Точные пространственные и временные паттерны экспрессии генов являются критическими для нормального развития всех организмов. Дирижирование этими паттернами нуждается в координации многочисленных регуляторных событий и механизмов. которые обеспечивают как репрессию, так и активацию специфических генов мишеней в определенное время и в определенном месте во время развития. ДНК-связывающие транскрипционные факторы, не связывающие ДНК ко-регуляторы и общие компоненты базовой RNA polymerase кухни (machinery) существенны для регуляции транскрипции и создания корректных паттернов генной экспрессии. Хотя имеются многочисленные вариации в их функционировании и в высоко специфичных стратегиях регуляции, выявляются некоторые общие темы и общие правила.

Ядерные рецепторы представляют собой интересную модель для изучения специфических, а также более общих, механизмов регуляции транскрипции; они являются высоко регулируемыми ДНК-связывающими транскрипционными факторами, которые непосредственно модулируются с помощью связывания лиганда и могут активировать и репрессировать экспрессию генов.

Подсемейство ядерных рецепторов млекопитающих представлено более чем 45 транскрипционными факторами, многие из которых регулируют генную экспрессию лиганд-зависимым образом. Члены подсемейства ядреных рецепторов включают: рецепторы для стероидных гормонов, такие как oestrogen receptor (ER), androgen receptor (AR) и глюкокортикоидные рецепторы (GR); рецепторы для нестероидных лигандов, такие как thyroid hormone receptor (TR) ретиноевой кислоты рецепторы (RAR); а также рецепторы, которые связывают разнообразные продукты липидного метаболизма, такие как жирные кислоты и prostaglandins (peroxisome proliferator activated receptors (PPARs) и liver X receptors (LXRs))^1,2. Суперсемейство ядерных рецепторов также включает многие т.наз.ORPHAN RECEPTORS для которых регуляторные лиганды всё ещё неизвестны или для которых кандидаты только недавно идентифицированы при скрининге, открывшем физиологическое и фармакологические лиганды³.

Удивительно, последовательности генома Caenorhabditis elegans показали, что семейство ядерных рецепторов более чем с 200 членами, составляет самое большое семейство транскрипционных регуляторов, кодируемых этим геномом, это указывает на то, что эти белки играют важную роль для средовой адаптации нематод⁴. Секвенирование генома человека привело к идентификации 48 ядерных рецепторов, которые выполняют различные, важные роли в регуляции роста, развития и гомеостаза. Сравнительный анализ геномных последовательностей людей, нематод и насекомых показал, что расходящиеся эволюционные пути предопределили отдельные филогенетические линии, так что наибольшее количество ядерных рецепторов у C. elegans дивергировали от тех, что у людей и мух⁵.

Белки ядерных рецепторов имеют характерную модулярную структуру, которая включает высоко законсервированный DNA-binding domain (DBD) и ligand-binding domain (LBD)^1,2. Однако, несмотря на структурную консервацию, члены семейства ядерных рецепторов функционально чрезвычайно гибки в регуляции транскрипции. Напр. могут соединяться непосредственно во специфическими чувствительными элементами в ДНК или как мономер или как гомо- и гетеродимеры. Тли они могут регулировать транскрипцию косвенно посредством др. классов связывающихся с ДНК транскрипционных факторов. Также субнабор рецепторов, который включает TR и RAR, может активно репрессировать гены мишени в отсутствие связывания с лигандом, все ядерные рецепторы обычно становятся мощными транскрипционными активаторами. Напротив, некоторые ядерные рецепторы, как было установлено, ингибируют транскрипцию лиганд-зависимым способом - или путем соединения с негативными отвечающими элементами или путем противодействия транскрипционным активностям др. классов транскрипционных факторов, эффект известный как transrepression^1,2,6,7(Рис. 1).

Ядерные рецепторы выполняют свои многочисленные различающиеся функции путем рекрутирования позитивных и негативных регуляторных белков хозяина, обозначаемых как ко-активаторы и ко-репрессоры, соотв.⁸ (Рис. 2). Эти регуляторные кофакторы не являются исключительно присущими ядерным рецепторам, а используются сходным образом многочисленными др. ДНК-связывающими транскрипционными факторами. Молекулярные механизмы, которые регулируют альтернативные взаимодействия ядерных рецепторов с любым из классов кофакторов, были декодированы с помощью кристаллографических исследований⁹. Детальное описание того, как эти альтернативные взаимодействия непосредственно регулируются с помощью специфических изменений в конформации рецепторов, см. Box 1.

В целом несвязанные с лигандом ядерные рецепторы преимущественно взаимодействуют с ко-репрессорами, чтобы обеспечить репрессию, тогда как связанные с лигандом рецепторы являются транскрипционными активаторами благодаря своей способности рекрутировать ко-активаторные белки. Однако, выявлены и небольшие исключения, т.к. некоторые ко-репрессоры, такие как LCoR (ligand-dependent nuclear-receptor corepressor), RIP140 (receptor-interacting protein-140) и REA (repressor of oestrogen-receptor activity)^10,11, могут соединяться с ядерными рецепторами лиганд-зависимым способом и конкурировать с ко-активаторами путем их вытеснения. Эти находки указывают на то, что существуют специфические регуляторные механизмы, которые используют сходные, но обратимые подходы для ослабления функции связанных с агонистом рецепторов. Более того, имеются ко-регуляторные факторы, такие как АТФ- зависимые ремоделирующие хроматин комплексы SWI/SNF, которые ассоциируют с регуляцией как активации генов, так и репрессии генов^12-16. Следовательно, важно учитывать, что роль данного ко-регуляторного белка может быть контекст зависимой и, следовательно, не всегда возможно достичь функционального результата на базе привлечения специфических кофакторов.

Напротив, ко-регуляторы могут быть также классифицированы на две большие группы в соответствии со способом их действия. Первая группа содержит факторы, которые ковалентно модифицируют гистоны (напр., с помощью ACETYLATION/deacetylation, METHYLATION/demethylation, phosphorylation/dephosphorylation или UBIQUITYLATION/deubiquitylation), процессов, которые следуют точному комбинаторному коду. Вторая группа включает АТФ-зависимые ремоделирующие хроматин факторы, которые модулируют доступонсть промоторов для транскрипционных факторов и основной транскрипционной кухне (machinery)^17-19. Однако, это широкое деление не полностью включает в себя всё, т.к. имеются многочисленные кофакторы, которые не обладают какими-либо непосредственными эффектами на структуру хроматина или модификацию, но вместо этого функционируют в ансамбле, рекрутируя или удаляя ко-регуляторные комплексы.

Более того, точная классификация осложняется тем фактом, что новые ко-регуляторы постоянно открываются и они включают факторы, которые не были ожидаемы, что будут выполнять такие функции, напр., ко-активатор РНК транскрипта steroid-receptor-RNA activator-1 (SRA1)²⁰, NAD/NADH сенсор CtBP (C-terminal binding protein of E1A)^21-23, и некоторые ACTIN-связывающие белки^24-29. Это указывает на то, что транскрипционная регуляция не может быть рассмотрена как независимый, базирующийся на хроматине процесс, а скорее д. рассматриваться как соединение со многими др. клеточными событиями, которые выполняются несколькими самостоятельными группами факторов. but rather should be considered as coupled to many other cellular events that are carried out by several distinct groups of factors. Исчерпывающий список известных ко-регуляторов см в Refs 30-33.

В заключение, общая концепция, которая возникает из этой незавершенной сложной сети ко-регуляторов, является та, что неожиданно большой массив белков и энзиматических активностей встречается на промоторах, что следует рассматривать как 'cofactor code', который характеризуется самостоятельными паттернами рекрутирования кофакторов и регулируемых ими энзиматических активностей. HISTONE CODE, который предопределяется с помощью специфических комбинаций ковалентных модификаций гистонов¹⁸, является следствием, а также детерминантом этого кода кофакторов, т.к. гистоны являются критическими мишенями для энзиматических активностей кофакторов, но такеже выполняют ключевую роль в спецификации рекрутирования кофакторов на базе 'считывания' гистонового кода с помощью специфических хроматин-связывающих доменов.

Способность ко-репрессоров и ко-активаторов ассоциировать с несколькими различными разнообразными комплексами ещё больше увеличивают сложность их ролей транскрипционных регуляторов и делает возможной время- и ткане-специфическую модуляцию комбинаторного кофакторного и гистонового кодов для специфического одиночного гена. Существование многочисленных платформ ко-регуляторных белков, каждый из котрых способен к нескольким взаимодействиям, имеет фундаментальную роль в предопределении этой гибкости, т.к. эти взаимодействия могут быть эффективно смодулированы с помощью ковалентных модификаций, уровней белка и конкуренции между белками и они составляют концептуальную основу для совершенного контроля экспрессии специфического гена.

Более того, многие ко-регуляторы обладают общими функциями и энзиматическими активностями с др., родственными ко-регуляторами, которые могут обладать частично перекрывающимися (redundant) функциями в определенных биологических условиях (settings), но они обладают уникальными функциями в остальном. Примером могут служить гомологи SWI/SNF2 у млекопитающих, Brahma и BRG1, которые не может генетически компенсировать др. др. и которые ассоциируют с др. BRG1-associated factor (BAF) комплексов ремоделирования хроматина^34-37, которые необходимы для разных ядерных рецепторов that are required by different nuclear receptors^14,38,39.

Рис. 2 показывает характерную единицу ядерным рецептором регулируемой транскрипции с субнабором когорт комплексов ко-активаторов и ко-репрессоров, которые могут участвовать в его контроле - переход от репрессии к активации возникает в результате связывания лиганда с рецептором и в результате замены ко-репрессоров на ко-активаторы. Хотя это представление общепринято и используется для иллюстрации сложности ко-регуляторных комплексов, этот тип модели очень статичен и через чур упрощен. Переключение между генной репрессией и активацией гена, напр., может быть жестко предопределено с помощью простой альтернативной потребности в двух разных регуляторных комплексах. Скорее же всего это достигается с помощью серии последовательных событий, которые обеспечиваются множественными ферментативными активностями, которые могут быть специфичными для факторов, промоторов и типов клеток^17,32,40,41.

Идея транскрипционной регуляции как высоко динамичного события также ставит интересный вопрос, могут ли транскрипционные комплексы временно рекрутироваться на каждый активный ген для замены кофакторов, которое происходит, или может ли критический компонент активации транскрипции использовать миграцию собственно промоторов в физиологические 'stations' из предварительно собранных транскрипционных 'factories' ^42-44.

Интересно, что vyubt исследования выявили роль ядерного актина в регуляции транскрипции генов^45,46, поэтому необходимо учитывать, что актин-связывающие белки и сам актин, обнаруживаемые в различных биохимически очищенных комплексах кофакторов, могут быть важными для обеспечения этих событий ядерной ре-локализации. О деталях функциональной архитектуры ядра и пространственной локализации активных доменов транскрипции см. Refs 47-49.

Учитывая разнообразие ко-регуляторных комплексов и их часто исключительный способ взаимодействия с транскрипционными факторами, важно установить, появляются ли эти серии взаимодействий транкрипционный-фактор--коактиватор случайно или последовательным и регулируемым способом. В самом деле, хотя паттерны клеточно- и время-специфической экспрессии некоторых кофакторов могут продуцировать самостоятельные модуляции транскрипционной активности ядерных рецепторов благодаря отличиям в относительных уровнях белков ко-репрессоров и ко-активаторов⁵⁰, но известно, что многие др. кофакторы ко-экспрессируютя в одних и тех же типах клеток с относительно одинаковыми, высокими уровнями, что открывает возможность их совместного рекрутирования на специфические промоторы.

Cosma и др.⁵¹ представили первый недвусмысленный пример упорядоченного рекрутирования разных ко-регуляторных комплексов на регулируемую транскрипционную единицу. Используя CHROMATIN IMMUNOPRECIPITATION (ChiP) анализ для изучения транскрипционной активации гена HO у почкующихся дрожжей, они нашли, что рекрутирование транскрипционных факторов Swi5 и SBF, SWI/SNF и SAGA комплексов ко-активторов и Ash1 репрессора происходит в точном соответствии в паттерном, в котором каждая ступень занимает определенный промежуток времени и необходима для последующего события⁵¹.

Это первое наблюдение предзнаменовало многочисленные исследования систем млекопитающих, часто связанных с генами, регулируемыми ядерными рецепторами, которые установили концептуально сходные паттерны привлечения и удаления когорт ко-регуляторных комплексов^52-56. Прекрасные примеры получены при изучении ER-обеспечиваемой регуляции транскрипции или cathepsin D (CATD)⁵³ или trefoil factor-1 (TFF1/pS2) промотора^16,55 в клетках рака молочных желез. Выявлены детальные и скоординировнные паттерны рекрутирования кофакторов и преимущественную избирательность для факторов, которые имеют сходные ферментативные активности^16,55. В случае промотора pS2, напр., различные классы кофакторов могут быть идентифицированы, каждый из которых характеризуется определенной ферментативной активностью и рекрутируется на индуцибельные промоторы с помощью ДНК-связывающего транскрипционного фактора фактор-специфическим, точно выверенным во времени и пространстве способом^16,32 (Рис. 3). Интересно, что в этих экспериментальных исследованиях, некоторые ко-регуляторы, по-видимому, перекрываются (redundant), а разные члены семейств одинаково способны альтернативно рекрутироваться на промотор (т.е., ко-активаторы ядерных рецепторов NCoA1/SRC1 и NCoA3/pCIP или coactivator-associated arginine methyltransferases CARM1 и PRMT1 никогда не оккупируют промоторpS2 одновременно)¹⁶. Напротив, наблюдаются преимущественные взаимодействия между ядерным рецептором и специфическим histone acetyltransferase (HAT)-содержащим энзимом или специфическим членом семейства ко-активаторов NCoA^57-59.

Сходный сценарий скоординированного привлечения специализированных ко-репрессорных комплексов выявляется для репрессии транскрипции. Напр., 4-hydroxy-tamoxifen (4-OHT)-связанный ERα обеспечивает последовательное рекрутирование двух разных комплексов, NCoR-TBL1-HDAC3 и хроматин-ремоделирующих комплексов, известных как nucleosome remodelling and histone deacetylation (NURD), каждый из которых обладает характерной histone deacetylase (HDAC) активностью⁶⁰. Укороченная N-терминальная ERα изоформа (apo-ERα-46kD) также ангажирует эти два комплекса, но в этом случае, не связанный с лигандом ER рекрутирует их комбинаторным способом, не наблюдается последовательного рекрутирования⁶¹. Интересно, что специфическое привлечение разнообразных ко-репрессорных комплексов может отражать разную специфичность по деацитилированию остатков в хвостах гистонов⁶², и это может быть важным для предопределения гистоновго кода репрессии.

В заключение, некоторые недавние исследования начали обнаруживать удивительную картину упорядоченного вовлечения различных комплексов кофакторов в регулируемые транскрипционные единицы. Задачей на сегодня является экстраполирование этих single-factor-, single-gene-, single-cell наблюдений на более общий уровень, чтобы понять правила, которые управляют закладкой этого кода кофакторов и стратегиями его модуляции. Интересен аспект, напр., что промотор-специфиченые ДНК-связывающие последовательности сами по себе могут представлять собой аллостерические регуляторы активности рецепторов и рекрутирования кофакторов^63-65. Сходным образом, способ взаимодействия с ДНК, или непосредственно или посредством др. транскрипционных факторов, может быть важным регулятором специфичности. Shang and Brown, напр., описали различия в регуляции Myc и CATD генов с помощью ERα, который связан с антагонистом 4-OHT, что может зависеть от разной организации двух анализируемых промоторов - которые или содержат или лишены классического oestrogen response element (ERE)⁵⁰. Более того, Rogatsky и др. приспособили геномный подход для идентификации GR мишеней и для выявления отличий в их регуляции. Это сделало возможной идентификацию нескольких отличающихся паттернов, используемых специфическими GR доменами, это указывает на то, что одиночный транскрипционный фактор м. вести себя по-разному в специфических местоположениях генов, т.к. отличающиеся поверхности и отличающиеся взаимодействующие кофакторы могут быть задействованы в зависимости от контекста промотора⁶⁶.

О деталях моделей кооперации между разными комплексами, которые регулируют транскрипцию и их упорядоченном рекрутировании на специфические генные промоторы с помощью транскрипционных факторов иных, чем ядерные рецепторы, см. Refs 32,67.

Динамичное рекрутирование различных ко-регуляторных комплексов связано со сходной динамикой связывания ядерного рецептора с собственным промотором. В самом деле, в последнее время устоявшееся мнение, что рецепторы остаются стабильно связанными со своими ДНК отвечающими элементами, поставлено под сомнение. ChIP анализ оккупации промотора ядерными рецепторами показал, что связывание рецепторов с ДНК характеризуется цикличностью привлечения и удаления^53-55 и, напр., в случае ERα соединения с промотором pS2, продолжительность каждого цикла составляет 15-20 мин.⁵⁵. Более того, photobleaching техника, которая используется для изучения оборота GR на синтетических промоторах, выявила более быстрые замены рецепторных молекул на ДНК, которые могут измеряться секундами^68,69. Хотя эти потенциальные различия могут возникать в результате отличий между анализируемыми ядерными рецепторами и в результате сравнения искусственных отвечающих элементов с эндогенными промоторами, мы полагаем, что ChIP данные вполне аккуратно отражают временные различия оккупации и не-оккупации промотора рецептором. Создается впечатление, что ультра-быстрые изменения каждой индивидуальной рецепторной молекулы на ДНК могут представлять собой "дыхание" ('breathing') этой высоко динамичной системы.

Интересно, что циклы рекрутирования и высвобождения наблюдались для разных ядерных рецепторов и ядерного фактора-κB (NF-κB), это указывает на то, что упорядоченное и циклическое привлечение различных компонентов транскрипционных комплексов может быть общим свойством промоторов, которые активированы с помощью индуцибельных транскрипционных факторов^16,53-55,70. AR-обеспечиваемая регуляция транскрипции, напр., использует быструю и циклическую сборку AR транскрипционного комплекса на промоторах prostate-specific antigen (PSA) и kallikrein-2⁵⁴. Это кинетическое поведение индуцибельных промоторов особенно интересно, т.к. продолжающиеся циклы ядерных рецепторов и ассоциированных с ними комплексов на индуцибельных промоторах могут представлять собой способ мониторинга внешних условий, которые осуществляют тонкий контроль экспрессии генов, находящихся под гормональной стимуляцией. Циклы рецепторов на промоторах д. допускать регулярные фазы очистки между каждым успешным циклом. Разумно полагать, что эти фазы очищения являются потенциальными регуляторными КПП (checkpoints), во время которых активация генов может быть быстро возвращена к обычному репрессированному состоянию не зависимо от продолжающейся стимуляции гормонами^55,70,71. Интересно, что комплексы SWI/SNF первоначально непосредственно привлекаются на промотор pS2 после активации эстрогеном, который индуцирует ремоделирование хроматина и способствует открытой конформации хроматина, которая является permissive для инициации транскрипции. Но позднее, после первого цикла связывания ядерного рецептора, SWI/SNF комплексы снова рекрутируются на промотор во время каждой фазы очищения, где они ассоциируют с HDACs и с NURD комплексом¹⁶. Это указывает на то, что циклическое рекрутирование факторов, ремоделирующих хроматин, может участвовать в воссоздании готовности (permissiveness) промотора к транскрипции.

Более того, циклы ядерных рецепторов могут быть не ограничены исключительно фазой, когда рецепторы активируются связыванием лиганда. Metivier и др. недавно предположили интересную гипотезу, согласно которой не связанные с лигандом ERα также подвергаются циклам на промоторе, и что эта неожиданная роль aporeceptor важна для поддержания генов мишеней 'готовых' к активации, когда произойдет стимуляция лигандом⁶¹. Это, по крайней мере, увеличивает сложность классической модели, согласно которой стероидные рецепторы удерживаются неактивными в цитоплазме вплоть до тех пор, пока стимуляция лигандом не запустит их диссоциацию из ингибирующих комплексов и их последующей ядерной транслокации.

Дальнейшие исследования, которые включают изучение ядерных рецепторов, которые связаны конституитивно с промоторами и отвечают на активную репрессию, такие как RAR или TR, необходимы, чтобы понять более полно правила. которые лежат в основе динамики связывания ядерных рецепторов с ДНК.

Циклический оборот ядерных рецепторов на регулируемых промоторах, по-видимому, коррелирует с активностью PROTEASOME-зависимой деградации, активностью хаперонов и событиями ремоделирования хроматина^55,69,72. Соответственно, деградация транскрипционных активаторов, часто необходимых для активации генов^54,55,73-77, и ядерных рецепторов, а также многих их ко-регуляторов, может ubiquitylated и регулироваться с помощью процессов белковой деградации^>78-83.

Значение ассоциации между активацией транскрипции и протеолизом активаторов не полностью ясно и является в чем-то противным здравому смыслу, т.к. следовало ожидать, что удаление активаторов будет коррелировать с негативным контролем транскрипции генов. Однако, как упоминалось выше, циклическое очищение от ядерных рецепторов может быть критическим, т.к. оно позволяет непрерывно пересматривать 'состояние клетки' - каждый цикл будет преодолевать исходную (default) программу транскрипционной репрессии, только если активирующие стимулы всё ещё присутствуют. Более того, место ubiquitylation и домен активации транскрипции перекрываются во многих транскрипционных факторах. Это открывает интригующую возможность, что событие ubiquitylation необходимо для лицензирования функции транскрипционных факторов, это тем самым связывает их активность с их деструкцией⁷³. Однако, имеются также случаи, при которых ингибирование протеосом, как сообщается, усиливают активацию транскрипции^84-86, это указывает на то, что роль деградации белка в регуляции транскрипции д.быть специфичной для клеток, ядерных рецепторов и даже промоторов⁸⁶.

Наконец, ингибирование активности протеосом может затрагивать многие клеточные процессы и, следовательно, интерпретация данных, полученных при использовании ингибирующих реагентов, в отношении специфических биохимических событий может быть обманчивой. Необходимы дальнейшие эксперименты для проверки роли событий специфической ubiquitylation и специфических компонентов ubiquitin-proteasome кухни (machinery).

Возможность переключения экспрессии генов с 'выкл' на 'вкл' и vice versa у живых организмов установлено более 50 лет тому назад. Работа Jacob and Monod показала, что бактерии могут отвечать на изменения в ростовой среде активацией или репрессией METABOLIC OPERONS , которые важны для использования альтернативных источников углерода⁸⁷. Базовая стратегия, которая регулирует этим критическим переключением законсервирована у высших эукариот, но молекулярные механизмы в системах млекопитающих используют дальнейшие уровни сложности, которые включают несколько регуляторных стратегий, которые кооперируют с навязыванием точного контроля генной экспрессии. Эти стратегии включают использование различных ДНК-связывающих активаторов и репрессоров, которые конкурируют за регуляторные области промоторов и/или ENHANCER области; модулирование (ингибирование или усиление) активности транскрипционных факторов; регуляцию внутриклеточной локализации транскрипционных факторов с помощью внешних сигналов; и аллостерическая регуляция активности транскрипционных факторов, таких как ядерные рецепторы, с помощью лигандов.

Corepressor-coactivator exchange. Связывание лиганда является критическим молекулярным событием, которое переключает функцию ядерных рецепторов с активной репрессии на активацию транскрипции, по крайней мере, в случае гетердимерных рецепторов, таких как RAR или TR, которые постоянно связаны с ДНК. Изучение взаимодействий между ядерными рецепторами и ко-регуляторами предоставило доказательства, что связывание гормонов индуцирует конформационные изменения в лиганд-связывающем домене рецепторов, которое приводит в результате к снижению сродства для ко-репрессоров и одновременно усиливает сродство к ко-активаторам (см Box 1). Сходным образом, связывание агониста со стероидными рецепторами, такими как ER, progesterone receptor (PR), GR или AR, также индуцирует приспособление специфической конформации, которая благоприятствует связыванию ко-активаторов, тогда как связывание анитогониста способствует взаимодействию с ко-репрессорами.

Однако, становится ясно, что имеются дополнительные и неожиданные уровни регуляции молекулярных событий, которые модулируют переключение ядерных рецепторов с репрессии на активацию (Рис. 4). В самом деле, рекрутирование кухни ubiquitylation и протосом-зависимой деградации репрессоров необходимо, по крайней мере, в случае NCoR-содержащего ко-репрессорного комплекса, чтобы полностью обеспечить удаление ко-репрессоров в ответ на связывание лиганда⁷¹. Следовательно, активация факторов nuclear corepressor exchange (NCoEx) д. представлять собой дальнейший уровень контроля, который заключается в поддержании более крепкой транскрипционной репрессии и в устранении нежелательной генной экспрессии. Этот уровень регуляции д. увеличивать амплитуду событий транскрипционной активации путем наложения репрессивного checkpoint. Интересно, что TBL1 и TBLR1 - NCoEx факторы, которые необходимы в качестве адапторов этой функции - являются компонентами NCoR и медиатора молчания рецепторов ретиноевой кислоты и тироидного гормона и рецепторов silencing mediator of retinoic acid and thyroid hormone (SMRT) ко-репрессорных комплексов, и необходимы для репрессии специфических транскрипционных единиц ^27,88,89. Это указывает на то, что т.к. необходимые компоненты этого действия, сигналы. которые способствуют индукции генов, д. активировать параллельные пути, чтобы активировать exchange machinery и высвободить репрессивный checkpoint. Сходные стратегии, по-видимому, используются также для регуляции высвобождения ко-репрессорной machinery с помощью др. транскрипционных факторов, как это описано в случае activator protein-1 (AP1) и NF-κB^70,71,90.

Очевидно, имеется множество общих элементов и сходств между этой зависимой от протеосом деградацией ко-репресооров и циклической деградацией ядерных рецепторов, это указывает на то, что, хотя они являются самостоятельными событиями, они могут быть тесно связаны. В самом деле, если периодические циклы рецепторов являются важными, чтобы обеспечивать непрерывную оценку гормонального состояния клетки, то возобновление репрессорного checkpoint в каждой фазе очищения, д. обеспечивать также тонкий контроль активации. Этот способ, для которого ubiquitylation и высвобождение ко-репрессоров являются критическими, не только во время первой ступени активации, но и в каждом цикле сборки рецептора на промоторе.

Если мы желаем оценить полностью всю тонкость регуляции транскрипционной активности ядерных рецепторов, то мы д. учитывать тот факт, что они не только способны отвечать на гормональную стимуляцию, но и они могут также интегрировать информацию, полученную от большого разнообразия внешних стимулов и от взаимодействий промоторов c ДНК-связывающими транскрипционными факторами под независимой регуляцией. Некоторые сигнальные пути, которые активируются с помощью различных онтогенетических и физиологических сигналов, были описаны как общающиеся (cross-talk) с реакциями, обеспечиваемыми ядерными рецепторами, посредством прямых и непрямых механизмов. Транскрипционная активность ядерных рецепторов модулируется с помощью индукции пост-трансляционных модификаций собственных рецепторов или их ко-регуляторных белков. Phosphorylation, acetylation, SUMOYLATION, ubiquitylation и methylation находятся среди модификаций, которые, как известно, модулируют функции ядерных рецепторов и которые потенциально составляют важный клеточный механизм интеграции. Было предположено, что эти модификации влияют на клеточную локализацию, ферментативную активность и стабильность targeted белков, и могут быть также важны для модуляции времени последовательного рекрутирования разных классов ко-регуляторов на одиночную транскрипционную единицу.

Детальное описание всех этих модификаций вне пределов целей этого обзора (см rev. Refs 30,91-94). Здесь мы остановимся на трех примерах - ядерных рецепторов (RAR), коактиваторе (cAMP-response-element-binding protein (CREB)-binding protein (CBP)) и ко-репрессоре (NCoR) - чтобы проиллюстрировать, как сигнальные пути могут быть интегрированы в специфические транскрипционные ответы (Рис. 5).

Три члена семейства RAR - α, β и γ - регулируют активацию и репрессию генов мишеней, функционируя как гетеродимерные партнеры для retinoic X receptors (RXRs) в ответ на all-trans-RA или её 9-cis изомер (9-cis RA). Их способность интегрировать сигналы от множественных сигнальных путей активно изучалась и были идентифицированы множественные сайты фосфорилирования. Активация protein kinase A (PKA), напр., оказывает функциональные эффекты на рецепторы благодаря непосредственному фосфорилированию законсервированного остатка Ser в LBD⁹⁵, тогда как DBD может быть фосфорилирован с помощью protein kinase C (PKC)⁹⁶, а обе N-терминальная и С-термнаальная области RAR содержат консенсусные сайты фосфорилирования для cyclin-dependent kinases (CDKs), mitogen-activated protein kinases (MAPKs) и для Jun N-terminal kinases (JNKs)^77,97-99.

Фосфорилирование N-конца RARα с помощью cyclin H-CDK7, которая ассоциирует с базовым транскрипционным фактором TFIIH, необходима для функционирования трансактивационного домена, AF1 (Ref. 99). Это указывает на то, что фосфорилирование этой области может быть важным для её взаимодействия с любым важным ко-регулятором - чтобы обеспечить функцию трансактивации AF1 - или для её непосредственного взаимодействия с базовой транскрипционной кухней (machinery). Дефекты статуса фосфорилирования RARα, обусловленые мутациями, которые затрагивают взаимодействие между рецептором и TFIIH , были идентифицированы у пациентов с xeroderma pigmentosum¹⁰⁰, тем самым были получены генетические доказательства важности этого регуляторного механизма. RARγ также обнаруживают сходную регуляцию с помощью CDK7 kinase, но в этом случае необходимо также фосфорилирование соседнего остатка с помощью p38MAPK для достижения полной транскрипционной активности^77,98.Интеесно, что эти события фосфорилирования важны для ubiquitylation и последующей деградации RARγ, хотя они, по-видимому, не играют роли в RARα ubiquitylation^77,101.

Транскрипционные ко-активаторы CBP и p300 участвуют в многочисленных регулируемых сигналами транскрипционных событиях, которые обеспечиваются разными ДНК-связывающими транскрипционными факторами. CBP был первоначально идентифицирован как партнер по взаимодействию с транскрипционным фактором CREB в ответ на передачу сигналов cAMP, a p300 был идентифицирован как ассоциированный с клетками фактор аденовирусного белка E1A. Интересно, что CBP и p300 могут способствовать транскрипционной активации и интегрировать вышестоящие сигналы посредством серии различных механизмов, которые включают не только активность по прямому ремоделированию хроматина с помощью ацетилирования гистонов, но и также ацетилирование др. факторов, прямое связывание с компонентами основной транскрипционной machinery и рекрутирование др. ко-регуляторов, таких как каркасные (scaffold) белки^102,103.

CBP и p300 являются хорошо известными phosphoproteins¹⁰⁴. Интересно, что их статус фосфорилирования, по-видимому, контролируется клеточным циклом; p300, напр., как было показано, фосфорилируется с помощью CDC2 и CDK2 kinases в физиологических процессах, которые д. быть обнаружены и блокированы с помощью аденовирусного белка E1A¹⁰⁵. А наблюдение, что транскрипционная функция p300 негативно регулируется с помощью cyclin E-CDK2, позволяет понять функциональное значение фосфорилирования CBP и p300 с помощью зависимых от клеточного цикла киназ¹⁰⁶. Интересная возможность заключается в том, что ферментативная активность CBP и p300 непосредственно модулируется как результат событий фосфорилирования, которые происходят во время хода клеточного цикла. Это было предположено Ait-Si-Ali et al.¹⁰⁷, которые сообщили, что HAT активность достигает пика во время G1/S TRANSITION, и что активность HAT у CBP усиливается с помощью C-терминального фосфорилирования, обеспечиваемого cyclin E-CDK2 , а также с помощью взаимодействия с E1A. Т.к. E1A, как известно, стимулирует фосфорилирование CBP и p300 (Ref. 108), то это указывает на интересную возможность, что вирусные онкобелки м. воспроизводить физиологические сигналы, которые активируют HAT функцию p300 и CBP. Однако, дальнейшие исследования необходимы для лучшего понимания механизмов этой регуляции, т.к. в некоторых сообщениях описан противоположный эффект, что взаимодействие с E1A ингибирует ферментативную активность CBP^109-111.

Др. киназы. которые включают PKA¹¹², Ca²⁺/calmodulin-dependent kinase IV (CaMKIV)¹¹³ и MAPK¹¹⁴, могут фосфорилировать разные остатки CBP, усиливая тем самым его активность по активации транскрипции. Напр., фосфорилирование с помощью p44 MAPK оказывает позитивный эффект на ферментативную активность CBP¹¹⁵. Напротив, фосфорилирование p300 с помощью PKC репресструет транскрипционную активность¹¹⁶, вообще-то это согласуется с противоположными активностями CBP и p300 на пролиферацию и реакцию на повреждения ДНК.

Интересно, что детальные исследования сигнальных путей, которые использовали исчерпывающий анализ по картированию мест фосфорилирования, выявили корреляцию между определенными модификациями точными функциональными эффектами: напр., фосфорилирование Ser301 в CBP с помощью CaMKIV необходимо для N-methyl-D aspartate (NMDA)-зависмой активации генов, чувствительных к CREB, в нейронах гиппокампа¹¹⁷.

Фосфорилирование определенно не является единственной модификацией, которая используется для интеграции сигнальных путей в регуляции функций ко-активаторов. Напр., метилирование с помощью CARM1 специфического домена CBP (KIX domain), который взаимодействует с kinase-interacting domain (KID) в CREB, как было показано, является важным для индукции диссоциации CBP от CREB, и для ингибирования CREB-зависимой активации транскрипции¹¹⁸. Юлдее того, p300 также ubiquitylatedи деградирует с помощью ubiquitin-proteasome пути во время дифференцировки клеток F9 эмбриональной карциномы. Интерсно, что p300 обнаруживает разные паттерны фосфорилирования в недифференцированных и дифференцированных клетках и меняет статус фосфорилирования, что обеспечивается с помощью PKA, затрагивающей его HAT активность только во время дифференцировки^119,120.

Хотя ко-репрессоры ядерных рецепторов NCoR и SMRT не обладают присущей им ферментативной активностью, каждый рекрутирует несколько др. ко-репрессоров, которые включают множество histone deacetylases¹²¹. В самом деле, имеются многочисленные самостоятельные NCoR и SMRT комплексы, которые были очищены биохимически ^{13,27,88,122,123}, но большинство компонентов, по-видимому, собирается, чтобы сформировать holoenzyme комплекс.

Некоторые киназы, включая MAPKs, AKT/protein kinase B (PKB) и casein kinase-2 (CK2), как было показано. модифицируют ко-репрессоры NCoR и SMRT и индуцируют их ре-локализацию из ядра в цитоплазму^30,124-126. Интересно, что некоторые из этих модификаций, по-видимому, специфичны или для SMRT или NCoR, это вносит пленяющий уровень специфичности в их регуляцию. Jonas and Privalsky показали, что SMRT негативно регулируется с помощью MAPK сигнальных путей в ответ на стрессы или ростовые факторы, тогда как NCoR не затрагивается с помощью этой регуляции¹²⁷. Сходным образом, ранние исследования показали, что статус фосфорилирования NCoR и/или ядерная локализация модулируются в ответ на CYTOKINES, такие как interleukin (IL)1β, или факторы дифференцировки, такие как ciliary neurotrophic factor (CNTF), тогда как SMRT ими не затрагивается^30,124.

Hoberg и др., которые анализировали депрессию генов мишеней для NF-κB, сообщали о непосредственном фосфорилировании SMRT с помощью ингибитора NF-κB (IκB) kinase α (IKKα) и его последующем ubiquitylation, удалении с репрессированных промоторов и ядерном экспорте⁷⁰. Это согласуется с наблюдением, что ubiquitin-зависмое освобождение и деградация ко-репрессоров необходимо для переключения с генной репрессии на активацию генов ядерных рецепторов и др. транскрипционных факторов ⁷¹, а также с наблюдением, что фосфорилирование белков обычно используется для маркирования белков на убиквитилирование с помощьюSCF E3 LIGASE COMPLEXES ¹²⁸. Интересно отметить, что SMRT рекрутируется обратно на промотор ~20-40 мин спустя после удаления вследствие фосфорилирования и ubiquitylation, это указывает на то, что упорядоченные волны рекрутирования ко-репрессоров также происходят на NF-κB-регулируемых промоторах⁷⁰. Это указывает на то, что, как это было показано выше для ядерных рецепторов, имеются checkpoints репрессии транскрипции, которые д. периодически запускаться для каждого цикла осуществляемой транскрипции. Интересно, что, IKKα также важна для усиления транскрипционной активации NF-κB-регулируемых генов при воздействии cytokine, потому что она может фосфорилировать гистон H3 по Ser10 и может модулировать последующее CBP-зависимое acetylation Lys14 (Refs 129,130). Это удивительный пример сигнального пути, который одновременно регулирует и удаление ко-репрессоров и усиление ко-активаторов, это указывает на то, что сходные стратегии скорее всего оперируют также при обусловленной ядерными рецепторами транскрипции.

Наконец, возможность регулирования локализации ко-репрессоров в клетках с помощью ядерного экспорта в ответ на специфические сигналы ставит интересный вопрос, может ли деградация NCoR и SMRT происходить непосредственно на уровне промотора, или удаляются с промотора вследствие phosphorylation/ubiquitylation, связанных с событием релокализации. Это событие ре-локализации может быть ассоциировано с хаперонами, такими как 14-3-3 белки, которые ограничивают деградацию NCoR и SMRT цитоплазмой или, по крайней мере, ядерными местами, не ассоциированными тесно с промоторами.

The nucleus is a cellular compartment that is crucial for coordinating the responses to diverse signals. At the level of transcriptional regulation, this coordination resides in numerous coactivators, corepressors and chromatin remodelling complexes that are recruited to their target genes by DNA-binding transcription factors. As these complexes have several functional domains, each of which is subject to modifications and interactions that can activate, nullify or switch their function, and as there are so many — literally hundreds — of components that can participate to form these complexes, the vast number of possible combinations allows for highly specific and flexible responses.вжTherefore, in this review, we have tried to show how this complexity translates into an exquisitely precise sequence of events that cooperate to achieve the precise regulation of gene transcription, which depends on promoter context, cell-cycle stage and regulatory signals. Indeed, each transcriptional activation event comprises a series of changes, such as DNA demethylation, histone modification, cofactor modification and so on, each of which alone might not be sufficient for full activation, but together converge to define a specific 'combinatorial code'. Furthermore, we have focused on the emergence of the rapid reprogramming of gene repression and activation as a major step in ligand-dependent gene regulatory events and have reviewed the most recent findings on the molecular mechanisms that mediate these events. Unfortunately, lack of space has not permitted a complete review of the phenotypic consequences of the deletion of single coregulators during development, as reported by several excellent in vivo analyses of mice models.

However, the more we learn about the regulation of nuclear receptor function, and as new and more powerful technologies become available to further study it, more novel, unexpected questions arise. For example, what distinguishes genes that respond to derepression alone from those requiring further ligand-dependent effects? How is the timing of the transcriptional response regulated? What are the molecular marks that permit the serial recruitment and release of distinct cohorts of coregulators? Which enzymatic components of coactivator and corepressor complexes function at transcriptional and post-transcriptional levels? How are these 'rules' of regulation applied on a genome-wide basis? Clearly, the stage is set for an exciting new season in which the secrets of nuclear receptor regulation will be further unravelled.