Центральная нервная система (ЦНС) высоко регионализирована вдоль переднее-задней ( anteroposterior – AP) и спинно-брюшной (dorsoventral – DV) осей. AP регионализация ЦНС подтверждается локализацией коры мозга и глаз на переднем конце, а спинного мозга – на заднем конце. Таким же образом разные нейроны и нейральные структуры возникают в особых DV областях нервной трубки. Например, двигательные и сенсорные нейроны формируются в вентральном и дорсальном спинном мозге соответственно, в головном мозге такие структуры как гипоталамус и substantia nigra (черная субстанция) позиционированы вентрально, тогда как кора мозга и мозжечок занимают дорсальное положение. Кроме того, скорость пролиферации, время дифференцировки нервных клеток и позиционирование аксональных связей находятся в тесной зависимости от положения клеток предшественников вдоль AP и DV осей ЦНС (1).

Такая сложная анатомическая организация зрелой ЦНС определяется молекулярной регионализацией нейроэпителия на ранних стадиях развития мозга. Нервная пластинка на ранних этапах развития уже разделена на сложные сети с молекулярно различающимися регионами, каждый из которых экспрессирует специфические транскрипционные факторы (2, 3). И хотя экспрессия этих танскрипционных факторов достаточно жестко ограничена AP и DV осями, некоторые из них ограничены единственным родоначальным доменом (progenitor domain). Можно сказать, что уникальная комбинация транскрипционных факторов экспрессируется со временем в каждом домене-предшественнике (4,5) и это те транскрипционные коды с помощью которых различаются отдельные регионы ЦНС.

Оказалось, что самые ранние этапы этого процесса менее сложны, чем последующие события, и недавно были выявлены некоторые общие закономерности. Во-первых, начальные этапы нейрального паттернирования контролируются секретируемыми внеклеточными сигнальными молекулами, которые разбросаны по всей нервной трубке. Активирование этих сигналов является пространственно-временным явлением и определяет специфические комбинации транскрипционных факторов, которые активируются в разных компартментах AP и DV центральной нервной системы. Во-вторых, имеется ограниченное число сигналов, участвующих в этом процессе, и многократное действие этих сигналов на разных уровнях AP и DV достаточно для объяснения паттернализации и регионализации ЦНС.

В данном обзоре обсуждаются новые сведения, полученные при изучении регионализации ЦНС. Основное внимание уделено сигнальным системам, контролирующим спецификацию вентральных клеточных типов по всей ЦНС, а также механизмам вентральной спецификации, действующим в спинном мозге, конечном мозге и глазу (РИС.1). Эти три структуры локализованы на разных AP уровнях ЦНС, но недавние исследования показали, что вентральное паттернирование всех этих структур может быть объяснено при помощи нескольких консервативных базовых молекулярных механизмов. Во-первых, для спецификации родоначальных доменов в ЦНС необходимы nodal и hedgehog (HH) сигналы и ингибирование сигнализирования костного морфогенетического белка (bone morphogenetic protein – BMP). Во-вторых, НН активность требуется, главным образом, для нейтрализации репрессивной формы GLI3 транскрипционного фактора. И, наконец, сигналы фактора роста фибробластов (fibroblast growth factor – FGF) также играют критическую роль в вентральном паттернировании ЦНC, особенно в спецификации большинства вентральных родоначальных доменов. Т.о., эти консервативные механизмы дают картину вентрального нейрального паттернирования, которая может быть применена почти для всей ЦНС. Авторы также обсуждают примеры того, как передача сигналов ретиноевой кислотой (retinoic acid – RA), FGF и НН может далее модулировать этот основной паттерн.

Hedgehog как сигнал вентрализации

Обширные экспериментальные данные, основанные как на gain- так и на loss-of-function подходах, выполненных на всех основных модельных системах – позвоночных (рыбах, лягушках, цыплятах и мышах), показали, что НН сигналы играют наиболее важную роль в детерминации судьбы вентральных клеток во всей ЦНС.

Hedgehog сигналы небходимы для вентрального паттернирования. Благодаря упорядоченному массиву доменов-предшественников по DV оси, спинной мозг является прекрасной модельной системой с помощью которой можно исследовать роль HH сигнализирования в процессе регионализации ЦНС. Нейроэпителий в вентральной половине спинного мозга дает начало пластинке дна и, по крайней мере, пяти важнейшим популяциям нейронов – двигательным нейронам (motor neurons - MNs) и V3, V2, V1 и V0 интернейронам (РИС.1,2a). Каждый из них происходит из отдельных DV родоначальных доменов, известных как pMN, p3, p2, p1 и p0 соответственно (8–10).

Sonic hedgehog (SHH) – член HH семейства секретируемых белков –экспрессируется в пластинке дна и нижележащей нотохорде . Исследования по сверхэкспрессии и функциональному ингибированию показали, что SHH являются необходимыми и достаточными для индукции пластинки дна и всех вентральных доменов-предшественников, за исключением, возможно, p0 домена и пластинки дна у полосатого данио (zebrafish) (см. обсуждение nodsl сигналов). Сверхэкспрессия SHH в нервной трубке вентрализирует спинной мозг, а инкубирование эксплантатов спинного мозга в среде с повышенным содержанием очищенного SHH белка in vitro приводит к более быстрому появлению в доменах-предшественниках вентральных признаков (8,9,11,12). Инкубирование же эксплантатов спинного мозга c анти-SHH антителами предотвращает вентральную спецификацию, а у мышиных эмбрионов с нокаутом по Shh отсутствуют пластинка дна, p3, pMN и p2 домены, а p1 и p0 клетки смещены к более вентральной части спинного мозга (8-10, 13, 14).

Если Shh является одним из генов, экспрессируемых в ЦНС амниотов, то Indian hedgehog экпрессируется вблизи полости эндодермы, что дает возможность остаточному НН сигнализированию детерминировать V1 и V0 нейроны у Shh–/– мышей (15). В соответствии с этой гипотезой клетки, у которых отсутствует smoothened ( SMO) – компонент НН сигнальной системы – нуждаются в сигналах всех НН белков, они не формируют пластинку дна, MNs или V3, V2 или V1 нейроны (15).Smo мутантные мыши погибают во время раннего эмбрионального развития, что не дает возможности проводить анализ нейронального DV паттернирования у этих эмбрионов. Но у химерных мышей, имеющих клетки Smo–/– и клетки дикого типа, Smo-мутантные клетки не приобретали судьбу, характерную для пластинки дна, p3, pMN, p2 или p1 доменов. И хотя некоторые V0 нейроны формировались из Smo-мутантных клеток, у них обнаруживали только аномальные вентральные позиции (15). Это предполагает, что для детерминации судьбы всего вентрального спинного мозга (возможно, за исключением некоторых V0 нейронов) необходима HH сигнальная система.

HH «вентрализирующая» активность распространяется и на развивающийся конечный мозг (16). Пузыри конечного мозга расположены в наиболее ростральном положении нервной трубки и подразделяются на дорсально локализованный паллиум (pallium - плащ головного мозга), формирующий кору, и вентрально локализованный subpallium, дающий начало базальным ганглиям (РИС.1). Вентральный конечный мозг, или subpallium, далее подразделяется на два основных домена – наиболее вентрально локализованный медиальный ганглионарный бугорок (medial ganglionic eminence - MGE), формирующий паллидум (pallidum), и наиболее дорсально локализованный латеральный ганглионарный бугорок (lateral ganglionic eminence - LGE), дающий начало стриатуму (РИС. 1, 2 b). Начиная со стадии гаструлы, Shh экспрессируется в ростральной мезодерме, лежащей ниже зачатка конечного мозга, а позже в дорсальном гипоталамусе и в самом вентральном конечном мозге (16-18). Сверхэкспрессия SHH или доминантно-активной формы SMO в развивающемся конечном мозге и инкубирование эксплантатов с SHH белком показали, что HH сигналы специфицируют как MGE, так и LGE идентичность (19-21). Нокаут гена Shh у мышей вызывал утрату MGE, тогда как некоторые ткани с LGE признаками сохранялись в наиболее вентральной части мутантного конечного мозга (это напоминает сохранение V1 и V0 нейронов в спинном мозге у Shh–/– мутантов) (21). Оказалось, что, как и в случае со спинным мозгом, для такой остаточной вентральной спецификации конечного мозга, требуется сниженная активность HH, т.к. вентральный конечный мозг целиком «дорсализируется» у нокаутных мышей, у которых Smo инактивируется во время развития конечного мозга (22).

Благодаря наружному положению в эмбрионе, популярной модельной системой для исследования паттернирования является глаз. На морфологическом уровне наиболее очевидное следствие DV регионализации глаза – это его подразделение на вентро-медиально расположенный зрительный стебелек (optic stalk - OS) и дорсо-дистально локализованная сетчатка. Сама же сетчатка имеет четкое DV паттернирование в присутствии choroid fissure на вентральном полюсе, вентрально-дорсальный градиент во время нейрогенеза сетчатки, асимметричное распределение некоторых дифференцированных типов клеток (таких как подтипы фоторецепторов) по DV оси и проекционный паттерн аксонов ганглионарных клеток в мозг, который в значительной мере зависит от положения ганглионарных клеток вдоль DV оси сетчатки (23, 24). На молекулярном уровне сетчатку можно подразделить по меньшей мере на три DV домена – OS (optic stalk), VR (ventral retina) и DR (dorsal retina) (25,26) ( РИС. 1,2c), каждый из которых экспрессирует разные комбинации транскрипционных факторов, хотя анализ других молекулярных маркеров предполагает наличие в сетчатке дополнительных субдоменов (27).

Нет ничего удивительного в том, что НН сигнальная система играет важнейшую роль в вентрализации глаза. Shh экспрессия в вентральной нервной трубке и лежащей ниже мезендродерме распространяется на нейральную и мезодермальную ткань, расположенную между глазами (7). Мыши, у которых отсутствует Shh, характеризуются циклопией, подтверждая тем самым то, что Shh необходим для расщепления (раздвоения) изначально сплошного глазного поля на два отдельных билатеральных домена, хотя этот эффект может быть и непрямым, т.к. аксиальная мезэндодерма, лежащая ниже ЦНС у этих мутантов, не развивается нормально (7, 14). Эксперименты по сверхэкспрессии у некоторых модельных позвоночных организмов показали, что НH сигналы могут индуцировать как OS, так и VR судьбу, репрессируя DR направление развития (26, 28-31). Обнаружение аномальной регуляции Hh у слепоглазковых рыб (cavefish) также разрешило проблему слепоты этих животных. У эмбрионов слепоглазых рыб Hh сигнализирование резко увеличено в ростральной срединной линии, что, и приводит к экспансии OS судьбы за счет домена сетчатки и в конечном итоге к подавлению формирование сетчатки ( 32, 23). В отличие от этого, спецификация вентральных структур глаза нарушено у smo мутантов полосатого данио (zebrafish) и у Shh мутантных мышей (14, 31). У полосатых данио Hh сигнализирование необходимо для спецификации как OS, так и VR признаков (31). У мышиных Shh мутантов также отсутствует экспрессия OS маркерных paired box gene 2 (Pax2) (14).

Механизм действия Hedgehog. Каким образом HH сигнализирование специфицирует отдельные родоначальные домены на разных DV уровнях ЦНС? В спинном мозге SHH экспрессируется в пластинке дна, тогда как экспрессия HH таргетирует ген patched 1 (Ptc1), что рассматривают как прямое «считывание» (readout) HH активности. Это определяется вентрально (высоким)-дорсальным (низким) градиентом в вентральной половине спинного мозга (9). Это подтверждает, что все шесть вентральных доменов детерминируются различными уровнями вентрально-дорсального морфогенетического градиента HH активности. В поддержку этой модели свидетельствует то, что эксплантаты спинного мозга, обработанные повышенной дозой очищенного SHH белка, индуцируют значительно более выраженную «вентральную судьбу» клеток (8,12).

Действительно ли HH сигналы действуют как долгосрочные морфогены в интактном спинном мозге или они работают как краткосрочные передаточные механизмы in vivo? В соответствии с первой гипотезой, сверхэкспрессия конститутивно активной формы SMO вентрализирует спинной мозг клеточно-автономным способом (34). Сходные результаты получены для активных форм транскрипционных факторов HH пути – GLI белков. Кроме того, GLI конструкции с высокой степенью активности приводили к тому, что трансфицированные клетки приобретали постепенно более вентральные признаки (35). И, напротив, сверхэкспрессия конститутивно активной формы PTC, репрессирующая НН сигналы, клеточно-автономным способом подавляет V3-V0 и MN судьбу в пределах их нормальных доменов и индуцирует эктопические V2, V1 и V0 нейроны в вентральном спинном мозге (36). Результаты этих экспериментов указывают, что HH сигналы действуют зависимым от концентрации способом, как долгосрочные диффундируемые факторы в вентральном спинном мозге непосредственно индуцируя разные типы клеток на значительном расстоянии от своего источника. Этот НН градиент концентрации транслируется в клеточно-автономную спецификацию разных вентральных «судеб», сортируя GLI активацию (или де-репрессию, см. ниже) внутри клеток мишеней. Замечательно то, что результаты timecourse анализа с активаторами и ингибиторами НН сигналов показали, что спинномозговые клетки интегрируют как уровень, так и продолжительность получаемого ими НН сигнала. Следовательно, возможно, что более «вентральная судьба» детерминируется в клетках-предшественниках, получающих как более высокую концентрацию, так и более длительный период HH сигналы (35).

Хотя прямое долгосрочное действие HH сигналов в конечном мозге и глазу не было продемонстрировано, вполне возможно, что, как и в спинном мозге, НН сигналы действуют также в соответствии с градиентом для контролирования регионализации вентрального глаза в OS и VR, поскольку высокие уровни НН придают области цельного глаза OS признаки, тогда как низкие уровни НН детерминируют VR признаки в DR без трансформации OS (26). Однако в отличие от спинного мозга, спецификация DV идентичности посредством НН сигналов в конечном мозге может больше зависеть от временн’ых изменений в реакции ткани конечного мозга на НН сигналы, а не от изменений уровней SHH активности. Например, SHH обработка ранних эксплантатов конечного мозга ведет к MGE судьбе, тогда как более поздние эксплантаты приобретают LGE судьбу, независимо от дозы SHH, которой они подвергались (19). Но это могут быть не столь сильные различия, как кажется на первый взгляд – исследования с использованием эксплантатов цыпленка также показали, что время является критическим фактором в регуляции ответа на НН, т.к. эксплантаты спинного мозга обладают более коротокой competence (жизнеспособностью), но требуют более длительной обработки НН для детерминации MN судьбы в сравнении с V2 спецификацией (37,38). Результаты недавних исследований у полосатого данио также подтвердили, что времен’ые изменения в реакции нейральных предшественников на НН сигналы влияют на выбор между MNs и клетками предшественниками олигодендроцитов (oligodendrocyte progenitor cells - OPCs). MNs и OPСs происходят из одного и того же родоначального домена (pMN), но продуцируются в разное время и MNs детерминируется раньше, чем OPCs (39). НН сигналы действуют последовательно – сначала индуцируют специфические домены- предшественники (pMN), затем переводят pMN предшественники в форму MNs и, наконец, участвуют в переходе pMN предшественников в OPCs (39).

Hedgehog-независимый путь

Недавно было сделано важное открытие, обнаружившее восстановление судьбы вентральных клеток у Shh и Smo мутантных эмбрионов мышей, у которых ген, кодирующий транскрипционный фактор GLI3, был инактивирован. В спинном мозге таких двойных мутантных эмбрионов только пластинка дна и p3 домены были утрачены. MNs, и V2, V1 и V0 нейроны еще генерировались, хотя MNs, V2 и V1 нейроны недолго формировали четкие обособленные популяции, а смешивались по всему вентральному спинному мозгу (10, 15, 40, 41) ( РИС. 3а). Т.к. отсутствие НН сигналов ведет к разделению GLI3, предположили, что основная роль НН сигнализирования – это ингибирование GLI3 с превращением его в репрессивную форму (42,43). Согласно этой гипотезе, компаундные мутантные мыши с полным отсутствием Gli генной активности имеют сходный, если не идентичный фенотип с Shh–/–; Gli3–/– и Smo–/–;Gli3–/– мутантами в вентральном спинном мозге (44, 45). Это исследование привело к переоценке роли НН сигнальной системы в регионализации спинного мозга. Сейчас полагают, что НН сигналы, осуществляющие свои функции через активированные формы GLI транскрипционных факторов, необходимы и для спецификации пластинки дна и р3 доменов, и для соответствующей экспансии и пространственной сегрегации pMN, p2, p1 и p0 доменов. Однако как только GLI3 репрессивная активность подавляется, спецификация MN–V0 клеток становится независимой от НН.

Судьба вентрального конечного мозга также восстанавливается у двойных мутантов мышей Shh–/–; Gli3–/– и Smo–/–;Gli3–/– и даже в большей степени, чем в спинном мозге. У таких двойных мутантов раннее паттернирование вентрального конечного мозга не нарушено, поскольку и MGE и LGE специфицируются почти так же как и в норме (16, 21) (РИС. 3b). Следовательно, в отличие от развития спинного мозга, во время раннего паттернирования конечного мозга НН сигналы требуются почти исключительно для угнетения GLI3 репрессорной активности и это не имеет значения как только инактивируется Gli3 ген. Вопрос о том, работают ли НН сигналы, противодействуя GLI3 репрессорной активности в глазу, пока не изучен. Однако Gli3 экспрессируется в области глаза на ранних стадиях развития (46). Более того, мыши Shh–/–; Gli3–/– генотипа не имеют такого циклопического фенотипа, который наблюдают у одиночного Shh мутанта (21). На основании результатов, полученных при исследованиях конечного мозга и спинного мозга, авторы предполагают, что DV паттернирование глаза будет частично восстановлено у Shh–/–; Gli3–/– и Smo–/–;Gli3–/– двойных мутантов.

Имеющиеся в настоящее время данные заставляют также предполагать, что НН сигналы не столь важны для вентральной спецификации в нервной трубке в отсутствии GLI3, за исключением спецификации наиболее вентральных доменов в спинном мозге. Это предполагает, что НН-независимые сигналы участвуют в вентральном паттернировании ЦНС. Недавние исследования показали, что BMP, nodal, RA и FGF сигналы играют важную роль в этом процессе. Как и для НН сигнализирования сейчас доказано, что эти пути нужны для многих и разных АР уровней ЦНС. Далее будет рассмотрена роль каждого из этих сигналов.

BMP антагонизм

BMP сигналы играют дополнительную роль в спецификации дорсальной судьбы в спинном мозге по отношению к роли НН сигнализирования в спецификации вентральной судьбы. BMPs экспрессируются в предполагаемой будущей нейроэктодерме до нейральной индукции, а затем в дорсальной нервной трубке и прилегающей к ней нейральной эктодерме, тогда как секретируемые BMP анатагонисты, такие как noggin, chordin и follistatin экспрессируются в нотохорде и параксиальной мезодерме, окружающей вентролатеральную нервную трубку (7, 13, 47). Полагали, что диффузия BMPs и их антагонистов создает дорсальный (высокий) и вентральный (низкий) градиент BMP активности, который специфицирует отдельные родоначальные домены в дорсальном спинном мозге. Результаты многих исследований показали, что увеличение или снижение передачи сигналов BMP в дорсальной нервной трубке соответственно расширяют или редуцируют спецификацию дорсальных клеточных типов (48-50), что поддерживает данную модель.

Однако в отличие от НН сигнализирования, которое как оказалось, не регулирует спецификацию клеточной судьбы в дорсальном спинном мозге, некоторые наблюдения подтвердили, что BMP сигналы могут влиять на паттернирование в вентральном спинном мозге. Во-первых, noggin- нокаутные мыши обнаруживают обширное истощение MNs и интернейронов в поясничном отделе спинного мозга, несмотря на нормальную экспрессию Shh в пластинке дна и нотохорде на этих АР уровнях (51). Во-вторых, инкубация эксплантатов спинного мозга с SHH и BMP7 снижала индукцию вентральной судьбы по сравнению с инкубацией только с SHH, а инкубация с SHH и фоллистатином имела противоположный эффект (52). В третьих, сверхэкспрессия хордина или фоллистатина в спинном мозге увеличивала вентральные домены, такие как пластинка дна и/или MNs за счет дорсальных доменов (52, 53). Удивительно то, что сверхэкспрессия хордина может существенно вентрализировать нервную трубку в комбинации с SHH в условиях, когда один SHH неэффективен (53). И, напротив, сверхэкспрессия конститутивно активных форм BMP рецепторов репрессирует спецификацию вентральных родоначальных доменов и усиливает спецификацию дорсальной судьбы (48). И, наконец, мутанты эмбрионов полосатого данио по специфическим Bmp белкам или сверхэкспрессии noggin показали экспансию вентральной судьбы за счет дорсальной (54,55). Эти результаты подтверждают, что даунрегуляция сигналов BMP в вентральном спинном мозге может быть важным этапом в предопределении вентральной судьбы. Однако эти данные не проясняют вопроса о том, является ли такой BMP антагонизм необходимым условием, «разрешительным» этапом, необходимым для вентральной спецификации другими сигналами или обладает ли регуляция BMP сигнализирования инструктивной ролью и достаточна сама по себе для спецификации (до некоторой степени) судьбы вентрального спинного мозга. В этом отношении представляет интерес то, что обработка SHH, а не BMP антагонистами, вентрализует эксплантаты спинного мозга in vitro (52).

В отличие от обсуждаемых выше экспериментов, нокаут BMP сигнализирования в спинном мозге мышей не вызывал экспансии вентрального судьбы за счет дорсального судьбы клеток, а вел лишь к изменениям судьбы клеток в наиболее дорсальном родоначальном домене спинного мозга (50). Если при таком нокаутном подходе BMP сигнализирование подавлялось позже при нейральном паттернировании, что увеличивало возможность влияния более ранних BMP сигналов на более вентральную судьбу, вполне возможно, что эффекты некоторых более ранних манипуляций с BMP сигнализированием могут быть непрямым следствием нарушения глобального DV паттернирования у эмбриона. Кроме того, все эти исследования были выполнены в присутствии функциональных HH сигналов, поэтому BMPs могут действовать косвенно десенсибилизируя клетки спинного мозга для воздействия HH сигналов. Показано также, что BMP поддерживает экспрессию Gli3 в эксплантатах спинного мозга, обеспечивая, таким образом, механизм, посредством которого BMP может противодействовать SHH активности (56). В заключении авторы отмечают, что роль BMP сигналов пока изучена недостаточно, хотя модуляция сигналов BMP вероятно, играет одну из важных ролей в вентральном патттернировании спинного мозга.

BMP сигналы участвуют также в паттернировании дорсального конечного мозга (57, 58) и подавление BMP сигналов, вероятно, необходимо для спецификации вентрального конечного мозга. Например, мутантные мыши, у которых отсутствуют обе копии гена chordin и одна копия noggin (59) или мыши с конвенционным нокаутом в ЦНС lowdensity lipoprotein-related protein 2 ( Lrp2, известным также как megalin) гена, который кодирует LDL-related receptor, участвующий в клеточном катаболизме BMP белков, имеют дорсализированный вентральный конечный мозг (60). Однако эти эффекты могут быть непрямым следствием измененного BMP сигнализирования, т.к. у обоих этих мутантов бэкграунд Shh и Fgf8 экспрессии даунрегулируется в переднем мозге, а нижележащая мезодерма у chordin/noggin мутантов может быть нарушена (58,60).

Результаты экспериментов у Xenopus показали, что обработка BMP ингибиторами эксплантата эктодермы из бластулы эмбриона не активирует экспрессию транскрипционного фактора Nkx2.1, маркера вентрального конечного мозга и промежуточного мозга, хотя и ведет к сильной индукции ткани переднего мозга. Такая обработка индуцировала ткань переднего мозга to WNT antagonists, которые необходимы для спецификации примордиума конечного мозга в ростральной части нервной пластинки (61), активировала экспрессию генов дорсального конечного мозга, но не Nkx2.1. Однако сильная индукция Nkx2.1 вызывалась обработкой BMP антагонистов в сочетании с FGFs, даже в отсутствии WNT антагонистов. И хотя эти эксперименты не прояснили вопроса о том, была ли эта Nkx2.1-позитивная ткань по своим характеристикам специфичной для конечного мозга (в противоположность промежуточному мозгу), они подтвердили, что подавление BMP сигналов в ранней эктодерме является необходимым, но не достаточным для детерминации судьбы вентрального конечного мозга (62).

У всех позвоночных модельных организмов BMP4 экспрессируется в наиболее дорсальной части зрительного пузыря, где, по крайней мере, у цыпленка антагонист BMP ventroptin экспрессируется в вентральной части глаза (30, 63). В соответствии с этим паттерном экспрессии, сверхэкспрессия BMP4 в глазу эмбриона цыпленка и Xenopus имеет большой дорсализирующий эффект, репрессирующий и OS, и VR судьбу и способствующий DR спецификации в вентральном глазу. В то же время сверхэкспрессия антагониста BMP репрессирует экспрессию DR маркеров и расширяет экспрессию VR и OS маркеров (30, 63-65). Удивительно то, что инактивация BMP рецепторов в сетчатке ведет к полной вентрализации (66). Эти результаты поддерживают гипотезу о том, что ингибирование BMP сигнализирования необходимо для спецификации вентральной судьбы глаза. Пока неясно, может ли градиентная модуляция BMP сигнализирования по разному воздействовать на спецификацию VR и OS.

На основании глубоких исследований по инактивированию BMP рецепторов в сетчатке мышей, предположили, что вентральная судьба сетчатки определяется «по умолчанию», а BMPs обеспечивают инструктивные сигналы для спецификации дорсальной судьбы (66). Однако HH, RA и FGF сигналы, вероятно, присутствуют в сетчатке этих мутантов. Следовательно, эффекты BMP подавления могут быть отчасти обусловлены сенсибилизацией сетчатки к вентрализирующим сигналам или редукцией GLI3 репрессорной активности в глазу.

Возможные эпистатические связи между BMP и другими сигнальными путями принимают участие в DV паттернировании глаза. Экспрессия BMP4 и ventroptin инициируется в зрительном пузыре позже, чем компоненты HH, RA и FGF сигнальных путей, которые экспрессируются в раннем глазном поле (26, 63,67), подтверждая, что модулирование BMP активности появляется downstream (раньше) других сигналов. В соответствии с этой гипотезой, сверхэкспрессия SHH или RA снижает, а подавление SHH или RA сигнализирования увеличивает BMP экспрессию в глазу цыпленка (68,69). Однако SHH или RA сверхэкспрессия не оказывает значительного эффекта на BMPs экспрессию в глазу Xenopus (30). Более того, сверхэкспрессия антагонистов BMP может индуцировать экспрессию RA-producing enzyme retinaldehyde dehydrogenase 3 (RALDH3; сейчас известного как ALDHLA3) и FGF8 в глазу цыпленка (64), хотя RALDH3 экспрессия не нарушалась соответствующей инактивацией BMP рецепторов в сетчатке мышей (66). Следовательно, возможно также, что агонисты BMP или антагонисты из других тканей, окружающих глазное поле, играют роль на более ранних стадиях в контроле DV паттернирования глаза.

Необычно то, что обработка BMP4 белком может активировать SHH и PAX2 экспрессию в рассеченной сетчатке мыши. При таком эксперименте активирование PAX2 посредством BMP4 предотвращается инкубацией с анти-SHH антителами, что указывает на то, что BMP4 регулирует PAX2 экспрессию в этом опыте непосредственно через SHH (70). Эти результаты подтверждают, что на некоторых стадиях развития глаза BMP сигналы могут участвовать в спецификации и/или поддержании вентрального предопределения глаза. Ясно то, что место BMP регуляции в цепи событий, ведущих к вентральной спецификации глаза достаточно существенно, и требует дальнейшего уточнения.

Nodal сигнализирование

Если BMP сигнализирование участвует, главным образом, в дорсализации ЦНС, члены другой подгруппы семейства transforming growth factor-β (TFGβ) - nodal белки, необходимы для правильного вентрального паттернирования. Поскольку мутация единственного гена Nodal нарушает формирование мезодермы и гаструляцию у мышей (71), мутанты полосатого данио являются более информативными для исследования роли этого пути в паттернировании ЦНС. Мутации у полосатого данио в гене cyclops (cyc), кодирующим nodal-related 2 (Ndr2), частично компенсируется за счет присутствия другого члена семейства - squint (Ndr1), поэтому гаструляция и формирование мезодермы (за исключением редуцированной прехордальной пластинки) еще встречается у cyc мутантов (72-74). Однако детерминация пластинки дна значительно нарушена у этих эмбрионов вдоль всей АР оси, что свидетельствует о необходимости nodal сигнализирования для спецификации, по крайней мере, более вентральной части ЦНС (73-76). Сходные эффекты вызываются зиготическими мутациями в генах, кодирующих one eyed pinhead (Oep; корецептор важный для нодального сигнализирования) и forkhead box h1 (Foxh1; ранее назывался Fast1; транскрипционный эффектор nodal сигнализирования). В этих случаях материнской экспрессии этих факторов достаточно для гаструляции и формирования мезодермы (за исключением прехордальной пластинки), но медиальная пластинка дна не формируется (77-82).

У всех других мутантов НН экспрессия в вентральной ЦНС почти полностью аннулирована. Значит nodal сигналы функционируют upstream (являются вышестоящими) HH при вентральном паттернировании ЦНС. В соответствии с этим сигнализирование nodal может прямо регулировать энхансерные элементы shhполосатого данио, чтобы управлять их экспрессией в вентральной нервной трубке (83). В вентральном конечном мозге мутации nodal или HH путей дают сходные эффекты, а активирование HH пути у мутантов nodal может спасти вентральную спецификацию конечного мозга. Т.е. nodal действует через HH сигналы при индукции этой структуры (18).

Как обсуждалось выше, во многих случаях nodal сигналы предопределяют вентральную судьбу ЦНС через индукцию экспрессии Shh. Однако бывают ситуации, при которых nodal оказывает прямое, HH-независимое действие при вентральном паттернировании ЦНС. Это наблюдается в случае с индукцией пластинки дна (84,85) и паттернировании гипоталамуса (17). Например, как обсуждалось ранее (84,85), nodal сигналы играют двойственную роль в вентральном спинном мозге, где они регулируют экспрессию Hh генов в вентральной нервной трубке и непосредственно специфицируют, по крайней мере, подтипы клеток пластинки дна. Хотя роль nodal в спецификации лучше всего изучена у полосатого данио, у которого ранняя индукция медиальной пластинки дна требует nodal сигналов, но, как оказалось, является Hh независимой (73-75, 86,87), имеются также доказательства, что nodal сигналы кооперируются с HH сигналами при индукции пластинки дна у амниот (88). И, наконец, активирование Hh пути может сохранить вентральную судьбу глаза у мутантов по nodal пути, а, значит, Hh работает ниже (downstream) nodal в вентральном глазу (31). Тем не менее, поскольку мутанты полосатого данио по nodal пути имеют гораздо более выраженную циклопию, чем мутанты по Hh пути (31), было бы интересно проверить, играет ли nodal прямую роль в паттернировании глаза, как это происходит в гипоталамусе и спинном мозге.

Сигналы ретиноевой кислоты (RA)

В спинном мозге RA может специфицировать р1 и p0 домены, которые локализованы в наиболее дорсальной части вентральной нервной трубки (89). RA-генерирующий фермент RALDH2 (сейчас - ALDHLA2) экспрессируется в сомитах мезодермы и может индуцировать VI и V0 нейроны при коньюгации с эксплантатами спинного мозга (89). Экзогенный RA мимикрирует индуцирующую способность сомитов мезодермы, а ингибирование RA рецепторов блокирует индукцию V1 и V0 нейронов через сомитную мезодерму. В соответствии с этим, у витамин А-дефицитных эмбрионов перепелки отсутствуют V1 нейроны и нарушена спецификация р1 и р0 родоначальных доменов (90) ( РИС. 4а). Экзогенный SHH белок может также индуцировать V0 и V1 нейроны в эксплантатах спинного мозга (89). Однако, как говорилось выше, некоторые V0 нейроны генерировались из Smo–/– клеток у мышиных химер по клеткам Smo–/– и клеткам дикого типа, хотя это встречалось только в наиболее вентральной части спинного мозга. Это подтверждает, что, по крайней мере, некоторые клетки могут развиваться в V0 нейроны при полном отсутствии HH сигнализирования (15). Кроме того, у Shh–/–;Gli3–/–, Smo–/–; Gli3–/– и Gli2–/–; Gli3–/– двойных мутантов мышей р0 домен специфицируется в правильном положении, тогда как р1, р2 и pMN домены перемешиваются (15, 40, 44, 45). Все эти результаты подтверждают, что спецификация р0 домена является HH – независимой и зависит от RA, секретируемой из сомитной мезодермы латеральнее по отношению к нервной трубке, тогда как в спецификации р1 домена участвуют и HH, и RA сигнальные системы.

Недавние исследования показали, что сходный механизм может работать в промежуточных областях конечного мозга и в глазу, что говорит о возможной роли RA в спецификации LGE и VR соответственно (26,91). Когда эксплантаты предполагаемой LGE ткани из куриного эмбриона обрабатывали антагонистами RA рецепторов, LGE спецификации не происходило. Ингибиторы HH, FGF и BMP сигнализирования были неэффективными в этом отношении. Экзогенные RA, напротив, могут индуцировать LGE признаки в эксплантатах предполагаемого дорсального конечного мозга или MGE, хотя она менее эффективна в вентральных эксплантатах. У интактных эмбрионов beads soaked в антагонистах RA рецептора, grafted рядом с предполагаемым конечным мозгом, подавляет нормальную LGE спецификацию ( РИС.4b), тогда как beads soaked в RA индуцирует появление признаков LGE в дорсальном конечном мозге. Эти результаты подтверждают необходимость RA сигналов для детерминации LGE. RA-генерирующий фермент RALDH3 экспрессируется в головной эктодерме рядом с промежуточной и вентральной областями конечного мозга, а это свидетельствует о том, что он может продуцировать RA, участвующий в паттернировании конечного мозга (91-93). Однако поскольку у Raldh3- нокаутных мышей отсутствует явный телэнцефалический фенотип, то вполне вероятно, что другие ферменты компенсируют отсутствие RALDH3 (обзор 94).

Обработка RA эмбрионов Xenopus, начатая в конце гаструляции, может вызывать вентрализацию сетчатки. У этих эмбрионов OS спецификация также репрессирована, вероятно, из-за даунрегуляции экспрессии Shh в ростральной срединной линии (26). Эти результаты подтверждают, что RA может предопределять VR судьбу даже в отсутствии (или при значительно сниженном уровне) HH активности, хотя эксперименты по ко-экспрессии показали, что HH и RA сигналы могут также действовать совместно при вентрализации глаза Xenopus (26). В этом же исследовании показано, что подавление лишь одного RA сигнализирования не оказывает такого выраженного эффекта на DV паттернирование глаза. Тем не менее, такое подавление усиливало дорсализацию глаза в комбинации с ингибированием HH и FGF сигнализирования. Частичная дорсализация сетчатки также была доказана, когда RA и FGF, но не HH, сигнальные системы были подавлены одновременно (26), а это говорит о том, что функциональных HH сигналов недостаточно для должной VR спецификации (31, 68). Подавление ингибирования RA сигнализирования у куриного и мышиного эмбрионов сверхэкспрессией доминантно-негативных RA рецепторов или двойной нокаут по Raldh1 и Raldh3 незначительно изменял раннее DV паттернирование сетчатки (95,96).

Все эти результаты свидетельствуют о том, что HH, RA и FGF сигнальные пути влияют на VR спецификацию, однако необходимы дальнейшие исследования для выявления роли каждого из этих путей.

RA может также обладать широкими функциями при вентральном паттернировании ЦНС. В эксплантатах спинного мозга куриного эмбриона RA сигналы способствуют MN спецификации в сочетании с HH или FGF сигналами, но в то же время противодействует HH-опосредованной индукции p3 судьбы (97). Это согласуется с исследованиями in vitro - у витамин А-дефицитных эмбрионов перепела MNs редуцированы в числе, а более вентральные территории расширены (90,98). У эмбрионов Xenopus RA может способствовать индукции OS признаков при низких дозах и репрессировать OS при высоких дозах, индуцируя в то же время VR признаки (26). В вентральном конечном мозге куриного эмбриона RA может подавлять MGE спецификацию, но способствовать появлению LGE признаков (91). Эти наблюдения подтверждают консервативную стратегию RA-опосредованного вентрального паттернирования на разных АР уровнях ЦНС. Оказалось, что слабое или отсутствие RA сигнализирования предопределяет более вентральную судьбу как p3 в спинном мозге, так и MGE в VT и OS в глазу. Высокие же уровни RA, напротив, подавляют спецификацию такой вентральной судьбы, способствуя индукции более дорсальной судьбы, такой как pMN, p1 и p0 в спинном мозге, LGE в конечном мозге и VR в глазу.

Сигналы фактора роста фибробластов

Недавние исследования показали, что FGF сигналы играют совершенно определенную роль в вентрализации конечного мозга и глаза. FGF, и особенно FGF3 и FGF8, экспрессируются как в переднем нервном гребне, начиная со стадии ранней нейруляции, и затем позднее – в вентромедиальном конечном мозге (7). У полосатого данио Fgf3 и Fgf8 необходимы для спецификации вентрального конечного мозга – у Fgf3/8-обедненных (morpholino-injected) эмбрионов маркеры вентрального конечного мозга репрессированы, а гены дорсального конечного мозга экспрессируются эктопически (99, 100). Мышиные FGF8 мутанты погибают во время гаструляции и не могут быть изучены во время развития конечного мозга (101). Однако мышиные GLI3 мутанты, у которых передняя часть дорсального конечного мозга вентрализирована, апрегулируют (upregulate) FGF8 экспрессию в дорсоростральной области, где экспрессируются эктопические маркеры (102), а это подтверждает, что FGF сигналы могут участвовать в вентрализации. В соответствии с этим FGF8- soaked beads, трансплантированные в эксплантант дорсального конечного мозга мыши, индуцируют эктопическую экспрессию вентральных маркеров. Следует заметить, что этот эффект не предотвращается подавляющими HH сигналами, а это говорит о том, что FGF8 может специфицировать судьбу вентрального конечного мозга HH-независимым способом (102).

Результаты экспериментов, выполненные на курином эмбрионе, также подтвердили, что в вентральном конечном мозге FGF сигнализирование необходимо для поддержки MGE и репрессии LGE судьбы. Будущие LGE трансплантанты, инкубированные c FGF8, более не приобретали LGE идентичности, тогда как проспективные MGE эксплантанты, инкубированные с ингибиторами FGF8 сигнализирования, приобретали LGE признаки (91). FGF8 может также блокировать индукцию признаков LGE через RA в эксплантатах дорсального конечного мозга, т.е. сигналы FGF сохраняют MGE признаки в наиболее вентральном конечном мозге через предотвращение RA-индуцированной LGE спецификации в этой области (91). Кроме описанной паттернирующей активности, обработка клеток вентрального конечного мозга FGF предупреждает образование дифференцированных нейронов и усиливает клеточную пролиферацию (20), что подтверждает роль FGF сигналов в задержке дифференцировки предшественников конечного мозга.

FGF, экспрессируемый в ростральной нервной пластинке, может также влиять на паттернирование глазного поля, а FGF8 экспрессировался в OS во время формирования глаза (7, 26). Эксперименты по сверхэкспрессии у Xenopus показали, что FGF сигнализирование, опосредованное FGF рецептором 1 (FGFR1), может увеличивать OS за счет сетчатки, но не может эффективно модифицировать DV паттернирование сетчатки (26). Подавление Fgf3 и Fgf8 функции у эмбриона полосатого данио лишь слегка нарушает спецификацию вентрального глаза (31, 100). Однако это может быть обусловлено избыточности Hh и RA сигналов, что подтверждается экспериментами, обсуждаемыми выше, при которых два или три пути были одновременно подавлены у Xenopus (26). FGF сигналы также необходимы для поддержания экспрессии некоторых генов вентрального глаза у мутантов полосатого данио, у которых всё nodal и Hh сигнализирование утрачено (31). FGFs взаимодействует с HH сигналами при вентральной спецификации глаза. В экспериментах со сверхэкспрессией у Xenopus FGFs и HH усиливали активность друг друга (26), а у рыбки японской медаки ( Oryzias latipes) сигналы Fgf необходимы для вентрализующей активности Shh в глазу (103). Однако пока неясно, требуется ли FGF сигнализирование только для OS спецификации или участвует также и в DV паттернировании сетчатки. Удивительно то, что тогда как FGF сигнализирование противодействует нейральной дифференцировке в спинном мозге и вентральном конечном мозге, он активирует нейрогенез сетчатки (104). Как было сказано ранеt, хорошо известна роль FGF сигнальной системы в индукции вентрально-клеточной судьбы конечного мозга и глаза. В спинном мозге FGF сигналы поддерживают каудальную родоначальную зону во время удлинения оси, а даунрегуляция FGF сигнализирования нужна для нейрального паттернирования и дифференцировке на более ростральном уровне (105). Т.о., на первый взгляд кажется, что функции FGF сигналов могут значительно различаться между передними и задними областями ЦНС.

Однако недавние исследования выявили роль FGF сигналов при детерминации судьбы вентральных клеток, особенно MNs в спинном мозге, где FGF действует совместно с НН и RA сигналами (97). pMN домен идентифицируется по экспрессии своего специфического транскрипционного фактора ( РИС.2а). Эксперименты по сверхэкспрессии показали, что HH сигналы могут активировать экспрессию генов, участвующих в спецификации как pMN, так и p3 доменов. А на выбор между этими двумя разными судьбами может повлиять RA и FGF сигналы. Например, RA вместе с HH управляют спецификацией, главным образом, pMN судьбы. Однако в присутствии низких доз экзогенного FGF HH специфицирует в основном судьбу p3 (97). И хотя высокие дозы FGF могут предотвращать индукцию судьбы вентрального спинного мозга через HH, RA и FGF (высокие дозы) совместно могут индуцировать pMN –специфическую генную экспрессию даже в присутствии HH ингибиторов (97). Эти pMN-позитивные клетки могут позже переходить в MN дифференцировку, если FGF удаляется из культуральной среды. Более того, RA и FGF могут кооперироваться при индукции двигательных нейронов в дорсальном спинном мозге in vivo (97). Все эти данные подтверждают, что FGF сигнальная система способна также модулировать вентральное паттернирование в спинном мозге. В заключении авторы отмечают, что хотя участие FGF сигналов в спецификации вентральной судьбы в целом консервативно во всей ЦНС, имеются некоторые различия в способе его действия на разных АР уровнях. К примеру, FGF сигналов достаточно для вентрализации ранней нервной ткани в конечном мозге или в глазу. Однако в спинном мозге, где FGF сигналы могут модулировать вентральное паттернирование посредством HH или RA (97), изначально они поддерживают зону каудальных предшественников, удерживая клетки от преждевременного реагирования на сигналы, детерминирующие DV паттернирование спинного мозга (105). Кроме того, когда FGF сигналы задерживают нейральную дифференцировку в спинном мозге или вентральном конечном мозге, они способствуют инициации дифференцировки в глазу (20, 98, 104). И, наконец, FGF сигналы взаимодействуют с HH и RA сигналами сложным и зависимым от ситуации способом – они работают совместно с HH сигнальной системой (спинной мозг и глаз) (26, 97), препятствуют НН сигнализированию (спинной мозг) (97), действуют независимо от HH сигналов (спинной мозг и вентральный конечный мозг) (97, 102), действуют совместно с RA сигналами (спинной мозг) (97) и препятствуют RA сигнализированию (спинной мозг и вентральный конечный мозг) (91, 98).

Заключение и перспективы

В течение последних лет сложные генетические и молекулярные методы дали возможность значительно улучшить наши познания в области дорсо-вентрального (DV) паттернирования ЦНС на самых разных модельных системах. Наиболее интересным оказалось то, что спецификация вентрального спинного мозга, конечного мозга и глаза имеет сходные принципы и сходные молекулярные механизмы. А это свидетельствует о том, что DV спецификация является высоко консервативной вдоль передне-задней оси нервной трубки ( РИС.2). В соответствии с этими представлениями, HH и nodal участвуют в паттернировании гипоталамуса (17), а НН и FGF – в DV паттернировании на границе среднего и заднего мозга (103, 106). Все эти результаты предполагают, что основная молекулярная цепь контролирует вентральное паттернирование и регионализацию во всей ЦНС (РИС.5), хотя RA, FGF и НН сигнализирование может в дальнейшем модулировать этот базовый паттерн контекст-зависимым способом. Ключевые аспекты этой цепи включают градационное подавление GLI3-repressor и BMP активности через НН сигналы и BMP антагонисты соответственно, участие RA сигнализирования в спецификации промежуточных доменов-предшественников, локализованных вблизи границы между вентральной и дорсальной ЦНС, и участие FGF сигналов в спецификации наиболее вентральных доменов-предшественников.

Если молекулярные механизмы консервативны в ЦНС у разных моделей, то возникает вопрос – отражает ли это общность происхождения разных участков ЦНС во время эволюции или одни и те же сигналы кооперируются на разных уровнях ЦНС? И хотя известна консервативность сигнальных путей, описанная для гнатостомных (gnathostome) позвоночных организмов, пока неясно, распространяется ли такая консервативность на других хордовых. Например, несмотря на то что нервная трубка асцидий имеет DV компартмент, экспрессирующий гены сходные с генами нервной трубки позвоночных (107), MNs у асцидий детерминирется как nodal, так и BMP сигналами в дорсо-латеральной нервной пластинке (108, 109). Это существенно отличается от спинного мозга позвоночных, где MNs формируют вентро-медиальную нервную пластинку, а nodal и BMP сигналы играют роли антагонистов (nodal вентрализирующую, BMP – дорсализирующую). Следовательно, было бы интересно определить, консервативны ли какие-либо механизмы у не-позвоночных хордовых организмов. Вероятно, значительный прогресс будет достигнут в ближайшие годы как в исследовании эволюционного пути, так и в детализации ЦНС паттернирования. В конечном итоге, эти исследования приведут к разработке методов лечения нарушений ЦНС и нейродегенеративных расстройств у человека. Не так давно было показано, что стволовые эмбриональные клетки могут быть «направлены» для формирования моторных нейронов (110) или вентральных нейронов конечного мозга (111), при использовании некоторых молекулярных сигналов, описанных в данном обзоре, а это увеличивает шансы практического использования этих молекул в лечении заболеваний человека.

Некоторые добавления

В недавней статье Ribes et al. показано, что RALDH2-опосредованные RA сигналы регулируют FGF и SHH сигнализирование в переднем мозге мышей (112). В другой статье авторы представили данные о DV паттернировании глаза у эмбрионов SHH и GLI компаудных мышиных мутантов (113).

Литература