что methyl-H3-K9 и methyl-H3-K27 служат в качестве сайтов связывания для разных белков, которые отвечают за биологические эффекты этих модификаций, ведет к предположению, что эта модель д.б. также верна для methyl-H3-K4. Подтверждением этой модели служит, что Isw1, субъединица Isw1 ATФ-зависимого хроматин-ремоделирующего комплекса, рекрутируется на специфический набор генов способом, который зависит от метилирования H3-K4104. Однако, Isw1 не обладает methyl-связывающим доменом, это указывает на то, что взаимодействие с мети лированным H3-K4, по-видимому, непрямое.
Установлено, что разные белки, Chd1 и WDR5, взаимодействуют специфически и непосредственно с метилированным H3-K4 (Refs 20,23). Chd1 является компонентом SAGA (Spt-Ada-Gcn5-acetyltransferase), histone acetyltransferase (HAT) комплекса, который участвует в транскрипции больших групп генов у S. cerevisiae105. Только один из двух chromodomains в Chd1 обеспечивает взаимодействия с метилированным K4, и это взаимодействие, по-видимому, играет роль в рекрутировании SAGA и ассоциированной с ним активности histone acetyltransferase на промоторы генов. Это ничего не значит, что SAGA обладает H2B deubiquitylation activity, которая необходима для активации SAGA-регулируемых генов91. Хотя нет прямых доказательств, подтверждающих роль этой активности в рекрутировании SAGA, возможно, что ubiquitin половинка д.б. удалена вследствие метилирования H3-K4 с тем, чтобы SAGA соединился с метилированным H3-K4.
Второй идентифицированный белок, связывающий метилированный K4, WDR5, является компонентом комплекса mixed-lineage leukemia (MLL), который обладает активностью H3-K4 methyltranferase23,106. В отличие от Chd1, WDR5 взаимодействует с methyl-K4 посредством нового methyl-связывающего мотива, известного как WD40-repeat домен. Интересно, что WDR5 соединяется преимущественно с dimethyl-K4 и необходим для поддержания глобальных уровней trimethyl-H3-K4. Хотя точный лежащий в основе механизм неясен, предполагается, что рекрутирование MLL methyltransferase комплекса на dimethyl-H3-K4 как результат связывания WDR5, может конвертировать dimethyl-H3-K4 в состояние trimethyl23.
Идентификация и инициальная характеристика Chd1 и WDR5 подтверждает концепцию, что methyl-K4 служит в качестве сайта связывания для белков, участвующих в транскрипции генов, но многие вопросы остаются открытыми. Напр., как состояние dimethyl превращается в состояние trimethyl? Диктуют ли dimethyl- и trimethyl-K4 рекрутирование разных белков, который, в свою очередь, вызывают разные следствия? Альтернативная возможность в том, что значение разных состояний метилирования заключается в их прирожденной стабильности, Возможно, что trimethyl-H3-K4 оборачивается с более медленной скоростью, чем dimethyl-H3-K4. В таком случае, trimethyl модификация, которая устанавливается с помощью инициальных раундов транскрипции может удерживаться в течение периода молчания, при котором не происходит нового метилирования H3-K4. Это важно, т.к. это может быть способом, с помощью которого trimethylation может служить в качестве 'памяти' о предыдущей транскрипционной активности83. Др. словами, метилирование гистонов может быть основой для системыЮ в которой предыдущая активность гена модулирует будущую активность. В одном из возможных сценариев транскрипционная память д. проявлять себя посредством повышенного рекрутирования ко-активаторов, таких как SAGA на гены, которые уже транскрибировались. Это затем может увеличивать вероятность, что такие гены будут транскрибироваться при более низких порогах, необходимых для активации.
H3 lysine 36 and lysine 79.
По сравнению с метилированием H3-K4, мало известно о функции метилирования K36 и K79. У S. cerevisiae, Set2 отвечает за метилирование K36 и одинаково с Set1, этот энзим физически ассоциирован с elongating формами RNAPII84-86. Set2, однако, отличается от Set1 тем. что он остается ассоциированным с RNAPII по всему телу транскрибируемых генов. Значение этого неизвестно, но указывает на то. что Set2 и метилирование K36 могут быть предназначены для регуляции иных ступеней транскрипции генов, чем Set1.
Относительно метилирования H3-K79 возможными энзимами могут быть Dot1 или его гомологи, которые являются единственными lysine methyltransferases, которые были идентифицированы и которые лишены обнаружимого SET домена107-110. Dot1 необходим для предупреждения распространения HISTONE DEACETYLASES, которые являются энзимами, используемыми для замалчивания генов в активных регионах хромосом108,111. Некоторая информация о возможной функции H3-K79 была получена, когда было установлено, что эта модификация служит как сайт связывания для белка млекопитающих 53BP1 (Ref. 21). Этот белок взаимодействует с methyl-H3-K79 посредством домена tudor в местах повреждения ДНК. Это может указывать на роль метилирования H3-K79 в репарации ДНК, сегодня нет доказательств, что 53BP1 участвует в транскрипции генов, и это указывает на существование дополнительных белков, связывающих methyl-K79. Идентификация таких белков важна для понимания роли Dot1 и метилирования H3-K79 в транскрипции.
Помимо регуляции экспрессии генов в нормальных условиях метилирование H3-K79 при некоторых генах может быть связано с раком. Установлено, что гомолог у млекопитающих дрожжевого Dot1 играет роль в leukemogenesis, вызываемым с помощью MLL-AF10 слитого белка112. Установлено, что hDOT1L рекрутируется на MLL-AF10 гены мишени, такие как, HoxA9, путем взаимодействия междуhDOT1L и AF10. Метилирование H3-K79 с помощью hDOT1L ведет к усилению экспрессии HOXA9, что приводит в результате к лейкемической трансформации. Тот факт, что ферментативная активность hDOT1L необходима для лейкемической трансформации открывает возможность терапевтического вмешательства, которое нацелено на активность hDOT1L methyltransferase.


Histone demethylation


Идентификация энзимов, которые отвечают за деметилирование лизина в гистонах, отстала от идентификации гистоновых methyltransferases. Фактически существование таких энзимов ставилось под сомнение113. Первый прорыв в этой области произошл с идентификацией энзима, который конвертировал methyl-arginine в citrulline114,115. Затем было установлено, что LSD1 (известный также как BHC110), белок, который ранее был идентифицирован как компонент нескольких histone deacetylase комплексов, может деметилировать mono- и dimethylated H3-K4 в amine oxidase реакции116. Сходно со многими гистоновыми methyltransferases, ферментативная активность LSD1 может регулироваться ассоциируемыми, таким как CoREST117. Более того, наблюдалось, что подавление LSD1 коррелирует с повышенным метилированием H3-K4 и усилением активности LSD1 генов мишеней. Т.о., эти эксперименты показывают, что LSD1 участвует в транскрипционной репрессии, а недавние исследования экспрессии гормон-регулируемых генов показали. что LSD1 участвует также в активации генов118. Эти противоречивые данные, по-видимому, объясняются существованием взаимодействующих белков, которые могут модулировать субстратную специфичность LSD1. Ассоциация с андрогенными рецепторами, как было установлено, способна наделять H3-K9 demethylase активностью LSD1 (Ref. 118). Механизм, лежащий в основе переключения субстратной специфичности, еще предстоит определить.
Из-за врожденных ограничений amine oxidase реакции LSD1 не может деметилировать trimethylated лизины. Это может указывать на то, что trimethyl метка, такая как, H3-K4 trimethyl модификация, которая ассоциирует с активацией транскрипции, стабильна. Альтернативно, разные классы энзимов могут быть предположены для обратимого trimethylation. Потенциальные кандидаты включают белки, которые содержат JmjC домены119, мотив. который, как предполагается, обладает способностью обратимого lysine trimethylation посредством реакции гидроксилирования120. Интересно отметить, что исследованиях, упомянутых выше, стимуляция андрогеном ведет в результате к потере trimethyl-H3-K9, которая была нечувствительна к LSD1 ингибитору, это подтверждает существование альтернативного энзима, специфичного к trimethyl состоянию.


Concluding remarks


Five years ago, it was known that histones were methylated, but the significance of this post-translational modification was unclear. Since then, the field of histone methylation, and particularly histone lysine methylation, has flourished with the identification of numerous methyltransferases that participate in diverse biological processes. The pace of discovery in this field can partly be attributed to previous genetic studies, which firmly established the genes that encode many of these enzymes in pathways that affect chromatin function. Although the progress in the field has been impressive, many questions remain to be addressed.
One challenge is to define the molecular events that link histone methylation with specific biological outcomes, such as transcriptional activation or repression. This can be achieved by understanding the upstream regulatory pathways of individual enzymes and the downstream events that occur after methylation. The current paradigm is that histone methylation serves as a molecular mark for the subsequent recruitment of effector proteins. We anticipate that future studies will uncover new protein domains that recognize individual or combinational modifications. Subsequently, it will be necessary to delve into the mechanistic details of how these methyl-binding proteins might functionally interact with downstream effectors such as the basal transcription machinery.
In addition to a mechanistic understanding, we anticipate that great progress will be made in linking the various histone modification patterns to different biological processes such as cell-lineage determination and maintenance. In this regard, it will be important to define cell-lineage-specific histone modification patterns of key regulators that are involved in lineage specification. We anticipate that chromatin immunoprecipitation (ChIP)-coupled microarrays will have an important role in this area of study.
The third area of interest is the potential role of histone methylation in various diseases, particularly cancer. While many histone lysine methyltransferases are linked to cancer, EZH2 and hDOT1L are probably the best examples112,121. If the involvement of these histone methyltransferases in cancer is verified in animal models or cancer patients, they will be excellent targets for therapeutic treatment.
Finally, a question that will surely attract great attention is the extent and biological significance of histone demethylation. To answer this question, it will be necessary to identify and characterize more potential demethylases. We predict that the use of novel unbiased activity-based assays coupled with biochemical approaches will lead to the discovery of novel demethylases. We have every reason to believe that the years ahead will be even more exciting in the field of histone methylation.

Сайт создан в системе uCoz