Посещений:
Некодирующие РНК

Регуляция Транскрипции

Non-coding-RNA regulators of RNA polymerase II transcription
James A. Goodrich and Jennifer F. Kugel
NATURE REVIEWS | MOLECULAR CELL BIOLOGY VOLUME 7 | AUGUST 2006 |No 8, P. 612-617 | doi:10.1038/nrm1946

Several non-coding RNAs (ncRNAs) that regulate eukaryotic mRNA transcription have recently been discovered. Their mechanisms of action and biological roles are extremely diverse, which indicates that, so far, we have only had a glimpse of this new class of regulatory factor. Many surprises are likely to be revealed as further ncRNA transcriptional regulators are identified and characterized.


Рис.1.  | The structure of a non-coding RNA is crucial for its function.


Рис.2.  | Eukaryotic RNA polymerase II transcription is a complex process that can be regulated at many points.


Box 1  | Non-coding RNAs that target chromatin to silence mRNA transcription


Box 2  | Regulation of RNA polymerase II transcription by the mRNA transcript


Box 3  | Using RNA aptamers to control RNA polymerase II transcription

Табл.1 Название

DATABASES

The following terms in this article are linked online to:

Entrez Gene: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query. fcgi?CMD=search&DB=gene 7SK | SRA | Tat | Tax | Xist

UniProtKB: http://ca.expasy.org/sprot eEF1A | HEXIM1 | HSF1 | REST
В биологии возникла новая парадигма, согласно которой РНК молекулы являются активными участниками в регуляции, катализе и контроле многих реакций, которые определяют фундаментальные процессы в клетках - роли, которые в недавнем прошлом отводили белкам. В общем РНК, которые обладают такими регуляторными функциями, не кодируют белков и поэтому называются non-coding RNAs (ncRNAs). Эукариотические ncRNAs транскрибируются геномом с помощью одной из трех ядерных, ДНК-зависимых RNA polymerases (Pol I, II или III). Затем они обнаруживают свои биологические реакции посредством одного из 3-х базовых механизмов: катализируя биологические реакции, соединяясь с и модулируя активность белка, или спариваясь с основаниями нуклеиновой кислоты мишени. Для первых двух механизмов, ncRNAs укладывается в уникальную структуру высщего порядка, которая необходима для её функции, подобно белку (FIG. 1). Многие ncRNAs становятся интегральными частями крупных комплексов, которые содержат белки и возможно др. РНК и компоненты комплекса функционируют вместе как единица (напр., рибосома). ncRNAs, как было показано, активно участвуют в разнообразных биологических реакциях, которые сопровождают генную экспрессию, такие как сплайсинг, оборот мРНК, молчание генов и трансляция1.
Некоторые исследования недавно установили, что ncRNAs также активно регулируют транскрипцию мРНК эукариот, что является ключевой точкой для контроля генной экспрессии. В эукариотических клетках транскрипция мРНК является сложным процессом, который тесно и во времени регулируется в ответ на многочисленные сигналы и связан с оркестровкой совместной игры ДНК, множества белковых компонентов и самих транскриптов РНК (FIG. 2). Реакция транскрипции катализируется с помощью Pol II энзима, который синтезирует копию мРНК с каждого белок-кодирующего гена. Эукариотические ДНК и гистоны упакованы в высоко конденсированную структуру, которая известна как хроматин и структура хроматина динамически участвует в регуляции транскрипции мРНК2. Элементы ДНК, которые контролируют транскрипцию, содержат промоторы. Промоторы являются областями генов, которые содержат последовательности, которые связывают активаторы транскрипции и репрессоры3, а также Pol II общие транскрипционные факторы, которые, как полагают, необходимы для транскрипции всех генов4. Различные наборы ко-регуляторов обеспечивают активацию и репрессию, часто наводят контакты между регуляторами и общей транскрипционной кухней (machinery)5. Все эти компоненты действуют совместно, чтобы обеспечить уровень транскрипции для каждого гена, которые предоставляет почти безграничные мишени для регуляции. Однозначно, что ncRNA регуляторы транскрипции, которые были идентифицированы, также являются мишенями для множества различных компонентов транскрипционной реакции и осуществляют свои эффекты посредством уникальных механизмов. Мы полагаем, что ncRNAs выполняют множество ролей по регуляции эукариотической транскрипции, которые еще предстоит открыть. Последующее обсуждение подчеркивает, что натуральные ncRNAs, которые были открыты как контролирующие Pol II транскрипцию в транс-положении, осуществляют это путем целенаправленной поставки транскрипционных активаторов и рецепторов, общих факторов, самой Pol II или хроматина (BOX 1). Некоторые из ncRNAs тесно связаны с недавно открытыми функциями, тогда как др. являются новыми знакомыми. По нашему мнению многие неожиданные открытия ожидают нас в увеличивающейся области ncRNA регуляторов Pol II транскрипции.

Targeting activators and repressors


Транскрипционный контроль осуществляется в результате действия активаторов и репрессоров, которые соединяются сиквенс-специфическим образом с промоторами генов3. Для достижения транскрипционной регуляции в клетках необходимо, чтобы активаторы и репрессоры взаимодействовали с др. факторами, включая ко-активаторы, ко-репрессоры, общие транскрипционные факторы и Pol II (REF. 5). Помимо этих взаимодействий, регуляция транскрипции может также испытывать влияние со стороны типа клеток и от внутриклеточной локализации активаторов и репрессоров, которые в конечном счете контролируются внеклеточными стимулами и сигнальными путями.
Четыре эукариотических ncRNAs, которые как известно нацеливают активаторы и репрессоры, осуществляют транскрипционный контроль, используя разные механизмы: действуя как ко-активатор, меняя регуляторные свойства репрессора, регулируя олигомеризацию и активность активатора и путем контроля внутриклеточной локализации активатора. ncRNAs, которые обсуждаются, отличаются также в отношении своего размера, паттерна ткане-специфической экспрессии и биологической функции. Идентификация этих ncRNAs отвечает на важные биологические вопросы о транскрипционном контроле и вызывает множество вопросов о потенциальном размахе ncRNAs в таргетинге активаторов и репрессоров транскрипции мРНК.
SRA functions as a co-activator. Steroid receptor RNA activator (SRA) является натуральной ncRNA. которая функционирует как транскрипционный ко-активатор для некоторых рецепторов стероидного гормона6. Примерно в 700-нуклеотидов SRA было идентифицировано в дрожжевом двугибридном скрининге факторов, которые взаимодействуют с доменом рецептора progesterone у людей и активируют транскрипцию. Интересно, что инициальная характеристика SRA позволила предположить, что фактор был белком. Однако, эксперименты в конечном итоге показали, что фактор функционирует как ncRNA. SRA оперирует как часть рибонуклеопротеинового комплекса. Важно, что сама РНК необходима для комплекса, чтобы ко-активировать транскрипцию с помощью различных ядерных гормональных рецепторов6 (FIG. 2). Более недавние исследования по структурному моделированию и делециям показали, что разные мотивы последовательностей, которые разбросаны по всей SRA, необходимы для ко-активации транскрипции7. Механизм, с помощью которого это происходит, понят не до конца. Если SRA действительно функционирует как ncRNA транскрипционный ко-активатор, то возможно осуществляет это за счет непосредственных контактов с компонентами общей транскрипционной кухни, соединяя тем самым ядерные гормональные рецепторы с сердцевиной промотора.
NRSE RNA changes a repressor. Малая ncRNA - neuron-restrictive silencer element double-stranded RNA (NRSE dsRNA) - как было установлено, активирует экспрессию нейрональных генов в стволовых клетках. Она модулирует активность транскрипционного репрессора и тем самым стимулирует стволовые клетки дифференцироваться в нейроны8. NRSE dsRNA является ~20-base-pair dsRNA. Она была идентифицирована благодаря комплементарности своих последовательностей с промоторным элементом, который соединяется с репрессорным белком NRSF/REST (neuron-restrictive silencing factor/RE-1-silencing transcription factor) чтобы замалчивать транскрипцию нейрон-специфических генов в не-нейрональных клетках. NRSE dsRNA, по-видимому, действует не за счет спаривания оснований с промоторным элементом, с которым она обладает гомологичными последовательностями, а скорее она функционирует посредством прямого взаимодействия РНК-белок между NRSE dsRNA и репрессором NRSF/REST8 (FIG. 2). Это взаимодействие активирует нейрон-специфические гены, которые всё ещё имеют NRSF/REST, связанный с их промотором и эффективно превращает репрессор в транскрипционный активатор. Было предположено, что NRSE dsRNA предохраняет NRSF/REST от ассоциации с его известными ко-рецепторными белками8.
HSR1 triggers activator trimerization. Heat-shock RNA-1 (HSR1) является человеческой ncRNA, которая мобилизует транскрипционный активатор heat-shock-factor protein-1 (HSF1) в ответ на тепловой шок9. HSF1 существует в виде мономера до тех пор, пока клетки не подвергнется стрессу, при этом белок тримеризуется. Тримерный HSF1, но не мономерный HSF1, соединяется с промотором генов, индуцируемых тепловым шоком и активирует транскрипцию. HSR1 существенно стимулирует тримеризацию HSF1 и связывание с ДНК9 (FIG. 2). HSR1 не работает сама по себе, а действует в партнерстве с хорошо известным фактором трансляции, белком eEF1A (eukaryotic translation-elongation factor-1A). Судьба HSR1 после тримеризации HSF1 неясна, но существует интригующая возможность, что эта ncRNA ассоциирует с HSF1 тримерами на промоторах генов и играет непосредственную роль в активации транскрипции. Эти недавние находки выявили новую функциональную конвергенцию фактора трансляции, ncRNA и фактора транскрипции.
NRON RNA regulates nuclear trafficking. Клеточный скрининг ncRNAs, которые д. модулировать активность транскрипционного активатора NFAT (nuclear factor of activated T cells) идентифицировали NRON (non-coding repressor of NFAT)10. NRON является значительно длиннее, чем большинство регуляторных ncRNAs. Northern blot анализ выявил транскрипты, которые варьируют в пределах 2-4 kilobases в длину, возможно ищ-за альтернативного сплайсинга. Экспрессия NRON высоко ткане-специфична и она многочисленна в лимфоидной ткани, что согласуется с её ролью в модуляции NFAT10. Уникально то, что NRON не нацелена на свойства активации транскрипции NFAT, а вместо этого, по-видимому, регулирует его ядерную локализацию. В ответ на внеклеточные сигналы NFAT дефосфорилируется и локализуется в ядре. NRON, по-видимому, посредством взаимодействий с различными факторами ядерного транспорта, нарушает ядерную локализацию NFAT, препятствуя тем самым активации им транскрипции10 (FIG. 2). Необходимы дальнейшие эксперименты, чтобы понять механизм, с помощью которого действует NRON и чтобы выявить разнообразие ncRNAs, которые могут контролировать ядерную локализацию транскрипционных факторов.

Targeting general factors


Общие факторы, как полагают, необходимы для транскрипции всех генов. Сюда входят транскрипционные факторы TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF и TFIIH, которые облегчают формирование комплекса инициации с Pol II на промоторах11. Сюда входят также факторы, такие как TFIIS и P-TEFb (positive transcription elongation factor-b), которые облегчают элонгацию транскриптов12. Одной из головоломок, связанных с ncRNA, которые нацелены на общие факторы, является вопрос, затрагивает ли она транскрипцию всех генов или функционирует ген-специфическим образом нахождения генерального фактора только на избранных промоторах. Идентифицированы две натуральные ncRNAs, которые нацелены на общие факторы. Более того, некодирующие области первичных транскриптов сами по себе могут регулировать элонгацию (BOX 2).
U1 RNA stimulates initiation. В поиске ncRNAs у людей, которые ассоциируют с общими транскрипционными факторами была найдена РНК ы ~160-нуклеотидов, которая очищалась совместно с мультисубъединицным транскрипционным фактором TFIIH13 (FIG. 2). Секвенирование выявило, что эта U1 РНК, является малой ядерной ncRNA, которая транскрибируется с помощью Pol II и обладает прототипической функцией в сплайсинге. Дальнейшие биохимические эксперименты показали, что U1 РНК соединяется непосредственно и специфически с cyclin-H субъединицей TFIIH13. Поперечное связывание было отслежено с помощью триптического переваривания и масс спектрометрии и было использовано для картирования областей U1 РНК и cyclin H, которые взаимодействуют14. U1 РНК, ede оказалось, может стимулировать как инициацию транскрипции с помощью Pol II in vitro , так и киназную активность TFIIH, за счет которой фосфорилируется С-терминальный домен (CTD) крупной субъединицы Pol II (REF. 13). Однако, в точности, как U1 РНК регулирует транскрипцию в клетках ещё необходимо установить. Возможно, что U1 РНК действует как общий регулятор функции TFIIH на всех промоторах, вообще-то путем сцепления транскрипции и сплайсинга.
7SK RNA modulates elongation. 7SK РНК является многочисленной в 331-нуклеотид ncRNA, которая транскрибируется с помощью Pol III. Она очищается совместно с фактором элонгации P-TEFb и репрессирует элонгацию с помощью Pol II транскриптов (REFS 15,16)(FIG. 2). Имеется два класса P-TEFb в клетках людей. 7SK-free P-TEFb действует как общий и HIV-1-специфический фактор элонгации, при этом связанный с 7SK РНК P-TEFb неактивен. Это происходит из-за того, что 7SK РНК репрессирует киназную активность CTD в P-TEFb, это блокирует его способность стимулировать элонгацию15. Эта репрессия привлекает др. белок, известный как HEXIM1 (hexamethylene bisacetamide-induced protein-1), который взаимодействует с 7SK, связанной с P-TEFb17. Различные клеточно стрессовые условия, такие как воздействие actinomycin D и DRB (5,6-dichloro-1-β-D-ribofuranosylbenzimidazole), ведут к диссоциации 7SK и HEXIM1 от P-TEFb. Это приводит к дерепрессии P-TEFb киназы и стимуляции Pol II элонгации17.

Targeting Pol II


Стержневой энзим Pol II состоит из 12 белковых субъединиц. ncRNAs, которые непосредственно нацелены на Pol II, д.б. или общими транскрипционными регуляторами или ген-специфичными регуляторами, которые рекрутируются на избранные промоторы, чтобы модулировать полимеразную активность. Известна единственная природная ncRNA, которая, как известно, нацелена на Pol II, является генеральным репрессором транскрипции, хотя её эффект в клетках возможно контролируется ген-специфическим образом. Синтетические РНК, которые затрагивают Pol II и регулируют её активность, также были идентифицированы. Они были использованы в качестве инструмента для изучения реакции транскрипции и регуляции Pol II с помощью ncRNAs, которые действуют в транс-положении (BOX 3). Все эти исследования естественных и синтетических РНК привели нас к модели, согласно которой многие ncRNAs могут соединяться непосредственно с общим RNA-docking сайтом на Pol II, чтобы регулировать транскрипцию на многочисленных ступенях.
B2 RNA represses transcript synthesis. Мы нашли, что B2 РНК, это ncRNA в ~178-нуклеотидов у мышей, которая непосредственно соединяется с сердцевиной Pol II (FIG. 2) и репрессирует транскрипцию со специфических генов после теплового шока18,19. B2 РНК транскрибируется с семейства short interspersed elements (SINEs), которые являются ретротранспозонами, которые обильно разбросаны по всему геному мышей. Транскрипция B2 SINEs с помощью Pol III позитивно регулируется вследствие различных клеточных стрессов20. Во время реакции теплового шока вновь транскрибированные B2 РНК репрессируют транскрипцию генов, которые кодируют, напр., actin и hexokinase II (REF. 18). In vitro, B2 РНК соединяется с Pol II, собирается в стабильные пре-иниационные комплексы на промоторах и блокирует синтез РНК19. Эта работа выяснила механизм, который объясняет давно известное наблюдение, что общая Pol II транскрипция репрессируется вследствие теплового шока. Однако, как хитшоком индуцированные гены транскрипционно активируются в присутствии B2 РНК репрессора, остается еще установить. Мы полагаем, что эти исследования открывают дверь для открытия др. природных ncRNAs, которые соединяются с Pol II и регулируют транскрипцию в ответ на разнообразные биологические стимулы. Более того, ncRNA транскрипционные регуляторы, которые функционируют путем непосредственного соединения с RNA polymerase, не ограничены эукариотами. У бактерий 6S РНК соединяется с RNA polymerase в транс-положении, чтобы регулировать экспрессию генов, когда клетки вступают в стационарную фазу21.
Structure of an aptamer-Pol-II complex. Идентифицирована FC РНК при скрининге синтетических РНК aptamers, которые соединяются с Saccharomyces cerevisiae Pol II (REF. 22). Такой aptamer, как было установлено, репрессирует транскрипцию с помощью S. cerevisiae Pol II, но не с помощью Schizosaccharomyces pombe или Pol II зародышей пшеницы (REF. 22). Недавно установлена кристаллическая структура FC РНК, связанной с S. cerevisiae Pol II, показавшая, как этот аптамер ингибирует транскрипцию23. Кристаллическая структура показала, что FC РНК формирует двойную stem-loop в связывающем ДНК расщепе (cleft) Pol II, который обычно занимается промотором ДНК. Поэтому было предположено, что FC РНК вмешивается в формирование открытых комплексов (т.е., Pol II комплексов, содержащих ДНК, которые melted вокруг точки старта транскрипции)23. Дальнейшие биохимические исследования необходимы для подтверждения, что образование open-complex на самом деле ингибируется. В этой работе эксперименты по конкурентному связыванию с FC РНК и мышиной B2 РНК показали, что эти две ncRNAs могут соединяться с перекрывающимися сайтами S. cerevisiae Pol II, это ведет к предположению, что B2 РНК м. ингибировать транскрипцию с помощью механизма, сходного с тем, что используется FC РНК23.
An ncRNA-docking site on Pol II. Первая РНК, которая, как было установлено, соединяется с Pol II млекопитающих с высоким сродством, быда не B2 РНК, а скорее синтетическая РНК. Мы нашли, что РНК в 20-нуклеотидов, которая состоит целиком из guanosines (20G-oligo) соединяется прочно (Kd≤ 1 nM) и специфически с Pol II человека и мощно ингибирует специфическую ступень во время ранней транскрипции24. Неожиданно, когда 20G-oligo укорачивалась до 10 нуклеотидов, она всё ещё тесно связывалась с Pol II человека, но больше не ингибировала транскрипцию24. Иными словами, связывание высокого сродства, не зависит от ингибирования транскрипции.
Мы полагаем, что существует RNA-docking сайт высокого сродства (который отличен от RNA-exit канала) Pol II человека и что вследствие постановки в док 20G-oligo репрессирует транскрипцию посредством взаимодействий с отдельными сайтами полимеразы. Эта идея привела к предположению, что натуральные ncRNAs могут соединяться с высоким сродством с RNA-docking сайтом полимеразы и ингибировать транскрипцию и это в конечном итоге привело к идентификации B2 РНК в качестве такого ингибитора. В самом деле, B2 РНК соединяется с высоким сродством (Kd менее 1 nM) с Pol II человека, безусловно с тем же самым сайтом, с которым связывается 20G-oligo, интересно, репрессируют ли эти две ncRNAs транскрипцию путем таргетинга разных ступеней реакции19. Мы полагаем, что связывание B2 РНК или 20G-oligo с docking сайтом высокого сродства прикрепляет ncRNA к полимеразе. Это затем позволяет области(ям) ncRNA, которые не обязательно участвуют в инициальном связывании, взаимодействовать с другой областью полимеразы. чтобы репрессировать транскрипцию. Ингибирующие регионы B2 РНК и 20G-oligo возможно находят две разные области полимеразы и поэтому репрессируют транскрипцию за счёт двух разных механизмов. Исходя из наших наблюдений, мы предположили, что др. натуральные ncRNAs будут соединяться с high-affinity RNA-docking сайтом в Pol II млекопитающих и или ингибировать или активировать транскрипцию, используя разные механизмы регулируемым способом. Курьезно, но B2 РНК и FC РНК не соединяются с S. cerevisiae Pol II в частности с высоким сродством (~35 nM)23, очевидно, по нашему мнению, что S. cerevisiae Pol II или не содержит high-affinity RNA docking сайта или что B2 РНК и FC РНК не ассоциируют с этим сайтом. Взаимодействия, которые диктуют связывание с высоким сродством B2 РНК и 20G-oligo с Pol II человека, следовательно, ещё не идентифицированы.

Conclusions


Although the number of ncRNA regulators of eukaryotic mRNA transcription that have been identified so far is small, their mechanisms of action are widely diverse. We believe that researchers have uncovered only the tip of the iceberg. Given the complexity of eukaryotic transcriptional regulation, the number of potential targets for ncRNAs is virtually limitless. It is likely that many more ncRNAs will prove to be active participants in controlling mRNA transcription, and will therefore affect many biological processes. For example, we wonder whether some of the hundreds of recently identified mammalian microRNAs and short interfering RNAs might associate with transcriptional activators, repressors and the general transcription machinery to regulate mRNA transcription. As more researchers consider the potential for ncRNAs to regulate transcription in many diverse systems, the complexity and breadth of ncRNA transcriptional regulators will begin to be revealed, which will create a new frontier in our understanding of the control of eukaryotic mRNA transcription.
Сайт создан в системе uCoz