ODORANT RECEPTOR GENES

У мышей запахи воспринимаются ~ 1000 odorant receptors (ORs)? которые кодируются с помощью самостоятельных генов и экспрессируются обонятельными сенсорными нейронами (OSNs) в основном обонятельном эпителии (Buck & Axel 1991, Mombaerts 2004a, Zhang et al. 2004, Axel 2005, Buck 2005). OR гены составляют самое большое семейство генов в геноме мыши. OR белки обладают предполагаемой структурой seven-transmembrane (7TM) домена, характерной для, G protein-coupled receptors (GPCRs). Предполагаемые аминокислотные последовательности обладают определенными общими мотивами, но идентичность аминокислот среди ORs в целом составляет только 37%, а самое низкое сходство в 18% (Zhang et al.2004). OR белки многочисленны в ресничках OSN дендритов, местах передачи информации о запахе. Передача сигналов происходит посредством G protein/cAMP пути, в результате чего происходит деполяризация и увеличивается частота проколов (spiking). Единодушное мнение заключается в том, что индивидуальный OSN экспрессирует только один OR ген, но доказательства правила один рецептор-один нейрон, по моему мнению, неокончательно (Mombaerts 2004b). Данный OR экспрессируется несколькими тысячами OSNs, которые распределены в кажущемся случайном порядке у мышей (Ressler et al. 1993) и крым (Vassar et al. 1993). Первые исследования идентифицировали 4 зоны, которые слегка перекрываются на своих границах; лишь немногие OR гены обнаруживают разные паттерны (Strotmann et al. 1994a,b; Sullivan et al. 1996). Недавние исследования подтвердили, что OR гены экспрессируются во множественных, непрерывных, перекрывающихся полосках у крыс (Iwema et al. 2004) и мышей (Miyamichi et al. 2005). Эта изменчивость паттернов пространственной экспрессии осложняет сравнение.

Доступно мало информации о временных паттернах экспрессии. OR гены вряд ли имеют идентичные начало и кинетику экспрессии. OR гены не экспрессируются в равных количествах в OSNs: их количества варьируют на два порядка величин - MOR28 и mOR37 представлены в наибольшем и наинизшем количествах, соотв. Т.о., если OR гены экспрессируются во множественных перекрывающихся полосах (bands), и если OR гены отличаются по началу и кинетике экспрессии и если OR гены экспрессируются в варьирующем числе OSNs, то мозаицизм и динамика обонятельного эпителия может быть чрезвычайно сложными. Недостаточное внимание было уделено этим множественным типам тонких различий (subtleties), которые сообща могут влиять на исход аксональной проводки (wiring): конфигурацию гломерулярных построений (array) в обонятельных луковицах.

AXONAL CONVERGENCE

У мышей и крыс OSN проецирует одиночный не ветвящийся аксон в одиночный клубочек (glomerulus) (Klenoff & Greer 1998). Изучение аксональной проводки в обонятельной системе мышей существенно было облегчено с помощью стратегии генного таргетинга (Mombaerts 1996, Mombaerts et al. 1996). Эта стратегия базируется на гомологической интеграции гистологических маркерных генов, таких как taulacZ или tauGFP в OR локусах с помощью генного таргетинга в эмбриональных стволовых клетках. Коэкспрессия OR и маркеров происходит на уровне трансляции с помощью преимущественно internal ribosome entry site (IRES) вирусного происхождения. Стратегия OR-IRES-taulacZ делает возможным специфическое мечение дендритов, клеточных тел и аксонов OSNs, которые экспрессируют данныей OR у мышей. Стратегия была разработана для гена P2 и мыши P2-IRES-taulacZ (ниже обозначаемые как P2 мыши) стали субъектом многочисленных публикаций. Следует предостеречь, однако, что популяция P2-экспрессирующих OSNs (обозначенная как P2⁺OSNs) может быть непрезентативной среди ~1000O популяций OSN как в отношении функции, так и организации.

OSNs, которые экспрессируют данный OR ген, отсылают конвергентные аксональные проекции в небольшую область внутри медиальных и латеральных половин каждой луковицы. Внутри каждой полу-луковицы аксоны соединяются обычно в одиночный гомогенный клубочек у взрослых мышей. Часто сначала во время развития формируются два или более клубочков на половинку луковицы. Множественные M71 и M72 гломерулы, которые возникают временно во время постнатального развития, являются гетерогенными: они совместно иннервируются OSNs, которые могут экспрессировать др. неизвестные ORs (Zou et al. 2004). Аксоны M72⁺ OSNs идут индивидуально от эпителия к луковице и собираются в пучки гомотипически в процессе постепенного перехода от наружного ко внутреннему слою нервов (Treloar et al. 2002). Статические картины аксональных сплетений в клубочки создают впечатление высоко динамического и интерактивного процесса сортировки аксонов (Potter et al. 2001, Treloar et al. 2002). Конвергенция аксонов в клубочки впервые была продемонстрирована косвенно с помощью ультрачувствительных методов гибридизации РНК in situ у крыс (Vassar et al. 1994) и мышей (Ressler et al. 1994). Эти эксперименты выявили мРНК для ORs внутри OSN аксонов и окончаний аксонов; неизвестно, транслируются ли эти транскрипты локально в полипептиды. Конвергенция сотен или тысяч аксонов OSNs, содержащих одни и те же виды РНК транскриптов, по-видимому, достаточна, чтобы сделать возможной определение сигнала, с помощью этих ультрачувствительных методов. Стратегия OR-IRES-taulacZ (Mombaerts et al. 1996) теперь стала стандартным подходом для характеристики OR-специфических гломерул. Напротив техника гибридизации in situ трудна, работает только для субнабора OR генов и не может обычно различать с определенностью высоко родственные OR гены из-за перекрестной гибридизации. После 2001, была использована эта техника (Tsuboi et al. 2006).

Картины в световом микроскопе конвергенции аксонов у OR-меченных мышей иногда интерпретировались неправильно, т.к демонстрировали, что зрелые клубочки иннервируются гомогенно аксонами OSNs, которые экспрессируют один и тот же OR. Для множественных M71 и M72 клубочков, которые появляются временно во время постнатального развития, гетерогенность иннервации можно легко различить на уровне световой микроскопии на гистологических срезах (Zou et al. 2004). Напротив, демонстрация гомогенности взрослых клубочков, требует методов более высокого разрешения, таких как ЭМ. Гомогенность аксональной иннервации была описана только для M72 клубочков с помощью иммуноэлектронной микроскопии с анти-GFP антителами у M72-IRES-tauGFP мышей (Treloar et al. 2002). Ещё не известно все ли 1600-1800 клубочков во взрослой обонятельной луковице (Royet et al. 1988, Taniguchi et al. 2003) иннервируются гомогенно с помощью OSNs, которые экспрессируют один и тот же OR. Многочисленные аргументы подтверждают предположение, что иннервация некоторых взрослых клубочков является гетерогенной. При наличии 1000-1200 интактных OR генов и 2 или более клубочков на OR на луковицу д. быть 2000-2400 клубочков. Единственным объяснением дефицита клубочков является то, что некоторые клубочки иннервируются совместно популяциями OSNs, которые экспрессируют разные, в общем-то очень сходные OR гены.

Мы расширили стратегию OR-IRES-маркер для 10 дополнительных OR генов: M71, M72, P3, P4, M50, I7, MOR23, mOR37A, mOR37B и mOR37C (Strotmann et al. 2000, Zheng et al. 2000, Potter et al. 2001, Bozza et al. 2002, Vassalli et al. 2002, Feinstein & Mombaerts 2004, Feinstein et al. 2004). Др. группы использовали стратегию для 4 дополнительных генов: M5, MOR28, SR1 и MOL2.3 (Serizawa et al. 2000, Zou et al. 2001,Weber et al. 2002, Cutforth et al. 2003, Shykind et al. 2004). Этот набор из 15 OR генов д. представлять собой адекватную выборку из репертуара в 1000-1200 OR генов. Только в одном опубликованном случае, с использованием M12-IREStaulacZ мышей, генетические манипуляции нарушали паттерн экспрессии в эпителии и продуцировали также аберрантный паттерн проекций аксонов (Axel 2005). В целом анализ этих линий меченных OR подтвердил и расширил наблюдения на P2 мышах и данные по гибридизации in situ: имеется обычно два клубочка на OR на луковицу. Исключение составляют mOR37 гены, для которых имеется по одному клубочку на луковицу (Strotmann et al. 2000). Мы использовали также IRES-маркер стратегию для мечения проекций аксонов mitral/tufted клеток от обонятельных луковиц к обонятельному кортексу (Walz et al. 2006b).

THE AXONAL WIRING PROBLEM

Организующие принципы конвергенции аксонов ставят огромную проблему по их проводке. Периферически - внутри эпителия - OSNs, которые экспрессируют один и тот же OR судя по виду разбросаны внутри области. Центрально - внутри слоя клубочков луковицы - их аксоны проецируются в специфические клубочки, по-видимому, со 100% точностью. Эта схема проводки (Figure 1) представляет собой разумный анатомический дизайн клубочков, чтобы собрать и интегрировать информацию о запахах, передаваемую популяциями OSNs, которые экспрессируют один и тот же OR. Эта схема согласуется с преобладающей моделью обонятельного кодирования, согласно которой комбинация активированных клубочков и кодирует качество запаха (Axel 2005, Buck 2005). Дополнительные сомнения относительно проведения аксонов исходят из непрерывной продукции новых OSNs обонятельным эпителием. OSNs возникают асинхронно не только во время перинатального развития, они также имеют определенную продолжительность жизни и погибают, как это происходит и с др. клетками эпителия. Эти вновь появившиеся OSNs проецируют новые аксоны в луковицу. В течение жизни организма индивидуальные аксоны д. т.о. согласовываться с уже установленным паттерном полностью сформированных клубочков.

ODORANT RECEPTORS AND AXONAL WIRING

Если все OSNs, которые экспрессируют один и тот же OR, проецируют свои аксоны в один и тот же клубочек, ир как осуществляется конвергенция их аксонов? Во-первых, было разумным собрать OR в проводах из аксонов. Механизм OR-регулируемой конвергенции аксонов д. б. также эффективным решением для детерминации клубочков для новых OR генов, которые возникают в ходе эволюции. Мы предоставили генетические доказательства того, что ORs являются детерминантами проведения аксонов (Mombaerts et al. 1996). При дальнейшей разработке OR-IRES-taulacZ стратегии мы осуществи ли эксперименты по замещению (называемые также swap экспериментами), в которых OR кодирующая область реципиентного OR локуса замещалась кодирующей областью донорского OR с помощью генного таргетинга. Технически такие замещения OR кодирующей области являются довольно просты для осуществления, т.к. OR кодирующая область не содержит интронов. Аксоны от OSNs, экспрессирующих донорский OR с реципиентного OR локуса

Figure 1 Wiring diagram of the mouse olfactory system. Four different populations of OSNs, each expressing a different OR, are depicted in green, orange, brown, and red. OSNs that express the same OR are scattered in a seemingly random fashion with the epithelium, but their axons coalesce into the same glomeruli in the olfactory bulb.Within a glomerulus, OSN axons synapse with the dendrites of the second-order neurons, mitral or tufted cells, which in turn project their axons to the olfactory cortex. This anatomical organization presents a formidable wiring problem. Figure from Bob Crimi.

(обозначаемые как donor OR→recipient OR замещение) соединяются обычно с новыми, эктопическими клубочками (Mombaerts et al. 1996,Wang et al. 1998, Bozza et al. 2002, Feinstein et al. 2004). Имеются два, очень желанных исключения: при M71→M72 и M72→M71 замещениях, аксоны проецируются, соответственно в M71 и M72 клубочки (Feinstein & Mombaerts 2004). Эти генетические доказательства указывают на то, что OR являются детерминантами наведения аксонов, но также указывают на то, что они не единственные детерминанты. В согласии с функцией ORs в проведении аксонов, OR белки обнаруживаются в аксонах и окончаниях аксонов до и во время образования клубочков (Barnea et al. 2004, Feinstein et al. 2004, Strotmann et al. 2004).

Как же наведение аксонов контролируется с помощью ORs? Имеется мало прецедентов для функций 7TM белков в проведении аксонов. Предложено три типа моделей. Согласно первой модели градиенты специфического сигнала в луковице д. предопределять положение клубочков для специфических ORs. Воплощение этой модели заключается в том, что OR д. предопределять позицию клубочка вдоль передне-задней оси луковицы. Эта гипотеза была предложена на базе относительно небольшого набора замещений OR (Wang et al. 1998), но более крупный набор OR замещений (Feinstein et al. 2004) не подтвердил этой гипотезы. Др. гипотеза позиционной информации предполагает, что ORs и ephrins совместно предопределяют позиции клубочков путем взаимодействия с ephrin рецепторами в луковице (Cutforth et al. 2003). Согласно второй модели сортировка аксонов в гломерулы д. отражать паттерны нейральной активности ("cells that fire together, wire together"). Однако, неясно, если естественные запахи, задают сложные паттерны активации OR, то как может быть достигнуто достаточное разрешение для рассортировки более 1000 аксональных популяций со значительной точностью и довольно быстро во время развития - для некоторых популяций даже пренатально. Скорее активность нейронов д. играть пермиссивную роль для проведения аксонов - имеется множество и др. процессов, включая полимеризацию tubulin! Мы недавно сформулировали третью модель: ORs д. оказывать специфическое влияние на взаимодействия между аксонами и д. управлять само-организацией аксонов в сливающиеся структуры (Feinstein & Mombaerts 2004, Feinstein et al. 2004). Мы предположили, что OSN аксоны сортируют сами себя в гломерулы посредством опробывания ростовых конусов из др. аксонов. Сортировка д. обеспечиваться гомофильными взаимодействиями между комплексами, которые содержат ORs или фрагменты OR. Дифференциальное сродство среди аксональных популяций д. создавать определенное расположение клубочков у индивида. Исход этого процесса сортировки вытекает из контекста: он зависит от экспрессируемого репертуара ORs, а не от предетерминированной пространственной карты в луковице.

TARGETS IN THE BULB?

Модель само-сортировки ставит вопрос о популярном мнении относительно клубочков у грызунов: т.е. о "мишенях" в луковице. Считается, что клубочки возникают из предсуществующих структур и в предетерминированных местах, которые находятся аксонами OSNs, экспрессирующими данный OR. Как только клубочки сформированы, они, как полагают, служат мишенями для аксонов OSNs, которые экспрессируют соотв. OR и которые рождаются непрерывно в течение всей жизни индивида. Превалирующее мнение о клубочках грызунов существенно зависит от мнения о мишенях и отражается в обще распространенном использовании терминов, таких как glomerular targeting, axon targeting, target selection, target choice, target innervation, convergence onto glomeruli и targeting olfaction. Распространенное использование термина "target" (мишень) может приводить к неправильному убеждению, что д. быть мишени определенного сорта: как же аксоны д. находить цель в её отсутствии? Это представление о мишенях вносит вклад в устойчивое мнение о стереотипированной пространственной карте топографически инвариантных клубочков; в свою очередь, это представление усиливается с помощью этой устойчивой точки зрения. Если положение клубочков постоянно описывается как фиксированное и инвариантное у мышей и крыс, то интуитивно приходится думать, что эти позиции специфицируются с помощью мишеней в луковице.

А что если не существует мишеней в луковице? Может ли сформироваться паттерн гломерул без разработанной системы позиционной информации, которая д. диктовать точную позицию для 1600-1800 клубочков? Чтобы рассмотреть это альтернативное мнение, необходимо знание об уровне вариабельности положений клубочков. Мы назвали эти вариации "local permutations" (Strotmann et al. 2000). Эта вариабельность может быть оценана за счет тщательной проверки абсолютной или относительной позиции специфических клубочков (Strotmann et al. 2000, Schaefer et al. 2001, Alenius & Bohm 2003, Feinstein&Mombaerts 2004). Локальные пермутации очевидны также, исходя из паттерна активированных клубочков после воздействия запахом, как установлено, напр., с помощью intrinsic signal imaging (Belluscio & Katz 2001) или получения картин синаптической активности маркера synaptopHluorin (Bozza et al. 2004). Под локальными пермутациями я не понимаю глобальную компрессию или экспансию паттерна клубочков, а скорее локальную взаимозаменяемость позиций OR-специфических клубочков. Уровень неопределенности был подсчитан на 29-37 клубочках для mOR37 и P2 клубочков (Strotmann et al. 2000, Schaefer et al. 2001). Этот уровень неопределенности оказался достаточно высоким, чтобы помешать идентификации специфических OR клубочков, исходя из абсолютной и относительной позиции, формы или размера. Атлас для всех клубочков, по-видимому, не выполним у мышей, несмотря на детальную анатомическую и молекулярную информацию, доступную для 43 клубочков в антенной доле Drosophila melanogaster (Laissue et al. 1999, Couto et al. 2005, Fishilevich & Vosshall 2005).

Глобальные исследования развития клубочков у крыс и мышей не выявили каких-либо структурных элементов, которые предшествуют образованию клубочков или каким-либо мишеням, к которым стремятся аксоны (LaMantia & Purves 1989, Bailey et al. 1999, Treloar et al. 1999); нет и указаний на существование мишеней в исследованиях развития специфических клубочков у OR-меченных мышей. Наша контекстуальная модель само-сортировки строится на альтернативном мнении о независимости от мишеней: аксоны не конвергируют в клубочки, а сливаются в клубочки.

AXONAL IDENTITY

Контекстуальная модель базируется в основном на анализе мутаций в OR паре генов, M71 и M72 (Feinstein & Mombaerts 2004, Feinstein et al. 2004). M71 и M72 экспрессируются в дорсальной области эпителия, а аксоны от M71⁺ или M72⁺ OSNs проецируются в самостоятельные клубочки дорсальной части луковицы без перекрестной иннервации. Имеется в среднем 1.2 клубочков для каждого из M71 и M72 на половину луковицы; др. словами, ~20% половин луковиц имеют по два клубочка. Кодирующие области от 129 линии мышей кодируют полипептиды с 96% идентичностью аминокислот; 11 из 309 аминокислот отличны.

Кодирующая область замещений M71→M72 и M72→M71 показывает, что M71 и M72 кодирующие области достаточны для респецификации проекций аксонов, если экспрессируются из соотв. локуса. Расстояние между M71 и M72 качественными особенностями клубочков, т.о., зависит от различий по 11 аминокислотам. В серии целенаправленных мутаций в локусе M71, основа M71 была модифицирована в молекулу, более похожую на M72 благодаря заменам остатков, это приводило к ряду гибридных ORs. Скрещивания линий мышей показали, что фенотип клубочков зависит от др. популяций аксонов, которые присутствуют. Эти фенотипы формируют спектр от сегрегации в отдельные клубочки (отражение ORs, которые полностью отличны в терминах наведения аксонов) до ко-конвергенции и диффузного comingling внутри одного и того же клубочка (отражение ORs, которые неотличимы в терминах наведения аксонов). Фенотипы клубочков могут быть промежуточными в этом экспериментальном дизайне. Напр., аксоны из двух типов могут сегрегировать в самостоятельные клубочки, но с реципрокным обменом аксонами. Мы рассматриваем спектр фенотипов клубочков как экспрессию качественных особенностей аксонов: т.к. существуют относительные свойства аксонов, которые проявляют себя в зависимости от др. популяций аксонов. Множественные аминокислоты влияют на качественные особенности аксонов и эти остатки располагаются преимущественно внутри предполагаемых трансмембранных доменов OR. Одиночная аминокислотная замена (D205N) в трансмембранном домене V дает в результате новые клубочки. Мы не определили минимальное количество остатков, необходимых для превращения качественных особенностей M71 почти в M72, мы проверяли только естественно возникшие аминокислотные различия между M71 и M72 в 129 линии мышей. Качественные особенности аксонов могут зависеть от значительно большего количества замен по всей молекуле OR.

Мы дополнили этот in vivo сайт-направленный мутагенез M71 и M72 изучением эффектов полиморфизмов аминокислот на качественные особенности аксонов для некоторых ORs, между 129 и C57BL/6 линиями (Feinstein & Mombaerts 2004). M71 является псевдогеном в C57BL/6; эта линия т.о., не имеет M71⁺ OSNs и не имеет M71 клубочков. Два аминокислотных отличия в M50 вызывает полное расхождение аксонов в разные клубочки у мышей, гетерозиготных по аллелям из 129 and C57BL/6 линии. В др. случае мы наблюдали фенотипы клубочков, которые были сходны с теми, что у M71-M72 гибридов. Влияние этих полиморфизмов на проведение аксонов (и возможно на распознаваемость запахов) может вносить вклад в возникновение моноаллельной экспрессии OR генов (Chess et al. 1994), чтобы гарантировать, что один тип рецепторов экспрессируется на клетку, а не два слегка отличающихся типа. Т.к. нормальные мыши не являются инбредными и их геномы имеют многочисленные полиморфизмы среди 1000 OR локусов, то относительные позиции и качественные особенности клубочков скорее всего существенно отличаются между индивидами в природных популяциях аутбредных мышей. Вообще-то каждый индивид обладает уникальной конфигурацией набора клубочков.

ODORANT RECEPTOR EXPRESSION LEVEL AS SECOND DETERMINANT

Аминокислотные последовательности только в определенных, целиком контролируемых ситуациях (напр. таких как M71 и M72) достаточны, чтобы респецифицировать качественные особенности аксонов. Должны существовать и др. детерминанты, один из которых, по-видимому, предопределяет уровень экспрессии OR. Такой детерминант трудно измерить из-за отсутствия количественных подходов к уровням OR белков. Строгим критерием может служить резкое снижение уровня белка M71, обусловленное введением IRES выше кодирующей области M71 с помощью генного таргетинга (Feinstein et al. 2004). Такой дизайн снижает уровни белка M71, т.к. трансляция с IRES менее эффективна. Этот модифицированный M71 аллель экспрессируется на OSNs, преимущественно с помощью обычного механизма выбора OR гена, но при значительно сниженном уровне белка - мы подсчитали, базируясь на GFP флюоресценции, сниженном в 12 раз. Аксоны от OSNs, которые экспрессируют этот M71 гипоморф, соединяются в гомогенные клубочки, которые являются новыми и располагаются значительно более кпереди и вентральнее относительно M71 клубочков. Т.о., один и тот же OR может детерминировать две аксональные качественные особенности, когда меняются уровни его экспрессии. Хотя радикальные различия в уровне экспрессии для одного и того же OR обычно не происходят, но эксперименты с гипоморфами и др. (Feinstein et al. 2004) показывают, что уровень экспрессии является детерминантом качественных характеристик аксонов.

POSITIONAL CELL TYPE

Мы полагаем, что обонятельный эпителий состоит из нескольких самостоятельных OSN клеточных типов, которые детерминируются горизонтальным расположением внутри эпителиального слоя. Эта гипотеза в основном базируется на разнообразии клубочков, обнаруживаемых при замещении M50→P2 (Feinstein & Mombaerts 2004). Positional cell type (PCT) д.быть др. детерминантом аксональной характеристики: он может модулировать качественные особенности аксонов OSNs, которые экспрессируют один и тот же OR на одном и том же уровне белка. Сбивает с толку то, что OR может экспрессироваться в более чем одном PCT - но с разными частотами. Возможно существование множества PCTs и они не обязательно д. быть пространственно разделенными, но могут быть перемешаны. В соответствии с этим представлением о PCT неправильная экспрессия OR трансгена в эпителии часто коррелирует с новыми, эктопическими клубочками (Vassalli et al. 2002, Nakatani et al. 2003, Miyamichi et al. 2005, Rothman et al. 2005). Такая эктопическая экспрессия и эктопические клубочки наблюдаются также при определенных целенаправленных мутациях последовательностей мотивов в промоторной области M71 (Rothman et al. 2005). Вентрализованная или дорсализованная эпителиальная экспрессия трансгенов для ORs A16 и MOR10 коррелирует, соотв., с вентрализованной или дорсализованной позицией эктопических гломерул (Miyamichi et al. 2005),указывая тем самым, что PCTs картируется вдоль дорсо-вентральной оси эпителия. PCTs д. также предопределять вероятность, с которой данный OR ген выбирается для экспрессии. PCTs может отражать комплекс микропаттернов, которые придают фундаментальные различия стволовым или клеткам предшественникам по всему эпителию.

THE CONTEXTUAL MODEL OF SELF-SORTING

ИМы полагаем, что сортировка OSN аксонов в клубочки контролируется с помощью OR-обеспечиваемых гомофильных и гетерофильных взаимодействий между аксонами и ростовыми конусами, которые простираются вдоль этих аксонов. Мы предполагаем, что эти взаимодействия не д.быть непосредственными между OR-содержащими комплексами. OR белок или его фрагмент д. представлять сам по себе уникальную трехмерную структуру, которая дифференциально приспосабливается с помощью ассоциированных факторов (белков?) внутри плазматической мембраны аксонов и ростовых конусов. Аналогией является ассоциация с антигеном производимыми пептидами в major histocompatibility complex (MHC) молекул: комбинация пептид-MHC представляет собой специфическую самобытность. Кандидатами на роль таких ассоциированных факторов могут быть молекулы REEP и RTP, которые усиливают на поверхности экспрессию ORs в гетерологичных HEK293 клетках (Saito et al. 2004). Комбинация OR или фрагмента OR (пептида?) с ассоциирующими факторами д. предоставлять субстрат для гомофильных взаимодействий. Ростовые конусы д. обратимо проверять аксоны на сходство OR и взаимодействия между аксонами OSNs, экспрессирующими сходные ORs д. становиться сильнее, чем между аксонами OSNs, экспрессирующими разные ORs. Гетерофильные взаимодействия не д. рассматриваться как отталкивающие, а только как менее привлекательные, чем гомофильные взаимодействия. Эта точка зрения на аксональные проекции согласуется с морфологией сплетений аксонов когда они приближаются к клубочкам на статических картинах (Potter et al. 2001, Treloar et al. 2002). Сортировка становится возможной, когда аксоны переходят из наружного во внутренний слой нервов (Au et al. 2002), a не является проксимальной.

Наша контекстуальная модель само-сортировки подразумевает, что сортировка популяции аксонов OSN в клубочки может быть достигнута без привлечения химических сигналов в луковицу. Согласно этой точки зрения аксоны не выглядят как мишени - они являются мишенями!

TEMPORAL CONTROL

Само-сортировка, как ожидалось, является склонной к ошибкам и значительно точка по сравнению с молекулярными сигналами наведения. Тем не менее, консервация положения клубочков поразительна. Как может само-сортировка обеспечивать паттерн 1600-1800 клубочков в позициях. которые характерны, тем не менее не стереотипированы? Временной контроль может вносить критический вклад в воспроизводимость паттерна клубочков. К сожалению, имеется мало информации о временных паттернах экспрессии. Начало экспрессии OR происходит на 13-й день эмбриогенеза (E13) для 12 изученных генов мышей (Sullivan et al. 1995), но необходим более систематический анализ. Имеется некоторая информация об онтогенетической динамике генов mOR37 и MOR256-17 (Conzelmann et al. 2001, Schwarzenbacher et al. 2006). Но эти немногочисленные данные по экспрессии не были сравнены со временем развития и положениями клубочков для разных ORs.

Паттерн клубочков обнаруживает значительную степень онтогенетической асинхронности: не все клубочки возникают в одно и то же время (LaMantia & Purves 1989, Pomeroy et al.1990, Treloar et al. 1999). Клубочки в ростральной части луковиц крыс обгоняют на 2-4 дня те, что в каудальной части и существует значительная гетерогенность внутри области луковицы (Bailey et al. 1999). P2 клубочки образуется приблизительно на E17 (Royal & Key 1999), MOR256-17 клубочки на день позднее (Schwarzenbacher et al. 2006), mOR37 клубочки на третий день после рождения (Conzelmann et al. 2001), a M71/M72 клубочки приблизительно в то же самое время, что и mOR37 клубочки (Potter et al. 2001, Zou et al. 2004). К сожалению, критерии для идентификации клубочков были разными в этих исследованиях; необходимы более униформные стандарты и параллельные исследования множественных ORs, чтобы стало возможным сравнение времени образования клубочков. Если паттерн клубочков формируется в период, скажем, неделю перинатально у мышей, то наведение аксонов может быть строго детерминировано с помощью асинхронного их развития. Напротив, значительно труднее представить синхронное наведение аксонов при формировании паттерна из 1600-1800 клубочков воспроизводимым способом.

Расположение клубочков может быть результатом качественных особенностей аксонов, комбинируемых с тем, когда и во скольких клетках экспрессируется OR ген. Сценарий может быть таков. Аксоны д. обладать разными правилами отбора, чтобы двигаться к поверхности луковицы, в зависимости от экспрессируемых OR (первый детерминант качественной особенности аксона) и их уровня экспрессии (второй такой детерминант). PCTs (третий детерминант) д. вычленять домены луковицы, которые доступны для миграции аксонов. Рано возникшие и рано прибывшие аксоны для данного OR д. само-сортироваться и соединяться в один или более прото-клубочков приблизительно в первой доступной позиции, внутри домена, который соответствует PCT. Аксоны для др. экспрессирующих ORs OSNs с тем же самым PCT д. достигать в другое время порогового количества аксонов в нервном слое для формирования клубочков. Популяции аксонов д. т.о., соединяться в клубочки в оставшихся пространствах внутри гломерулярного слоя.

Модель само-сортировки предполагает, что аксоны могут соединяться первоначально в разнородные клубочки и что эти клубочки первоначально могут быть не гомогенными. Это действительно имеет место в случае M71 и M72 клубочков (Zou et al. 2004). Последующее ремоделирование создает одиночные и гомогенные клубочки, которые обычно наблюдается на половинке луковицы. Ремоделирование может происходить благодаря гибели клеток с неправильно проведенными аксонами (Zou et al. 2004), напр., за счет механизмов, зависящих от активности. Ремоделирование может быть ускорено за счет обонятельного обучения (Kerr & Belluscio 2006) или за счет др.форм восприятия запахов.

Значение этого сценария в том, строго говоря, что ORs не д. быть молекулами наведения вовсе! Вспомним экспериментальные доказательства роли ORs в наведении аксонов исходят исключительно из генетических замещений OR. Альтернативная интерпретация заключается в том, что замещение OR д. менять PCT и уровень экспрессии и вообще столь же важный временной контроль и количества OSNs, экспрессирующих OR. Если OR B экспрессируется с промотора OR A в результате внесения целенаправленной мутации, то OR B может быть экспрессирован в др. PCT, на др. уровне, с др. началом и кинетикой и с др. количеством OSNs, чьи аксоны будут достигать порога формирования клубочков в др. время. Т.о., ORs могут не быть молекулами наведения аксонов, в том смысле, что они воспринимают химические сигналы в луковице. Скорее ORs могут быть молекулами качественной особенности или опознавательными, которые лежат в основе соединения per se.

β2AR AS A SURROGATE ODORANT RECEPTOR

Модель само-сортировки не зависит от специфической функции, которая вовлекает ORs в наведение аксонов: The β2 adrenergic receptor (β2AR) может замещать M71, если экспрессируется с M71 локуса в результате генного таргетинга (β2AR→M71 мутация) (Feinstein et al.2004). β2AR имеет мотивы во внутриклеточных регионах 2, 3 и 4, которые законсервированы среди ORs и др. 7TM рецепторов. β2AR может купироваться с Gαolf, указывая на сходство с ORs. β2AR обнаруживает 16% идентичных аминокислот в M71 и 18% с ближайшим OR, это сопоставимо с наинизшей качественной особенностью среди мышиных ORs (Zhang et al. 2004). В характерных позициях β2AR→M71 аксоны формируют клубочки, которые располагаются кпереди и вентральнее по сравнению с M71 клубочками (Feinstein et al. 2004). Антитела к β2AR выявляют антигены в ресничках, клеточных телах и аксонах OSNs, включая и клубочки. β2AR>M71 клубочки гомогенно иннервированы и выглядят функциональными. Если любой из некоторых др. ORs коэкспрессируется с β2AR, то аксоны д. иннервировать или множественные или никакие клубочки. Тркдно представить механизм, который мог бы приводить к коэкспрессии специфических OR с β2AR. Т.о., β2AR , по-видимому, не коэкспрессируется ни с одним из OR в β2AR→M71⁺ OSNs, но прямые доказательства отсутствуют - хотя имеется, впрочем, случай, для др. меченных OR генов!

β2AR является наиболее изученным GPCR. Напротив, почти отсутствует структурно-функциональная информация об ORs. Использование β2AR в качестве суррогата OR для изучения проведения аксонов основывается на факте отсутствия экспрессии β2AR в OSNs. Экспрессия β2AR, которая описывается в обонятельной слизистой мышей с помощью гибридизации in situ (Hague et al. 2004) мы не смогли подтвердить (M. Omura, P. Feinstein, and P. Mombaerts, unpublished observations). GPCRs могут выполнять более общую роль в проведении аксонов в нервной системе, которая экспрессирует 90% из ~350 GPCRs (Vassilatis et al. 2003). Такие роли не д. приводить к соединению в клубочко-подобные структуры, но поддерживать др. аспектов проведения аксонов.

AXONAL COALESCENCE IS CELL AUTONOMOUS

P2 были скрещены с Tbr-1 нокаутными мышами, которые дефицитны по большинству второго порядка нейронов (mitral/tufted клетки) и с Dlx-1/Dlx-2 двойными нокаутными мышами, которые дефицитны по бульбарным GABAергическим промежуточным нейронам (periglomerular клетки и granule клетки) (Bulfone et al. 1998). Оба типа нокаутных мышей погибают вскоре после рождения. Хотя луковицы дизорганизованы у таких мышей, меченные аксоны P2 соединяются в клубочки на соотвествующих позициях. Т.о., гипотетические сигналы, которые делают возможным содеинение в пучки и предоставляют позиционную информацию для P2 аксонов не продуцируются исключительно нейронами второго порядка или интернейронами. Это заключение согласуется с предполагаемой ролью ephrin-Eph системы (Cutforth et al. 2003). Парадокс в следующем: Eph рецепторы, которые экспрессируются в нейронах второго порядка или промежуточных нейронах, д. совместно предопределять позиции P2 клубочков, но ни один из типов клеток не нужен для формирования P2 клубочков.

Вторая линия доказательств клеточно автономной природы соединения аксонов получена от extratoes (Xt) мутантных мышей, которые имели мутацию в гене Gli-3 (St John et al. 2003a). Эти мыши погибают при рождении и не имеют различимых обонятельных луковиц. Аморфная структура, наз. волокнисто-клеточной массой присутствует, где д. быть луковицы и не содержит распознаваемых нейронов второго порядка и интернейронов. Пространственно и во времени экспрессия OR генов нормальна у Xt мышей для двух изученных OR (Sullivan et al. 1995). Когда Xt были скрещены с P2 мышами, то аксоны соединялись в небольшие локусы волокнисто-клеточной массе. (Из-за отсутствия обычных синаптических партнеров, нейронах второго порядка и интернейронов, термин клубочки не является подходящим.)

Третьей и наиболее убедительной демонстрацией клеточно-автономной природы соединения OSN получены в экспериментах по bulbectomy (St John et al. 2003a). 6 недель спустя после того как луковицы удаляются хирургически у новорожденных P2 мышей, наблюдаются некоторые клубочко-подобные локусы в случайных, рассеянных местах переднего мозга, которые выпячиваются, чтобы заполнить пространство, прежде оккупированное луковицей. Сходные клубочко-подобные структуры в переднем мозге мышей с удаленными луковицами описаны значительно раньше (Graziadei et al. 1978), но без специфических инструментов, таких как P2 мыши, поэтому было невозможно определить их аксональный состав.

Итак, аксоны от P2⁺ OSNs обладают строгой и внутренне присущей способностью находить один другого и соединяться без образования синапсов со своими обычными партнерами. Роль для обоняния окружающих клеток или глии нельзя исключить в этих экспериментах.

ESTABLISHMENT VERSUS MAINTENANCE

Обонятельный эпителий постоянно регенерирует самого себя в течение всей жизни. Часто полагают, что OSNs продуцируются из клеток предшественников автоматически и регулярно, подобно эпидермису или эпителию ЖКТ или респираторного тракта. То, что OSNs имеют продолжительность жизни в 30 или 90 дней, пропитана литература, но эти количества приводятся в результате поверхностной интерпретации данных (таких как Graziadei et al. 1979). 90-дневная продолжительность жизни, которая иногда даже присутствует как период полужизни, была предложена Mackay-Sim & Kittel (1991a,b), к их собственному разочарованию (Mackay-Sim 2003). 90-дневный промежуток времени позднее исследовался этими авторами и привел к более низким значениям продолжительности жизни; определенно это не период полу-жизни. Является ли нейрогенез автоматическим и регулярным, ведь проведение аксонов четко обнаруживается во время взрослого периода, т.к. эпителий расширяется и в нем увеличивается количество OSNs. У взрослых новые OSNs зарождаются и проецируют аксоны в луковицу. Напротив, большая часть проводимых аксонов на длинные расстояния заканчивается где-то в др. месте нервной системы взрослых. Взрослый OSN нейрогенез ставит вопрос, существуют ли механизмы, которые лежат в основе установления паттерна клубочков, поддерживают также и их сохранение. Этот вопрос попытались решить путем индукции в целом или избирательной потери из популяции OSN.

Восстановление проекций аксонов у взрослых мышей и крыс было исследовано двумя способами, которые вызывали массивные повреждения: поперечный разрез обонятельного нерва (Costanzo 2000, Christensen et al. 2001) и внутрибрюшинные инъекции dichlobenil (St John & Key 2003b). Dichlobenil разрушает избирательно OSNs не затрагивая др. типы клеток обонятельного пути, такие как обонятельные покровные клетки. При обоих методах массивная гибель OSN гарантировалась в течение нескольких дней, сопровождаемая энергичной пролиферацией клеток внутри базального слоя и дифференцировкой новых OSNs. После нескольких недель эпителий восстанавливается, но паттерн аксональных проекций не восстанавливается. У поврежденных P2 мышей (Costanzo 2000, St John & Key 2003b), меченные аксоны соединяются, но имеются многочисленные клубочки и они широко диспергированы по луковице. Сходным образом у крыс перерезка нерва нарушает распределение проекций OCAM⁺ и OCAM^- аксонов (Christensen et al. 2001). Др. повреждающий метод заключается в пассивном вдыхании газа methyl bromide, который избирательно разрушает OSNs и поддерживающие клетки. Паттерны экспрессии всех 8 изученных ORs крыс восстанавливались спустя 3 мес. после повреждения methyl bromide (Iwema et al. 2004); проекции аксонов не изучались. Эти исследования предоставили серьезные доказательства мощной регенеративной способности обонятельного эпителия у взрослых мышей и крыс. Но они также показали, вообще-то ничего удивительного, что проведение аксонов не является нормальным после массивных повреждений.

OR-IRES-marker подход был расширен, чтобы индуцировать избирательное устранение P2⁺ OSNs (Gogos et al. 2000). Генетический замысел согласуется со скрещиваниями между трансгенными мышами, несущими tet-оператор, управляющий дифтерийным токсином и gene-targeted мышами с P2-IRES-rtTA-IRES-taulacZ аллелем. Дифтерийный токсин очень эффективен в убийстве клеток клеточно-автономным способом. Tet-оператор является минимальным промотором, который регулируется с помощью активной формы tetracycline-зависимого транскрипционного оператора rtTA. Добавление аналога tetracycline, doxycycline, к пище приводило к избирательной гибели клеток, экспрессирующих аллель P2-IRES-rtTA-IRES-taulacZ. Предостерегает то, что в контрольных экспериментах аксоны OSNs, экспрессирующие этот P2 аллель соединяются в клубочки, которые находятся по соседству с нативными P2 клубочками. Tricistronic, двойные-IRES мутации в локусе P2, т.о., по-видимому, изменяют существенные свойства OSNs. Индукция экспрессии дифтерийного токсина дает остаточные популяции в 2-10% от нормальных количеств, указывая тем самым, что 98-90% P2⁺ OSNs убивается. Регенерация популяции P2⁺ OSN ведет к появлению P2 клубочков после нескольких недель. Не удалось продемонстрировать, что аксоны от вновь возникших P2⁺ OSNs формируют синапсы внутри клубочков или что эти клубочки гомогенно иннервируются аксонами от P2⁺ OSNs.

EVOLUTIONARY CONSIDERATIONS

Вовлечение ORs в конвергенцию аксонов является экономичным: ORs стоят двойной цены, как распознают запахи и наводят аксоны. Эта двойная роль упрощает предназначение клубочков, если появляются новые OR гены в ходе эволюции. Если новый OR существенно отличается от любого др. OR репертуара, то клубочек для нового OR скорее всего будет новым и д. будет втиснуться куда-нибудь в паттерн клубочков. Аналогично, если два существенно отличающиеся аллеля данного OR комбинируются в индивиде благодаря скрещиванию, то д. сформироваться два сомостоятельных клубочка. Напр., полиморфизм по двум аминокислотам в M50 между линиями 129 и C57BL/6 коррелирует с самостоятельными клубочками (Feinstein & Mombaerts 2004).

Снова представление о мишенях в луковицах осложняет ограничения, накладываемые на проведение аксонов. По-видимому не разумно предполагать, что незанятые мишени в луковице уже присутствуют для новых клубочков, когда возникает новый OR ген в ходе эволюции или когда новая комбинация двух существенно отличающихся аллелей данного OR возникает при скрещиваниях. Если бы существовала позиционная информация, чтобы наводить OSN аксоны точно на мишени в луковице, то как бы эти сигналы эволюционировали совместно с громадным репертуаром OR генов? Репертуары OR млекопитающих безусловно пластичны; мыши имеют 1000-1200 OR генов, а крысы имеют 1500 OR генов.

Согласующимся заключением из всех замещений OR является то, что аксоны соединяются в клубочки в характерных позициях в луковице. Описаны замещения OR, которые предваряют образование клубочков или которые приводят к диффузным проекциям во многие клубочки. Даже экспрессия не-OR, такого как β2AR с OR локуса дает свой собственный клубочек. У трансгенных мышей с аберрантным паттерном экспрессии часто образуются новые клубочки. Эти генетические эксперименты могут воспроизводить эволюционные изменения.

ODORANT RECEPTOR CODING REGION DELETIONS

Нокаут OR гена д. стать критическим тестом роли ORs в проведении аксонов. Фенотип OR нокаутов на первый взгляд вводит в заблуждение и его интерпретация очень сильно осложнена.

Описаны 4 стандартные нокаутные мутации (как ΔOR) в P2 (Wang et al. 1998), в M71 и M72 (Feinstein et al. 2004) и в MOR28 (Shykind et al. 2004). Под нокаутом я понимаю делецию без-интронной кодирующей области, от ATG до стоп кодона. Удержание neo избирательного маркерного гена в ΔMOR28 (Shykind et al. 2004) конфликтует с превалирующими стандартами, т.к. ген neo влияет на паттерны и уровни экспрессии OR генов и многих др. генов, таких как immunoglobulin и гомеобоксные гены. Согласуется с возможным эффектом сохранения гена neo экспрессия, наблюдаемая в тканях вне обонятельной системы e ΔMOR28-IRESCre- FNF мышей и у MOR28-IRES-Cre-FNF мышей (O'Donnell 2004). Эти внеобонятельные паттерны были охарактеризованы как неправильная экспрессия (O'Donnell 2004) и ограничили заключение о стабильности выбора OR гена, т.к. неправильная экспрессия может также возникать и внутри обонятельного эпителия. Переключение генов (Shykind et al. 2004) могло бы отражать передергивание (twitching) гена (мерцание или взрывы экспрессии OR генов), которое могло бы усиливаться при удержании гена neo в локусе MOR28 (Shykind et al. 2004).

OSNs, которые экспрессируют ΔP2 аллель, как было установлено, проецируют аксоны, которые разбредаются по поверхности луковицы и в последствии гибнут (Wang et al. 1998). Исчезновение этих OSNs было позднее интерпретировано по-новому, как угасание ΔP2 локуса (Shykind et al. 2004). Напротив, OSNs, которые экспрессируют ΔM71 или ΔM72 аллель, присутствуют в изобилии вплоть до 6 мес. (Feinstein et al. 2004). Стабильность генного выбора в M71 локусе далее была продемонстрирована отслеживанием клонов с M71-IRES-Cre мутацией, которая свободна от гена neo (Li et al. 2004). Др. объяснением различий между MOR28 и M71 находками заключается в том, что частота переключения гена или twitching гена может зависеть от OR локуса.

Несмотря на эти предостережения, фенотипы 4 ΔOR мутаций оказались информативными в отношении наведения аксонов, но способом, который не столь очевиден. OSNs, которые экспрессируют ΔOR локус, часто ко-экспрессируют др. OR локус. В одной популярной модели эта ко-экспрессия вытекает из-за отсутствия OR обусловленной негативной петли обратной связи (Serizawa et al.2003, Lewcock & Reed 2004, Shykind et al. 2004). Согласно альтернативной модели ко-экспрессия двух OR происходит обычно, хотя и не очень часто; ко-экспрессия д. быть только переносимой и совместимой с жизнеспособностью OSN, когда один OR локус (такой как ΔOR локус) не дает функционального OR (Mombaerts 2004a, Feinstein et al. 2004). Любая из моделей распознает, что ΔOR⁺ OSNs ко-экспрессируют функциональные OR. Независимо от интерпретации ко-экспрессии, во всех 4-х ΔOR фенотипах и у трансгенных мышей с ΔMOR28 локусом (Serizawa et al. 2003), аксоны проецируются диффузно на луковицу, а некоторые аксоны вступают в клубочки (Feinstein et al. 2004). Эти диффузные проекции занимают широкий домен луковицы. Для ORs с дорсальной экспрессией в эпителии и дорсальными клубочками, такими как M71 и M72, этот домен оказывается дорсальным; для OR с промежуточной экспрессией в эпителии, такого как P2, этот домен также промежуточный; а для вентральных OR, таких как MOR28, этот домен вентральный.

Если бы роль OR была ограничена финальной стадией наведения аксонов, после того, как аксоны наводились с помощью механизмов, не зависящих от OR в небольшую область поверхности луковицы, то можно было бы предсказать, что аксоны от ΔOR⁺ OSNs будут ограничиваться такой же небольшой областью. В качестве аргумента, не имеет отношения к делу, экспрессируется ли второй и функциональный OR в ΔOR⁺ OSNs соответственно локализации OSN в эпителиальном слое; ободряет, что у ΔMOR28 трансгенных мышей ко-экспрессируемые OR гены, по-видимому, соответствуют локализации (Serizawa et al. 2003). Качественные особенности второго OR д. быть единственным известным отличием среди ΔOR⁺ OSNs. Все др. молекулы наведения д. экспрессироваться в той же самой комбинации и на том же самом уровне, соответствующим мутантному локусу. (Вряд ли ORs будут дифференциально затрагивать комбинации и уровни молекул наведения). Т.о., широкие домены на луковице, которые иннервируются аксонами от ΔOR⁺ OSNs отражают вклад не зависимых от OR детерминантов, a OR выполняют доминантную роль внутри этих широких доменов. Следовательно, роль OR ни в коем случае не ограничена финальным выбором мишени внутри малой области.

MOR256-17

Инициация проекций аксонов из эпителия в луковицы в раннем развитии может использовать специальный случай OR-зависимых взаимодействий. MOR256-17 экспрессируется большой фракцией клеток обонятельного эпителия на ст. E10-E12 (Conzelmann et al. 2002; Schwarzenbacher et al. 2004, 2006). Были получены специфические антитела против MOR256-17 (Strotmann et al. 2004). Интересно, что MOR256-17 экспрессируется также клетками в ситовидной мезенхиме, которая расположена между эпителием и будущей луковицей. Эти клетки общими признаками с OSNs, но не являются типичными нейронами. Около 50% этих клеток в мезенхиме экспрессирует in the mesenchyme MOR256-17. Некоторые из клеток MOR256-17⁺ в мезенхиме располагаются стратегически там, где OSN соединяются вместе и образуют пучек. Аксоны от MOR256-17⁺ OSNs достигают луковицы к ст. E13 и окружают луковицу целиком к E18, когда они соединяются в клубочки на вентральных позициях. Эти наблюдения позволят высказать предположение, что MOR256-17⁺ мезенхимные клетки могут осуществлять общее наведение аксонов от эпителия к луковицам во время раннего развития; вообще-то известны некоторые др. гены ORс подобной функцией.

Между прочим, первым описанием in situ гибридизации ORs было MOR256-17, который был тогда назван OR3 (Nef et al. 1992). В этом исследовании сообщалось о временном появлении OR3⁺ клеток в ситовидной мезенхиме мышей. На постнатальный день 10, ~1000 OR3⁺ OSNs было вычислено в эпителии. Др. группа подсчитала сходное число на ст. E14 (Schwarzenbacher et al. 2004). Т.о., эта популяция OSNs, по-видимому, резко возрастает между E10 и E14 и затем стабилизируется, Ранняя экспансия популяции MOR256-17⁺и экспрессия этого гена в мезенхимных клетках являются двумя показателями специальной функции в инициации проекций аксонов. Если эта специальная функция зависит от самого MOR256-17, то вообще-то этот OR д. быть необычно хорош при взаимодействии со многими др. ORs, или вообще он д. быть столь хорош на этих ранних стадиях из-за рыхлого ограничения взаимодействий.

THE OCAM SAGA

В общем топографическая связность может быть выявлена в проекциях аксонов от эпителия к луковицам в основном вдоль дорсо-вентральной оси. В последние 20 лет паттерн пространственной и временной экспрессии Olfactory Cell Adhesion Molecule (OCAM) стал ведущим кандидатом на роль молекулярного детерминанта для общей топографической коммуникабельности. Но надежда увяла, когда был проанализирован нокаутный OCAM фенотип (Walz et al. 2006a). Сага об OCAM д. служить предупреждением приписывания существенной роли молекулам в проведении аксонов на базе интересных паттернов пространственной и временной экспрессии.

OCAM является членом сверхсемейства immunoglobulin (Alenius & Bohm 1997, Yoshihara et al. 1997) и тесно связан по последовательностям с Neural Cell Adhesion Molecule (NCAM) и fasciclin II. OCAM осуществляет гомофильные взаимодействия in vitro, но не соединяется с NCAM (Yoshihara et al. 1997). Экспрессия OCAM в эпителии ограничена OSNs в вентральных регионах, которые проецируют свои аксоны в клубочки вентро-латаральных частей луковиц. OCAM временно экспрессируется в дендритах mitral/tufted клеток в дорсо-медиальном аспекте луковиц крыс, формируя зеркальное отражение проекций OCAM^- аксонов (Treloar et al. 2003). OCAM сохраняется на OSNs у взрослых, но исчезает из mitral/tufted клеток вскоре после рождения.

Неутешительно, что при различных измерениях OCAM нокаутов не было выявлено очевидного эффекта на топографию проекций в основной и добавочной обонятельной системах (Walz et al. 2006a). Скорее нарушена организация внутри клубочков: Сегрегация аксон-дендрит и дендрит-дендрит синаптических circuits внутри клубочков оказалась менее выраженной. Т.о., с момента открытия, когда было предположено, что OCAM выполняет функции, связанные с проведением аксонов, в частности с общей топографической коммуникабельностью, фенотип нокаутов заставил )временно?) отказаться от этой гипотезы. Аргументы о перекрывании без сомнения были предложены: др. молекула(ы) д. компенсировать потерю OCAM. Но эти альтернативные гипотезы выдвигались многие годы, но стало ясно, что стоит изучать неперекрывающиеся механизмы. Сегодня OCAM является удобным маркером для (вентральных) OSNs, которые не желают смешиваться с (дорсальными) OCAM^- OSNs (Chehrehasa et al. 2005), но OCAM сам по себе не отвечает на это дифференциальное смешивание.

EPHRINS AND EPHRIN RECEPTORS

Роль ephrins и их рецепторов в retinotectal или в retinocollicular проекциях описана в деталях (Lemke & Reber 2005). В зрительной системе слой периферических рецепторов проецируется в высшие области головного мозга, так что сохраняются сходные взаимоотношения. Позиционные координаты Cartesian x-y типа картированы от одного двухмерного слоя нейронов к соседнему двухмерному слою нейронов с которыми они образуют синапсы. Распределение ephrin лигандов и Eph рецепторных тирозин киназ организовано градированным и комплементарным образом вдоль ортогональных осей сетчатки и тектума. Напротив проекции аксонов от обонятельного эпителия к луковицам следуют совершенно противоположным принципам организации: OSNs, которые разбросаны по большой области эпителия проецируют аксоны в небольшие клубочки в луковице. Из первого принципа неясно если да, то каковы механизмы, поддерживаемые с помощью ephrins и Eph рецепторов в зрительной системе могут быть распространены на обонятельную систему.

Ephrins и Eph рецепторы экспрессируются в виде высоко сходных пространственного и временного паттернов, как OSNs, так и клетками луковиц (St John et al. 2002b). Из-за множества взаимодействий между ephrins и Eph рецепторами, не возможно прямо предсказать функциональный исход их взаимодействий - и нокаутов. Отсутствуют очевидные градиенты экспрессии в эпителии и луковице. Уровни Ephin-A обнаруживают мозаичные паттерны в гломерулярном слое, что лишено очевидной логики: клубочки, экспрессирующие высокие уровни, соседствуют с клубочками, экспрессирующими низкие уровни (Cutfortht et al. 2003).

Функциональные доказательства роли ephrins и Eph рецепторов в проведении аксонов в обонятельной системе ограничены одним сообщением (Cutforth et al. 2003). У мышей с нокаутами ephrin-A3 и ephrin-A5, позиции клубочков P2 и SR1 подвергаются сдвигу назад. SR1 является типичным OR и экспрессируется в 50% OSNs septal органа (Tian & Ma 2004), малого поселения, отдаленного от основного обонятельного эпителия; он не является репрезентативным для репертуара OR. Абсолютная позиция клубочков трудна для определения из-за возможных различий в размере и форме луковиц у мутантных мышей. Интересно, что др. ephrin, ephrin-A2, оказывает негативный эффект на пролиферацию нервных предшественников и на нейрогенез, так что нокаутные по ephrin-A2 мыши имеют больше интернейронов в луковицах (Holmberg et al. 2005). Сходным образом, незначительные изменения в размерах или форме луковиц у двойных мутантов ephrin-A3/ephrin-A5 могут вызывать кажущееся смещение позиции клубочков, которые могут не отражать непосредственно роли этих ephrins в совместном предопределении их позиций. Обратный эксперимент с избыточной экспрессией ephrin-A5 в P2⁺ нейронах посредством P2-IRES-ephrin-A5-IREStaulacZ мутации (Cutforth et al. 2003), страдает от того же самого возражения, т.к. эксперименты с участием P2-IRES-rtTA-IRES-taulacZ мутации (Gogos et al. 2000), которые дают новые клубочки, которые отличны от нормальных P2 клубочков. Tricistronic мутации в локусе P2 могут влиять на положение клубочков независимо от того, какие др. белки ко-экспрессируются, вообще-то за счет уменьшения количества продуцируемого P2 белка. Из дальнейших касательств, anteriorization P2 клубочков с помощью избыточной экспрессии ephrin-A5 происходит в пределах только одного из двух клубочков и наблюдается только в 60% случаев. Из-за очевидных ограничений этого исследования (Cutforth et al. 2003), роль ephrins и Eph receptors в управлении образованием топологической карты в луковице остается спорной.

SEMAPHORIN 3A

Несколько линий нокаутных мышей было изучено в отношении аномалии проведения аксонов в обонятельной системе. В большинстве случаев довольно приближенные показатели, такие как окрашивание лектинами DBA, .skb использованы для определения исхода (Treloar et al. 1997). Более сфокусированный подход - это изучение специфических клубочков у OR-IRES-marker мышей. P2 клубочки привлекли большое внимание, но большинство результатов негативны. P2 клубочки оказались нечувствительны к отсутствию CNGA2 (Lin et al. 2000, Zheng et al. 2000), Tbr-1 и Dlx-1/Dlx-2 (Bulfone et al. 1998), G_olf (Belluscio et al. 1998), neutrophins и нейротрофиновых рецепторов (Nef et al. 2001) и OCAM (Walz et al. 2006a). Предварительные данные показали, что P2 клубочки не сохраняются у старых G_olf нокаутных мышей (Belluscio 1998).

Расхождения возникли, когда две группы исследовали P2 клубочки у Semaphorin 3A (Sema3A) нокаутных мышей. Sema3A является ассоциированным с мембранами секретируемым белком со свойствами хеморепелента для neuropilin-1-positive (npn-1⁺) аксонов. Sema3A экспрессируется несколькими типами клеток в обонятельной системе, особенно обонятельными оболочечными клетками в нервном слое вентральных частей луковиц. У Sema3A нокаутных мышей, npn-1⁺ OSN аксоны неправильно идут в вентральные клубочки у новорожденных (Schwarting et al. 2000) и у взрослых (Taniguchi et al. 2003, Schwarting et al. 2004). Schwarting et al. (2004) описывают множественные, более мелкие, неправильной формы и вентрализованные P2 клубочки у Sema3A нокаутных мышей; Taniguchi et al. (2003) не выявили различий. Нет очевидных объяснений, таких как линейные или генетического фона различия, которые бы объясняли эти расхождения. Однако, генетический фон в gene-targeted линиях мышей может подвергаться огромным изменениям между лабораториями, что мешает воспроизводимости результатов. Обычный генетический фон gene-targeted мышей 129 х C57BL/6 смешанный. Обычно, очень немногие мыши перемещаются из одной лаб. в др. (генетическое узкое горло) и колонии часто поддерживаются за счет скрещиваний между братьями сестрами (инбридинг и генетический дрейф). Результаты могут в дальнейшем затрагиваться различиями в запах окружающей среды, в которой пребывают животные. Такие незначительные эффекты становятся важными, когда фенотип нокаутов также едва обнаружим. Решением является увеличение генетической чистоты за счет возвратных скрещиваний OR-меченных мышей и повторов в параллельных экспериментах, производимых в др. лабораториях и ли в той же лаб. позднее.

GLYCOCODE

Различные углеводы клеточной поверхности экспрессируются на OSN аксонах в виде характерных паттернов, которые могут быть выявлены путем окрашивания растительными лектинами, такими как DBA или UEA. В наружном нервном слое DBA⁺ аксоны отсортировываются от др. аксонов и собираются в дискретные пучки (Key & Akeson 1993). Такие углеводы клеточной поверхности, как полагают, взаимодействуют с белками, связывающими углеводы, такими как galectin-1, который экспрессируется многими клетками в обонятельной системе. Нокауты по galectin-1 дают аномалии в паттерне клубочков: DBA⁺ клубочки исчезают из дорсо-каудальной области луковиц (Puche et al.1996).

Гипотеза гликокода предполагает, что многочисленные углеводы клеточной поверхности предоставляют клеточной поверхности сигнатуру, благодаря которой аксоны сортируются перед OR-зависимым соединением в клубочки (St John & Key 2005). Трудно представить, как гликокод скоординированно экспрессируется среди OSNs, экспрессирующих один и тот же OR или группы ORs. Как и в случае ephrin-A (Cutforth et al. 2003), распределение DBA⁺ клубочков в луковице мозаично и лишено очевидной организации: клубочки, в которых все аксоны являются DBA⁺, соседствуют с клубочками, в которых лишь немногие аксоны DBA⁺ и с клубочками, не содержащими аксонов DBA⁺ (Lipscomb et al. 2003). Основным препятствием в прогресс в этом направлении является отсутствие точных инструментов, с помощью которых может изучаться роль углеводов клеточной поверхности. Кроме того, эти молекулы часто экспрессируются слишком многими типами клеток, чтобы можно было интерпретировать результаты. Нокауты по гену, кодирующему β-1,3-N-acetylglucosaminyltransferase 1, ключевой энзим в синтезе lactosamine glycan, предотвращают образование P2, I7 и M72 клубочков glomeruli (Henion et al. 2005).

ACTIVITY-DEPENDENT MECHANISMS

В др. сенсорных системах, таких как зрительная система, формирование проекций аксонов во время развития подразделено на ранней фазе на зависимые от активности процессы, сопровождаемые утонченными зависимыми от активности процессами. Активности посредством нейрональной активности, обычно электрической активности, которая может быть спонтанной или разбуженной стимулами, скоррелированы или не скоррелированы. Организация проекций аксонов OSN ведет к значительному a priori скептицизму относительно роли зависимых от активности механизмов. Литература по этому вопросу бедна и противоречива. Блокирование передачи обонятельных сигналов путем нокаута субъединицы cyclic nucleotide-gated channel, CNGA2 (первоначально названного OCNC1), затрагивает проведение аксонов в некоторых ситуациях. В то время как P2 клубочки формируются нормально у CNGA2 нокаутных мышей, клубочки M72 нет (Lin et al. 2000, Zheng et al. 2000). Мозаичное сосуществование M72⁺ OSNs , которые экспрессируют или нет CNGA2, было осуществлено посредством извлечения выгоды из моноаллельной экспрессии OR генов; проекции аксонов от CNGA2⁺ and CNGA2^- OSNs рассортировываются в разные клубочки (Zheng et al. 2000). Сходная мозаичная ситуация была создана, но глобально в OSNs, базируясь на мозаичной X-инактивации у самок гена CNGA2, расположенного Х хромосоме (Zhao&Reed 2001). У молодых самок CNGA2⁺ и CNGA2^- OSNs сосуществуют в одинаковых количествах, но со временем клетки CNGA2^- исчезают, а небольшие количества клубочков, инактивированные за счет CNGA2^- OSNs, сохраняются у старых мышей. Постоянное и одностороннее хирургическое закрытие одной из ноздрей увеличивает количество клубочков, иннервируемых с помощью CNGA2^- OSNs. Множественные и гетерогенные M71 и M72 клубочки появляются временно во время постнатального развития (Zou et al. 2004). Эти гетерогенные клубочки исчезают обычно спустя 8 недель, но сохраняются после закрытия ноздри. Эта хирургическая процедура снижает все активности, ассоциированные с прохождением воздуха чрез носовую полость: биохимические, электрические и токсические. Увеличение жизнеспособности OSNs с закрытой стороны указывает на то, что избирательная гибель OSNs является клеточным механизмом для ремоделирования клубочков. Обонятельное обучение в вызывающем отвращение conditioning протоколе ускоряет ремоделирование клубочков (Kerr & Belluscio 2006). Однако, закрытие ноздри и скрещивание с CGNA2 нокутными мышами не вмешивается во внутриклубочковую сегрегацию проекций аксонов, наблюдаемую в M71-M72 гибридных скрещиваниях (Feinstein & Mombaerts 2004): эти характерные фенотипы, по-видимому, являются первичным эффектом ORs. Условная экспрессия легкой цепи tetanus toxin, которая ингибирует высвобождение синаптических нейротрансмиттеров, вмешивается в поддержание P2 клубочков, когда избирательно экспрессируется в P2+ OSNs, но не когда широко экспрессируется в зрелых OSNs (Yu et al. 2004). Условная избыточная экспрессия внутрь очищающих калиевых каналов Kir2.1 приводит к драматическому снижению спонтанного возбуждения и предотвращает образование P2 и MOR23 клубочков, в то время как MOR28 клубочки оказываются неожиданно нормальными. Т.к. экспрессия tetanus легкой цепи и Kir2.1 блокируют как спонтанную, так и вызванную запахом активность, то дифференциальный анализ вкладов этих двух типов активностей не может быть проведен непосредственно. Изучение главной роли вызванной запахом и скоррелированными паттернами активности ещё более осложнено гетерогенностью реакций на запахи OSNs, которые экспрессируют один и тот же OR (Bozza et al. 2002, Grosmaitre et al. 2006). Напр., порог реакции на пахучий лиганд lyral варьирует в 100 раз в MOR23⁺OSNs. Если эти наблюдения можно экстраполировать на ситуацию in vivo, то паттерны активности могут варьировать существенно среди OSNs, экспрессирующих один и тот же OR.

На ум приходит единственное, что активность д. играть некоторую роль в проведении аксонов в обонятельной системе, но такая роль не может быть инструктивной и вообще не столь интересна. После этого, почему активность не может играть роль в модуляции фенотипов клеток, которые специализированы в обеспечении паттернов активности? OSN, которые не могут отвечать на запахи или не могут продуцировать потенциалы действия д.быть нефункциональными по многим причинам.

EFFICIENCY OF AXONAL WIRING

Всепроникающая и слепая вера в литературе, что OSNs являются безупречными клетками. Они д. управлять так, чтобы экспрессировать один, и только один, функциональный OR ген с эффективностью в 100%, чему помогает обратная петля связи и их аксоны д. находить свои клубочки с эффективностью 100%. Итог и в самом деле кажется безупречным: 100% аксонов, иннервирующих M72 клубочки, сформированы M72⁺ OSNs (Treloar et al. 2002). Но процесс не нужно путать с итогом; д. быть существенное изнашивание OSNs на множественных стадиях.

Картины конвергенции аксонов OR меченных мышей могут быть обманчивы. Они не показывают всех аксонов, которые исходят от OSNs, экспрессирующих этот OR, заканчивающихся стабильно в этих клубочках. Вообще-то только те аксоны, которые иннервируют правильно клубочки, сохраняются, а OSN с неправильным проведением аксонов не выживают. Картины конвергенции аксонов могут скрывать существенный уровень неэффективно проведенных аксонов. То что выглядит как величественный подвиг проведения аксонов может быть продуктом безжалостного отбора, опустошающего большинство OSNs так что сохраняется только незначительное меньшинство. Контекстуальная модель само-сортировки также скорее всего не защищена от ошибок и даже не столь уж эффективна: конвергенция аксонов д. происходить в основном в результате случайности, а не в результате прямого наведения на цель.

CONCLUSION

There are other views on axonal wiring. For many authors, it remains irresistible to hypothesize spatial cues in the bulb that would specify the positions for each and every glomerulus. Key & St John (2002), St John et al. (2002), Axel (2005), Nedelec et al. (2005), and Komiyama & Luo (2006) present interesting reviews and opinions. The growth of knowledge depends entirely on the existence of disagreement (Popper 1994).

I admit to a bias in my review, in which I interpret the literature through the perspective of our contextual model of self-sorting and by dismissing targets in the bulb. But this model reduces the problem to the essence: OR-specific axonal convergence is OR dependent. The model is parsimonious and does not invoke complex scenarios with multiple layers of guidance control that would have to act in concert with the expressed OR. The model is attractive from an evolutionary viewpoint: The bulb is receptive to experiments of nature,and coevolution of genes for guidance factors and OR genes is not required. The challenge for the model is unambiguous:How can a multitude of axonal interactions comparing each other for OR similarity generate an array of 1600–1800 glomeruli at positions that are so reproducible?

I do not disregard the potential contributions of ephrins and ephrin receptors, adhesion molecules, cell surface carbohydrates, activity-dependent mechanisms, and so forth. But there are other, unrelated wiring problems in the bulb, for example, projections of mitral/tufted cell dendrites to glomeruli, connectivity of interneurons, and centrifugal projections. Molecules with intriguing expression patterns (Lin et al. 2004) or knockout phenotypes may be involved in these other wiring problems and only indirectly and secondarily in the wiring of OSN axons.

Research on axonal wiring in the olfactory system ought to be focused primarily on explaining how ORs function in axonal wiring. This problem is well defined but remains mysterious. Its solution may require a patient continuation of the genetic approach combined with experiments in biophysics.

SUMMARY POINTS

1. The mouse genome has?1000 intactORgenes. EachOSNexpresses just one allele of oneORgene. Axons of OSNs that express the sameORproject to the same glomeruli: typically to one glomerulus per half-bulb. For each OR, there are thus at least four glomeruli per mouse.

2. The expressed OR determines the glomerulus that is innervated: Altering the OR oding region by targeted mutagenesis alters the position of the glomerulus that is formed. The first evidence for the role of the OR in axonal wiring was provided in 1996, but no mechanistic insights as to how ORs function precisely in axonal wiring have emerged.

3. OSNs axons do not converge onto a glomerulus but coalesce into a glomerulus. Axons do not project to a preexisting structure, but they dynamically form a glomerulus by coming together and forming synapses with other types of neurons.

4. The glomerular array is not a stereotyped spatial map because the OR identity of a particular glomerulus cannot be derived from its position, shape, or size. There is no evidence for targets in the olfactory bulb to which axons would be guided.

5. An in vivo site-directed mutagenesis study has led to a contextual model of self-sorting. OSNaxons would sort themselves out into glomeruli through sampling of otherOSN axons with their growth cones. This self-sorting would be mediated by hypothetical homophilic interactions between complexes that contain ORs or OR fragments.

6. The ~1800 glomeruli are not wired simultaneously but emerge over a period of a few days perinatally. This developmental asynchrony may be instrumental in axonal wiring. Insufficient attention has been paid to temporal control.

7. Once established, the glomerular array must be maintained in the face of OSN death to preserve the constancy of olfactory perception. Like other cells in epithelia, OSNs are turning over throughout the lifetime of the organism. OSN renewal poses an additional challenge to the mechanisms of axonal wiring.

8. A pervasive and implicit belief in the literature is that the processes of OR gene choice and axonal wiring are perfect. Quite the opposite may be the case: There may be substantial attrition of OSNs at various stages. What appears as a magnificent feat of axon guidance may be the product of merciless selection that wastes many OSNs and perhaps only retains a small minority.

Axonal Wiring in the Mouse Olfactory System Peter Mombaerts Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2006. 22:713–37

Axonal Wiring in the Mouse Olfactory System
Peter Mombaerts
Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2006. 22:713–37