Чтобы изучить ранние события образования нервного гребня у кур мы анализировали экспрессию известных маркеров нервного гребня начиная с ранних стадий эмбриогенеза. Экспрессия paired box транскрипционного фактора Pax7 (15) (Рис. 1а) коррелирует с доменом презумптивного нервного гребня у гаструлирующих эмбрионов и предшествует известным маркерам нервного гребня, таким как Slug (16) и SoxE (17). Используя гибридизацию in situ и иммуноокрашивание первое появление домена экспрессии Pax7 обнаруживается на ст. 4+ в виде двух билатерально симметричных косых полосок латеральнее Гензеновского узелка, распространяющихся диагонально на расстояние примерно в 400µm в направлении первичной полоски. На ст. 4+ домен экспрессии Pax7 не перекрывается с маркерами презумптивного эпидермиса (Gata2), нервной пластинки (Sox2), эктодермальных плакод (Dlx5) или края нервной пластинки (BMP4 и Msx1) (18-19). По мере формирования нервной пластинки экспрессия Рах7 частично перекрывается с краем (ст. 5; Рис. 1с), а начиная со ст. 6 постепенно сдвигается, чтобы наложиться на нервные складки ( за исключением переднего мозга, который не формирует нервного гребня). Напротив, родственный ген Рах3 экспрессируется более каудально и медиально (21). Позднее Рах7 экспрессируется мигрирующими клетками нервного гребня в областях среднего и заднего мозга (Рис. 2а). Фокальный инъекции СМ-Dil были использованы для тестирования судьбы презумптивного домена экспрессии Рах7 на ст. 3-4 эмбриогенеза. Эта область инкорпорировалась в дорсальные части нервных складок (45/47), а на ст. миграции клеток нервного гребня (17/17), в мигрирующие клетки нервного гребня (22, 23)(Рис. 2b).

Затем мы исследовали, может ли проспективная Рах7 область специфицироваться, чтобы генерировать клетки нервного гребня, при этом "спецификация" определялась как способность формировать нервный гребень в отсутствие экзогенных сигналов, когда помещалась в нейтральную среду. Соответственно, тонкая полоска ткани эпибласта вырезалась перпендикулярно к и 250 µm каудальнее по отношению к наиболее ростральному распространению первичной полоски на ст. 3-4 эмбриогенеза. Нижний слой (hypoblast/мезодерма) удалялся и полоска эпибласта рассекалась на примерно в 80 µm кусочки и помещались на коллагеновый гель. Экспланты были пронумерованы от 1 до 6, от наиболее латерального от примитивной полоски. Только медиальные экспланты (примерно 300µm от первичной полоски) генерировали способные к миграции клетки нервного гребня (окрашивались позитивно на HNK-1 и Рах7; n=60/69 ст. 4) (Рис. 2с); n=25/30 ст. 3) (Рис. 2d).

Чтобы определить, могут ли эти экспланты генерировать собственно производные нервного гребня, экспланты ст. 3 инкубировали в течение 36 ч как выше и далее в условиях, пермиссивных для меланогенеза. После 8 дней, медиальные экспланты, но не соседний эпибласт формировали меланоциты (8/9), истинные производные нервного гребня (Рис. 2е), а также нейроны. Эти результаты указывают на то. что презумптивный Рах7 домен специфицируется, чтобы формировать нервный гребень уже на ст. 3 без участия сигналов от окружающих тканей.

Существующие модели индукции нервного гребня указывают на то. xsnj взаимодействия между нейральной и не нейральной эктодермой и/или мезодермой могут быть критическими для генерации нервного гребня. Если верно это предсказание, то в медиальных эксплантах, экспрессирующих Рах7 и генерирующих нервный гребень, д. присутствовать все эти взаимодействующие ткани. Однако, дефинитивная нервная ткань не появляется вплоть до поздней стадии 4+ и это нуждается в нейральных стабилизирующих сигналах, исходящих от узелка и головной мезодермы. Поэтому мы исследовали, не могут ли маркеры узелка или мезодермы присутствовать внутри медиальных эксплантов. экспрессирующих Рах7. Сначала мы исследовали экспрессию Рах7 белка и мРНК в эксплантах эпибласта, культивируемых в течение разных промежутков времени. Строгая экспрессия Рах7 обнаруживалась в медиальных эксплантах эпибласта спустя 10 ч от начала культивирования (6/6) (Рис. 2f). Чтобы проверить может ли экспрессия Рах7 зависеть от присутствия мезодермы, мы исследовали Brachyury и Tbx6L (маркеры узелка и ранней мезодермы) вместе с Рах7 на 10 ч. Белок Рах7 выявлялся в медиальных эксплантах эпибласта независимо от того были ли экспланты Brachyury-позитивны (12/12; Рис. 2g). Сходным образом, большинство эксплантов, экспрессирующих Рах7 белок или мРНК, не были способны экспрессировать Tbx6L мРНК (5/6 и 3/4 эксплантов, соотв.).

Экспрессия Pax7 независимо от мезодермальных и нейральных маркеров подтверждена на индивидуальной ст. 3 эксплантов эпибласта, культивируемых в течение 10 ч с использованием RT-PCR (Suppl. Fig.1). Наборы эксплантов, происходящие от 6 эмбрионов были проанализированы в отношении множественных продуктов в одиночных реакциях. Pax7, но не мезодермальные маркеры Brachyury или Slug (экспрессируемые в первичной полоске на этих ранних стадиях), были выявлены в медиальных эксплантах. Вместо этого мезодермальные маркеры четко выявлялись в эксплантах, происходящих из первично полоски. Sox2 (нейральный маркер) не выявляется на ст. 3 экспланта эпибласта, даже если происходит из передних областей, предназначенных генерировать нервную пластинку, но мощная экспрессия обнаруживается в нервной пластинке на ст. 5 и во всём эмбрионе на ст. 10. Эти находки подтверждают наши in situ результаты по гибридизации и иммуноокрашиванию и подтверждают модель раннего образования нервного гребня - включая экспрессию Pax7 - независимо от мезодермальной и нейральной ткани.

Рис.1. |

Как и в предыдущих исследованиях были использованы BMP и Wnt сигналы в индукции нервного гребня, мы имплантировали кусочки, покрытые Wnt или BMP ингибиторами в презумптивный домен экспрессии Pax7. Эмбрионы, получившие кусочки с Wnt ингибитором (Fz5) или с BMP ингибитором (Noggin) обнаруживали снижение экспрессии Pax7 (14/21 Fz5; 8/10 noggin), тогда как контрольные кусочки, покрытые альбумином телячей сыворотки не оказывали подобного влияния (13/13). Эти результаты указывают на то, что Wnt и BMP белки могут быть необходимы для индукции нервного гребня во время гаструляции.

Рис.2. |

Чтобы исследовать необходим ли Рах7 для образования нервного гребня in vivo мы использовали антисмысловые morpholino олигонуклеотиды (Pax7-mo), чтобы предупредить трансляцию белка Рах7. Было установлено, что Рах7-mo снижает трансляцию белка Рах7 in vitro (Рис. 3а). Затем мы электропортировали Pax7-mo с одной стороны в презумптивный домен нервного гребня на стадии 4 эмбриогенеза in vivo; противоположная сторона служила внутренним контролем. Клетки, которые наследовали Pax7-mo обнаруживали заметное снижение уровня белка Рах7 (Рис. 3b). Более того, достоверное снижение маркеров нервного гребня Slug (24/37 эмбрионов), Sox9 (40/52) и Sox10 (36/55) наблюдалось на стороне электропортации (Рис. 3f-h). Подавление экспрессии Slug и Sox9 у эмбрионов после воздействия Pax7-mo выявлялось со ст. 8, т.е. спустя 8-12 ч после электропортации, т.е. когда Slug и Sox9 впервые обнаруживаются в нервных складках. Напротив, эмбрионы, которым электропортировали five-mismatch контрольное morpholino не обнаруживали изменений в уровнях Slug (1/31), Sox9 (1/45) или Sox10 (0/38) (Рис. 3с-е). Жизнеспособность клеток, оцениваемая путем окрашивания 4'6-diamidino-2-phenylindole, оставалась неизменной. Чтобы оценить количественно эффекты на маркеры нервного гребня, оценивали интенсивность экспрессии в идентичных четырехугольных областях на контрольной и обработанной сторонах эмбрионов, обработанных Pax7-mo или контрольными morpholino. Экспрессия Sox9 снижалась от воздействия Pax7-mo менее чем до 40% по сравнению с контралатеральной стороной, но оставалась неизменной при обработке контрольным morpholino (Рис. 3i). У эмбрионов, обработанных Pax7-mo осуществлялось развитие до стадий миграции клеток краниального нервного гребня, затем наблюдалось сильное снижение количества Pax7+HNK1+ миграторных клеток нервного гребня в среднем мозге (4/4; Рис. 3j). Эти результаты подтверждают важную роль Рах7 в формировании нервного гребня во время гаструляции или ранней нейруляции. на миграцию клеток гребня. В противовес нашим результатам по Рах7 мы оказались неспособны выявить раннюю потребность в Рах3 с использованием morpholino против Рах3 (0/10 эмбрионов с изменением экспрессии Slug, 1/9 для Sox9 и 2/9 для Sox10).

Рис.3. |

У мышей, мутации в Рах3 (24) и Рах7 (25) затрагивают разные производные нервного гребня, у мутантов Рах7-/- обнаруживаются более ростральные изменения, по сравнению с мутантами Рах3-/- . Значительное перекрывание экспрессии и функции паралогов, как полагают, обуславливает более легкие фенотипы (26) у одиночных мутантов, а двойные не анализировались в отношении фенотипов нервного гребня (27).Экспрессия Рах3 и рах7 у мышей инициируется после формирования нервной пластинки и нервных складок на ст. Е8.5 (24,25). Поэтому мы исследовали их экспрессию (Suppl. Fig.2) и нашли низкие уровни Рах3 и Рах7 в самостоятельных паттернах в эпибласте на ст. Е6.5. В частности, мы выявили ядерный Рах7 в эмбриональной эктодерме (будущей нейроэктодерме) и в нейроэпителии будущей головной складки. Ядерные Рах3 и Рах7 были выявлены в клетках передней части нервной складки на Е7.5. Каудальные части нервных складок содержали наиболее недавно сформированный нервный гребень, экспрессирующий только Рах7. Эти данные открывают возможность, что механизмы, которые мы описали для птиц, могут быть общими для амниот и вообще для позвоночных. В согласии с этой возможностью и наблюдение, что нокдаун по Рах3 у Xenopus нарушает индукцию нервного гребня (28).

Клетки нервного гребня происходят из эктодермы и как полагают, возникают посредством взаимодействий между нейральной и не нейральной эктодермой и/или мезодермой (4). Здесь мы представили данные, что дискретные области эпибласта со ст. 3-4 эмбрионов кур уже специфицированы к формированию нервного гребня. Медиальная часть эпибласта д. экспрессировать Рах7 и генерировать клетки нервного гребня в изоляции от др. тканей. Нейральная индукция происходит на ст. 3, но нуждается в поздних сигналах, которые испускаются узелком и мезодермой, чтобы инициировать нейральную судьбу (29); поэтому наши экспланты от эмбрионов без дефинитивной нервной ткани подтверждают, что формирование нервного гребня не нуждается в нервной ткани. Более того, мы показали, что медиальная часть эпибласта специфицирована, чтобы формировать нервный гребень в отсутствие дефинитивных нервных и ранних мезодермальных маркеров. Т.о., механизмы, лежащие в основе способности рекапитулировать формирование нервного гребня in vitro на ст. нейрулы путем взаимодействия нейральной ткани с не-нейральной эктодермой или мезодермой могут быть иными от тех, что функционируют in vivo на ст. ранней гаструлы. Наши результаты показывают, что формальное становление края нервной пластинки может не быть обязательным условием для спецификации или индукции нервного гребня и что формирование края и индукция нервного гребня могут быть отдельными событиями. Это согласуется с наблюдением, что избыточная экспрессия Dlx5 создает эктопический край нервной пластинки, но не индуцирует нервного гребня (30). Всё это указывает на то, что все необходимые компоненты для генерации клеток нервного гребня могут присутствоать в медиальной части эпибласта гаструлирующих эмбрионов птиц.

Наши результаты помещают инициацию индукции нервного гребня на или до ст. гаструляции. Мы нашли, что Рах7 является ранним маркером, необходимым для формирования нервного гребня у эмбрионов птиц. В противоположность предыдущим моделям мы нашли, что ни мезодерма, но собственно нервная ткань не нужны для ранней индукции нервного гребня.

Specification of the neural crest occurs during gastrulation and requires Pax7Martin L. Basch, Marianne Bronner-Fraser and Martin I. Garcia-Castro Nature 441, No 7090,218-222 (11 May 2006) | doi:10.1038/nature04684; Received 10 November 2005;

Specification of the neural crest occurs during gastrulation and requires Pax7
Martin L. Basch, Marianne Bronner-Fraser and Martin I. Garcia-Castro
Nature 441, No 7090,218-222 (11 May 2006) | doi:10.1038/nature04684; Received 10 November 2005;