Модификации Энзимов (Убиквитилирование и Сумоилирование)
Regulation of DNA repair by ubiquitylation
Tony T. Huang1 and Alan D. D'Andrea Nature Reviews Molecular Cell Biology 7, No 5, 323-334 (May 2006) | doi:10.1038/nrm1908
The process of ubiquitylation is best known for its role in targeting proteins for degradation by the proteasome. However, recent studies of DNA-repair and DNA-damage-response pathways have significantly broadened the scope of the role of ubiquitylation to include non-proteolytic functions of ubiquitin. These pathways involve the monoubiquitylation of key DNA-repair proteins that have regulatory functions in homologous recombination and translesion DNA synthesis, and involve the polyubiquitylation of nucleotide-excision-repair proteins.
Рис.1. | The regulation of the Fanconi Anemia pathway by monoubiquitylation.
Рис.2. | The monoubiquitylation of PCNA by RAD6–RAD18 results in a DNA polymerase switch.
Рис.3. | The regulation of nucleotide-excision repair by the polyubiquitylation of XPC.
Рис.4. | The regulation of base-excision repair by SUMO1 modification of human thymine-DNA glycosylase.
Сложные внутриклеточные сигнальные процессы, такие как репарация ДНК, контролируются не только с помощью своевременной экспрессии определенных белков, но и также с помощью сборки и доставки этих белков в молекулярную кухню, которая предназначена сражаться с повреждениями ДНК. в качестве смотрителя генома сенсоры повреждений ДНК и репаративные белки д. реагировать быстро и эффективно. Часто, регуляция таких белков связана с пост-трансляционными модификациями, такими как фосфорилирование и убиквитилирование, чтобы помочь им модулировать сборку и разборку комплексов, а также своевременным таргетингом и регуляцией ферментативной активности.
является существенным из 76 аминокислот белком, который законсервирован от дрожжей до людей. Ubiquitin широко используется клетками как ковалентный модификатор др. белков, чтобы направить их обеспечиваемую протеосомами деградацию или модулировать их функцию (summarized in Box 1). Детерминанты функции ubiquitin покоятся, частично, на типе(ах) ubiquitin модификации белкового субстрата. Напр., добавление monoubiquitin к белку не направляет белок по пути деградации. Моноубиквитилированные белки могут быть распознаны множественными ubiquitin-связывающими белками и ubiquitin рецепторами, которые способны модифицировать белки, чтобы взаимодействовать и формировать комплексы с др. белками, изменять субклеточную локализацию и изменять опредленные структурные и targeting свойства. Также формирование полиубиквитиновой цепи на белке не обязательно приговаривает белок к протеолизу. В зависимости от типа(ов)прикрепления полиубиквитиновой цепи polyubiquitylation белков может активировать киназы или осуществлять поддержку для зарождения различных сигнальных процессов.
Эукариотические клетки обладают широким кругом путей репарации ДНК для поддержания геномной стабильности и клеточной изменчивости, когда они подвергаются воздействию внешней среды (напр., ионизирующая радиация, УФЛ, и естественные и синтетические химические соединения) и эндогенного метаболического (напр., оксидативные и гидролитические реакции) канцерогенеза1. ДНК может быть повреждена путем внесения single-strand breaks (SSBs), double-strand breaks (DSBs) и DNA adducts (т.е., ковалентные модификации и поперечные сшивки индивидуальных пиримидиновых и пуриновых оснований). Пути репарации ДНК функционируют, чтобы удалять и фиксировать повреждения ДНК своевременно, чтобы предупредить превращение повреждений в постоянные мутации в геноме2.
Существуют 5 основных пути репарации ДНК: (NER) (который используется для (GGR) и (TCR)), (MMR), репарация. Первые три процесса (NER, BER and MMR) ведут к вырезанию поврежденных или несоответственно спаренных оснований, тогда как HR и NHEJ позволяют репарировать DSBs (Ref. 2). Мы обсудим также путь DNA-replication-stress, известный как (TLS), который нуждается в растущем классе специализированных ДНК полимераз, и который позволяет репликации обходить поврежденную матрицу во время репликации ДНК.
Важно, что некоторые из этих путей репарации ДНК обладают частично перекрывающимися функциями или они функционируют последовательно при репарации определенных субклассов повреждений ДНК. Это происходит, напр., в случае, когда репарируются поперечные сшивки ДНК, для этого необходимы и HR и TLS3. Путь Fanconi Anemia (FA) является путем, отвечающим на повреждения ДНК, который имеет дело с повреждениями, которые вызываются поперечными сшивками ДНК и этот путь ассоциирован с редким генетическим синдромом того же имени. Путь FA, как полагают координирует два пути репарации ДНК, HR и TLS, чтобы бороться с повреждениями ДНК в виде поперечных сшивок в клетках4,5. Важно, что собственно функция FA нуждается в моноубиквитилировании одного из свойих эффекторных белков. Мы рассмотрим также недавние находки, связанные с путем NER и важную роль полиубиквитинирования продукта гена xeroderma pigmentosum complementation group C () в вырезании поврежденных оснований. Путь TLS у дрожжей использует моноубиквитилирование (Box 1), non-degradative полиубиквитилирование и sumoylation (SUMO, small ubiquitin-like modification) (Box 2) белка proliferating cell nuclear antigen () . Каждый тип ubiquitin и ubiquitin-подобной модификации PCNA активирует разные наборы функций, предназначенных для определенных типов репликационных стрессов. Наконец, мы обсудим регуляцию BER с помощью sumoylation.
DNA-repair pathways are highly regulated
Пять основных путей репарации ДНК были выявлены благодаря широкому кругу биохимических, генетических и клеточно-бологических подходов. В то время как основные ферментативные активности, которые участвуют в репарации ДНК (активности exonuclease, endonuclease, DNA polymerase, helicase и ligase) хорошо описаны, регуляция in vivo репарации ДНК посредством сети путей сигнальной трансдукции только начинает проясняться. Разворачивание пути репарации ДНК in vivo нуждается во многих слоях регуляции. Напр., типичный путь репарации ДНК может использовать детекцию повреждений ДНК, передачу сигналов, чтобы рекрутировать факторы репарации ДНК, активацию энзимов репарации ДНК и разборку или деградацию факторов репарации ДНК после фиксации инициальных повреждений.
Хотя некоторые процессы репарации ДНК обычно постоянно активны, некоторые из них активируются в точно определенное время клеточного цикла или в ответ на специфический тип повреждений ДНК2. Активация путей репарации ДНК и реакции на повреждения может быть результатом содействия белок-ДНК и межбелковых взаимодействий посредством фосфорилирования, убиквитилирования и др. событий пост-трансляционных модификаций. Эти модификации белков могут менять ферментативные активности репарации ДНК, модулировать точное время и/или эффективность репаративного процесса, рекрутировать факторы к местам повреждений ДНК и регулировать функции опухолевых супрессоров и КПП (checkpoints) клеточного цикла.
Менее известно о путях подавления репарации ДНК. Мы полагаем, что активация негативных регуляторов путей репарации ДНК может приводить к фосфорилированию и деубиквитилированию ключевых регуляторных белков и к рециклингу или деградации важных энзимов репарации ДНК, чтобы гарантировать своевременное выключение репарации ДНК. Выключение репарации ДНК может быть важным, особенно для определенных путей, отвечающих на повреждения, таких как NHEJ и TLS. Это является критическим для клеток, чтобы ограничить функцию этих мутагенных путей репарации ДНК и предотвратить дельнейшую геномную нестабильность.
Имеется несколько известных примеров белков репарации ДНК, которые модифицируются или ubiquitin или ubiquitin-подобными пептидами (Table 1). Эти модификации высоко динамичны и коррелируют с функциональным состоянием вовлеченных путей.
FA pathway regulated by monoubiquitylation
Убиквитилирование играет важную регуляторную роль в координации усилий путей репарации ДНК, связанных с повреждениями типа поперечных сшивок ДНК. В частности, HR и TLS частично регулируются с помощью кооперации множественных белков, которые участвуют в пути, который отвечает на агенты, вызывающих поперечные сшивки ДНК, и др. типы генотоксических стрессов. Разрушение этой группы белков с помощью генных мутаций приводи к редкому клническому синдрому, исзветному как (FA), аутосоно-рецессивному или Х-сцепленному синдрому, которые характеризуется нестабильностью и повышенной предрасположенностью к лейкемии и к сквамозным клеточным карциномам3,6-8.
Интересно, что один из FA белков, , специфически моноубиквитилируется по Lys561 в ответ на различные агенты. повреждающие ДНК, такие как mitomycin C (MMC), ionizing radiation (IR), ultraviolet light (UV) и hydroxyurea (HU)9. Моноубиквитилированный FANCD2 (FANCD2-monoUb) направляется затем в ассоциированные с хроматином ядерные фокусы, где он взаимодействует с белками, супрессирующими рак груди и яичников и (которые также функционируют как нижестоящий FA белок, FANCD1)10 и др. энзимы репарации ДНК11. Мутации Lys561 на Arg561 устраняют моноубиквитилирование FANCD2, последующее образование FANCD2 фокусов и способность FANCD2 восстанавливать дефекты репарации ДНК, как это показано на клетках, полученных от пациентов с дефицитом FANCD2. Интересно, что убиквитилирование FANCD2 отсутствует в большом субнаборе клеточных линий, происходящих от пациентов с FA, которые обладают мутациями генов, принадлежащих к разным группам комплементации, это указывает на то, что некоторые FA белки скооперированы на общем пути, который ведет к моноубиквитилированию FANCD29 (Fig. 1).
Пока известно 8 FA белков (FANCA, -B, -C, -E, -F, -G, -L и -M), которые, как известно, формируют комплекс в сердцевине ядра, который функционирует как ubiquitin ligase (E3)6 (Box 1). Каталитическая субъединица ligase, которая ответственна за убиквитилирование FANCD2, была недавно идентифицирована как PHF9 (известна также как FANCL), она содержит RING-подобный PHD домен12. Структура , который, как полагают, взаимодействует с неизвестным ubiquitin-conjugating enzyme (E2), как было установлено, существенна для убиквитилирования FANCD2 in vivo. Принимая во внимание, что потеря любой из 8 субъединиц нарушает образование комплекса и препятствует модификации FANCD2, всё ещё остается неясным, является ли FANCL непосредственной лигазой для FANCD2. FANCL и её E3-ligase активность могут способствовать формированию FA ядерного комплекса, который создает поддержку для рекрутирования др. E3 лигазы, чтобы осуществить активацию FANCD2. FANCL может подвергаться ауто-убиквитилированию in vitro, это указывает на то, что FANCL сама по себе является активной ubiquitin лигазой. Однако, может ли FANCL, в отсутствии или присутствии своего комплекса непосредственно моноубиквитилировать FANCD2 in vitro всё ещё неизвестно Более того, как др. 7 субъединиц оперируют в регуляции лигазной функции FANCL остается неясным. Имеются ли и др. FA белки в ядерном стержневом комплексе, участвующие в поддержании конформации и структурной интеграции лигазы, и могут ли они взаимодействовать с FANCD2 субстратом? Возможно ли, что комплекс выполняет дополнительную роль в репарации ДНК, такую как детекция поперечных сшивок ДНК (как показано на Fig. 1), которая могла бы быть независимой от её ubiquitin-лигазной функции?
Информация по этому вопросу была получена в недавнем исследовании DT40 клеток кур. Используя куриный FANCD2-ubiquitin слитый белок, который несет замену Lys→Arg в сайте моноубиквитилирования, они показали, что в FANCD2-дефицитных DT40 клетках этот слитый белок способен предупреждать гиперчувствительность к поперечным сшивкам ДНК и локализоваться коректно на хроматиновых структурах13. Однако, этот слитый белок оказался неспособным комплементировать FANCC-, FANCG- или FANCL-дефицитным клеткам, это указывает на то, что эти компоненты стрежневого комплекса выполняют дополнительную функцию в репарации ДНК, которая не зависит от моноубиквитилирования FANCD2.
Signal for FANCD2 monoubiquitylation. FANCM недавно была идентифицирована как degenerate (не-функциональная) эндонуклеаза, которая является ортологом archaeal репарации ДНК белка HEF (helicase-associated endonuclease for forked structured DNA)14,15. FANCM предположительно обладает helicase доменом, который может функционировать как ДНК транслоказа в in vitro . Это новая функция, которая ассоциирует с FA комплексом, может использоваться для распознавания и взаимодействия со структурами ДНК, которые являются промежуточными во время репликации и репарации поперечных сшивок. Это указывает на то, что помимо ubiquitin-ligase активности комплекс FA, который содержит FANCM, может также быть интимно вовлечен в поцесс репарации ДНК, вообще-то как сенсорный комплекс повреждений типа поперечных сшивок ДНК.
Неясно как связаны ubiquitin лигазная и по определению ДНК повреждений функции FA ядерного комплекса. Одной из возможностей является то, что основные члены FA комплекса активируются (путем фосфорилирования) вследствие повреждений ДНК, что приводит к повышению E3-лигазной активности, которая направлена на FANCD2. Напротив, FANCD2 сама по себе может быть фосфорилирована вследствие повреждения ДНК, что делает её прекрасным субстратом для моноубиквитилирования. Было показано, что (ataxia telangiectasia and Rad3 related) необходима для эффективного моноубиквитилирования FANCD2 (Ref. 16). Хотя FANCD2 может быть фосфорилирована с помощью ATR in vitro, однако, как ATR активирует FA путь всё ещё неясно. Недавно было показано, что FANCM гиперфосфорилируется после повреждения ДНК. Однако, природа, последствия и значение этого фосфорилирования всё ещё неизвестны14.
Downstream function of FANCD2 monoubiquitylation. Хотя регулируемое моноубиквитилирование FANCD2 является центральным событием в FA пути, точная функция FANCD2-monoUb неизвестна. Имеется несколько возможностей. Во-первых, FANCD2-monoUb, как известно, формирует комплекс с BRCA2, a BRCA2 регулирует стабильность репликационной вилки и рекрутирование . Доказательства роли FA пути в TLS получены в экспериментах по эпистазу с куриными DT40 клеточными линиями, в которых TLS error-prone полимеразы Rev1 или Rev3 скорее всего функционируют иерархически ниже куриной FANCC5. Хотя FA клетки являются гиперчувствительными crosslinking агентам, моноубиквитилирование FANCD2 может быть индуцировано с помощью разных типов повреждений ДНК. Итак, возможно, что нижестоящей функцией FANCD2-monoUb может быть более общая функция в репарации ДНК и поддержании генома.
Deubiquitylation of FANCD2. Подобно фосфорилированию, моноубиквитилирование является динамичным и обратимым процессом, причем энзимный каскад конъюгирует ubiquitin с белком мишенью. Семейство протеаз deubiquitylating enzymes (DUBs) может удалять эту модификацию (Box 1). Несколько линий доказательств указывают на то, что FANCD2-monoUb подвергается регулируемому деубиквитилированию. Напр., FANCD2-monoUb деубиквитилируется, когда синхронизированные клетки переходят от S фазы к G2 фазе или когда репарация поперечных сшивок ДНК закончена9,20. Чтобы идентифицировать специфический DUB энзим, который деубиквитилирует FANCD2-monoUb, мы скринировали библиотеку семейства генов специфичных для small interfering RNA (siRNA) на siRNAs, экспрессия которых вызывает накопление FANCD2-monoUb21. USP1 был идентифицирован в качестве DUB, который супрессирует уровни FANCD2-monoUb в отсутствие экзогенных повреждений ДНК. Вследствие повреждений ДНК USP1 и FANCD2 ко-локализуются в фракции хроматина. Пока неясно, как USP1 регулирует функцию FANCD2 в фокусах репарации ДНК. FANCD2 может быть активно убиквитилирован и деубиквитилирован во время последовательных раундов репарации ДНК внутри репаративных фокусов хроматина или USP1 может просто деубиквитилировать FANCD2 только после того, как закончится репарация всего генома, после высвобождения FANCD2 с хроматина. Известны сообщения о пациентах, которые имеют FA-подобный фенотип и несут мутации в USP1. Однако, функциональный анализ USP1 показывает, что потеря USP1 в результате siRNA ингибирования делает клетки более резистентными к MMC-индуцированным разрывам хромосом21, это указывает на то, что ингибирование USP1 вряд ли вызывает FA. В целом эти данные подтверждают ключевую роль USP1 в негативной регуляции FA пути.
Role of BRCA1 in the FA pathway. Белок, супресструющий рак груди и оварий BRCA1, содержит законсервированный RING домен и формирует гетеродимер с др. RING-доменовым белком, BARD1. Неожиданно оказалось, что BRCA1-BARD1 комплекс может млноубиквитилировать FANCD2 in vitro. Однако, генетические доказательства показывают, что моноубиквитилирование FANCD2 in vivo не нуждается в BRCA1 или BARD1 (Refs 9, 22). Хотя потеря продукта гена BRCA1 тяжело нарушает формирование фокусов FANCD2, но функция BRCA1 в FA пути остается неясной. Необходима ли ubiquitin-ligase активность BRCA1 для субнабора ДНК повреждений, индуцируемых моноубиквитилированием FANCD2, или для формирования фокусов, пока неизвестно.
Недавние исследования показали, что BRCA1-BARD1 комплекс катализирует синтез новой auto-polyubiquitin цепи посредством Lys6 остатка убиквитина, который потенциирует его E3-лигазную активность более чем в 20 раз23. Убиквитилирование in vitro различных гистоновых белков, особенно H2AX, с помощью этого E3-лигазного комплекса указывает на участие BRCA1 в ремоделировании хроматина. Учитывая, что деплеция или потеря активности BRCA1 тяжело затрагивает формирование ядерных фокусов из многих ДНК-репарирующих факторов, включая FANCD2, то BRCA1 может быть важным для регуляции доступности хроматина для множественных процессов репарации ДНК. Белковые мишени и функциональное занчение BRCA1-BARD1-индуцированного полиубиквитилирования, пока неизвестны. Др. возможной мишенью для BRCA1-BARD1-зависимого убиквитилирования является РНК полимераза II24. Комплекс BRCA1, как было показано, ассоциирует с РНК полимеразой II как частью TCR пути25. Прямая связь между BRCA1-BARD1 и убиквитилированием РНК полимеразы II, однако, не установлена. Т.к. большинство missense мутаций, обнаруживаемых при BRCA1-сцепленном раке груди, происходит в RING домена BRCA1, то вполне возможно, что ubiquitin-ligase активность BRCA1 является важной для его ДНК-репарирующей и и опухоль-супрессирующей активности26.
Интересно, что BRCA1 ассоциирует также с комплексами репарации ДНК, которые содержат DUBs, такими как BRCC36 и BAP1 (Refs 27, 28). BRCC36 относится к новому семейству цинк-координирующих с законсервированным мотивом27, который важен для их активности по ферментативному расщеплению. JAMM-типа metalloproteases, как недавно было показано, обладают ubiquitin или ubiquitin-подобной протеазной активностью29. Потеря BRCC36 сенсибилизирует клетки к IR и эти клетки имеют дефекты в G2/M checkpoint. Неясно, могут ли физиологические субстраты для этих DUBs быть аутоубиквитилированным BRCA1 или др. белками репарации ДНК, которые обнаруживаются в этих комплексах или в фокусах репарации ДНК в хроматине.
Regulation of TLS by monoubiquitylation
У Saccharomyces cerevisiae, репликационная скользящая манжетка PCNA подвергается sumoylation во время обычного хода S-фазы и убиквитилированию вследствие повреждения ДНК. PCNA собирается в тримерное кольцо, которое охватывает ДНК и рекрутирует как репликативную, так и специализированные TLS полимеразы во время нормальной репликации ДНК и пост-репликатиновй репарации ДНК. Во время S клеточного цикла фракция PCNA обычно sumoylated (PCNA-SUMO) с помощью SUMO-специфического E2 энзима, Ubc9, по двум специфическим остаткам Lys, один из которых (Lys164) высоко законсервирован от дрожжей до человека30. После повреждений ДНК с помощью УФЛ или др. моноалкирлирующего агента, PCNA моноубиквитилируется (PCNA-monoUb) по тому же самому законсервированному остатку Lys с помощью Rad6 (E2 энзима) и Rad18 (RING-доменового E3 энзима, который соединяется с single-stranded DNA (ssDNA)). Дрожжевая Rad6 эпистатическая группа репарации ДНК состоит из белков (Rad6, Rad18, Ubc13, Mms2 и Rad5), которые воздействуют на репликационную кухню (machineries), которая останавливается благодаря повреждению ДНК. Такая репарация может быть достигнута с помощью, по крайней мере, двух разных Rad6-зависимых механизмов. Один механизм рассматривается как более склонный к ошибкам, т.к. он использует TLS полимеразы. которые вставляют корректные и некорректные нуклеотиды над поврежденным сайтом. Др. Rad6-зависимый способ свободен от ошибок, т.к. он использует информацию от неповрежденного сестринского duplex в репликативной вилке (для обхождения в пути избегания повреждений). Rad18 и Rad5 являются двумя ubiquitin лигазами, которые взаимодействуют с хроматином и ассоциируют с E2 энзимами, Rad6, или Ubc13 и Mms2, соотв., при дрожжевом двугибридном анализе31. PCNA-monoUb, как полагают, активирует TLS посредством толерантных к повреждениям полимераз у дрожжей, приводя к обходу повреждений ДНК и увеличению или вызыванного поврежениями ДНК мутагенеза иди к склонной к ошибкам репарации ДНК30-33.
Интересно, что PCNA-monoUb может дальше полиубиквитилироваться (PCNA-polyUb), посредством Lys63 of ubiquitin (see Box 1), благодаря действию Ubc13-Mms2 (гетеродимерной E2) и упомянутой выше Rad5 ( RING-доменовой E3)30. PCNA-polyUb существенна для безошибочной репарации поврежденной ДНК и пути избегания повреждений, т.к. делеционные мутанты энзимов, которые участвуют в Lys63 полиубиквитилировании (Ubc13, Mms2 и Rad5), и точковые мутации Lys63 убиквитина и законсервированные сайты убиквитилирования (Lys164) PCNA у дрожжей, обеспечивают гиперчувствительность к ДНК-повреждающим агентам30,34,35. Итак, одиночный остаток Lys в PCNA может подвергаться трем разным модификациям: sumoylation, monoubiquitylation и polyubiquitylation.
Каждый тип модификации PCNA приводит к разным исходам, к синтезу, репарации и мутагенезу ДНК. Законсервированный остаток лизина стратегически расположен на внешней стороне обрамления PCNA кольца и , следовательно, в оптимальном положении для рекрутирования отдельных факторов кухни синтеза и репарации ДНК, в зависимости от специфической модификации (т.е., SUMO, ubiquitin или polyubiquitin цепи), которая затрагивает остаток Lys. Недавно две группы продемонстрировали, что sumoylation PCNA по Lys164 рекрутирует helicase SRS2 на место остановки репликационной вилки36,37. Функция SRS2 заключается в непосредственной супрессии внеплановой HR посредством разрушения RAD51 nucleofilaments. Итак, sumoylation PCNA может ингибировать HR и может, следовательно, способствовать RAD6 пострепликативному пути репарации посредством моноубикситилирования и/или полиубиквитилирования PCNA.
Monoubiquitylation of PCNA in humans. Регуляция пострепликативной репарации у дрожжей с помощью ubiquitin и SUMO была продемонстрирована с использованием генетической и биохимической техники. Однако, неясно какие элементы механизма дрожжей законсервированы в системе млекопитающих. Недавние исследования на клетках человека показали существование законсервированного RAD6/RAD18-зависимого пути моноубиквитилирования PCNA38,39, т.к. эти модификации появлялись также на Lys164 PCNA человека и индуцировались с помощью УФЛ, HU и др. химических мутагенов. Kannouche et al. показали , что из Y-семейства TLS polymerase, poleta, преимущественно взаимодействует с PCNA-monoUb, это указывает на то, что моноубиквитилирование PCNA может индуцировать функциональное переключение с высоко-точного processive процесса репликации ДНК на с низкой точностью обхождение повреждений TLS38 (Fig. 2). Более того, было продемонстрировано, что RAD18 непосредственно ассоциирует с poleta и способен рекрутировать poleta на репликативные фокусы, в которых участвует TLS39.
Функция poleta заключается в основном в последующей аккуратной репликации cyclobutane pyrimidine dimers (CPDs) после повреждений УФЛ40,41. Пациенты с мутациями в гене poleta чувствительны к облучению УФЛ и фенотипически связаны с чувствительностью к УФЛ и УФЛ-индуцированной чувствительностью к раку кожи у пациентов с xeroderma pigmentosum (XP); эти poleta генные мутации представлют собой XP variant (XPV) группу комплементации. XPV клетки гипермутабильны после облучения УФЛ из-за отсутствия обусловленной poleta функции полимеразы безошибочного обхождения (bypass). Др. TLS полимеразы могут замещать poleta, такие как poliota, polkappa, REV1 и polzeta (которые содержат субъединицы REV3 и REV7), хотя они обнауживают склонность быть мутагенными во время синтеза ДНК при обхождении повреждения42. Биохимические исследования показали, что REV1 может взаимодействовать с polzeta, polkappa или poleta независимо43-46, возможно она выполняет функцию поддержки (scaffolding). Неясно, как рызные TLS полимеразы координируются, чтобы действовать вместе с PCNA во время пост-репликативной репарации. Показано, что дрожжевая PCNA-monoUb может непосредственно активировать TLS посредством дрожжевой poleta и Rev1 в системе in vitro47. Интересно, что PCNA-monoUb обладает той же самой репликативной функцией на неповрежденной матрице, что и немодифицированная PCNA. Это указывает на то, что PCNA-monoUb обладает повышенной функциональностью в качестве скользящей манжетки, чтобы способствовать TLS репликации ДНК.
Вплоть до недавнего времени казалось, что только poleta взаимодействует непосредственно с PCNA-monoUb. Это взаимодействие, как полагали, происходит посредством UBD, известного как CUE домен38, но недавно Ivan Dikic и др. установили, что Y-семейства TLS полимеразы соедержат два новых типа UBD, известных как UBM (Ub-binding motif) и UBZ (Ub-binding zinc-finger)48. Напр., REV1 и близкий гомолог poleta, poliota, имеют два UBM домена, тогда как poleta и polkappa имеют два UBZ домена каждая. Эти новые UBDs могут взаимодействовать с PCNA-monoUb или с самой свободной половинкой ubiquitin. Интересно, что UBM домен в poliota необходим для поставки poliota в фокусы ДНК репликации и ДНК повреждений в клетках. Всё это указывает на генеральную функцию UBM и UBZ доменов TLS полимераз в их взаимодействии с убиквитилированными белковыми рецепторами или с ассоциированными с хроматином партнерам по связыванию48.
Некоторые из TLS полимераз, такие как poleta and poliota, также могоубиквитилируют самих себя, но эти модификации, по-видимому, не индуцируются повреждениями ДНК48. Функция моноубиквитилированных полимераз TLS пока неизвестна. Предполагается, что эти внутренне присущие модификации могут изменять их полимеразную активность и свойства нахождения субстрата. Интересно, что делеция UBDs устраняет моноубиквитилирование этих специализированных полимераз, это указывает на то, что UBDs могут участвовать в рекрутировании E2 или E3 энзимов на полимеразы (I. Dikic, personal communication).
Signal for PCNA monoubiquitylation. Моноубиквитилирование PCNA в клетках человека нуждается в RAD6 и RAD18 ubiquitin энзимах. Событие убиквитилирования происходит в ответ на УФЛ, HU и др. ингибиторы репликации, это указывает на то, что остановка репликативной вилки может быть первичным сигналом для убиквитилирования PCNA38. Экспозиция ssDNA во время процессинга репликативных блоков рекрутирует ssDNA-связывающий белок replication protein A (RPA) на остановившуюся вилку, этого может быть достаточно для того, чтобы RAD18 соединилась и активировала убиквитилирование PCNA49. Напротив, белки checkpoint клеточного цикла, такие как ATM (ataxia telangiectasia mutated) и ATR, могут выполнять более служную роль в стимуляции активности RAD18 на репликативной вилке. In vitro исследования Garg and Burgers показали, что максимальное Rad6-Rad18-засисимое моноубиквитилирование дрожжевой PCNA происходи только тогда, когда PCNA загружена на ДНК с помощью replication factor C (RFC) на соединение матрица-праймер, но не на unprimed ssDNA47. Итак, RAD18-обусловленное моноубиквитилирование PCNA млекопитающих возможно стимулируется с помощью структурного события на конце праймера. Интересно, что RAD18 также моноубиквитилируется и полиубиквитилируется RAD6-зависимым способом50. Неясно, могут ли или нет эти модификации RAD18 играть роль в её ubiquitin-ligase активности. Результаты этого исследования показывают, что моноубиквитилированная RAD18 исключается из ядра, тогда как полиубиквитилированная RAD18 направляется на путь деградации. Пока неизвестно, какие физиологические изменения могут детерминировать степень изменений в локализации и флюктуациях на уровне белка RAD18.
Deubiquitylation of PCNA. Считается, что как только poleta осуществит расширенный синтез ДНК после УФЛ фотопродуктов, она быстро освобождается от PCNA, чтобы предупредить склонный к ошибкам синтез ДНК с неповрежденной матрицы. Kunkel и др. показали, что poleta м. вставлять и наращивать посредством CPDs с такой же точностью, как если бы матрица была интактной51. Однако, poleta не является очень processive и после увеличения на один или два основания за повреждением её эффективность и точность существенно снижается, что ведет к её диссоциации с матрицы. Внутренне присущие свойства poleta могут быть, следовательно, достаточны, чтобы вызвать её диссоциацию с матрицы, что делает возможной последующую репликацию с помощью processive или репликативной полимераз.
Разные TLS полимеразы безусловно обладают уникальными внутренне присущими активностями in vitro,но неизвестно, что диктует из использование в зависимости от клеточного контекста. Подходы, которые были использованы для определения функции TLS-polymerase, проводили в отсутствие PCNA. Поэтому интересно бы определить, остается ли PCNA убиквитилированной, когда прогресс репликативной вилки восстанавливается после обхождения репликацией повреждений в клетке. Напротив, может быть необходимым для PCNA быть деубиквитилированной чтобы осуществить 'switch back' на её функцию высоко-точного зависимого от репликативной полимеразы синтеза после завершения обхода повреждения.
Исследования в нашей лаб. идентифицировали USP1 в качестве DUB, который расщепляет PCNA-monoUb в клетках млекопитающих104. USP1 может непосредственно деубиквитилировать PCNA in vitro, a siRNA нокдаун USP1 в клетках драматически увеличивает уровни моноубикивтилированного PCNA, как в отсутствие, так и в присутствии повреждений ДНК. Следовательно, возможно, что склонная к ошибкам активность TLS является платой за деубиквитилирующую активность USP1 в отсутствие повреждений от УФЛ. Многие вопросы ещё предстоит решить. Обусловлено ли переключение с TLS на processive репликацию с помощью DUB функции, такой как функция USP1,или имеются др. регуляторные события, которые управляют использование разного типа полимераз? PCNA-monoUb может просто делать доступным хроматин для TLS полимераз, так что они могут находить остановившуюся репликативную вилку. PCNA-monoUb может , следовательно, контролировать микроусловия TLS, скорее, чем управлять сигналом для переключения полимераз. Существуют ли DUBs или SUMO протеазы. которые могут регулировать или склонную к ошибкам или безошибочную репликацию во время пост-репликативной репарации? Необходимо отметить, что роли PCNA-SUMO и PCNA-polyUb неизвестны в клетках млекопитающих, т.к. эти события модификаций ещё не описаны. В более раннем исследовании Maher и др. было показано, что MMS2 человека, ортолог варианта E2 ubiquitin-conjugating энзима, который ответственен за полиубиквитилирование PCNA у дрожжей, существенна для использования дочерней нити сестринского дуплекса в качестве матрицы для пути избегания повреждений в клетках человека52. Недавно была описана роль моноубиквитилирования и сумоилирования PCNAв экстрактах яиц Xenopus laevis53. Было предположено, что модификации PCNA также могут участвовать в контроле скорости репликации во время S фазы.
Regulation of NER by polyubiquitylation
NER является разносторонним путем репарации ДНК, который устраняет различные спираль нарушающие повреждения оснований, включая индуцированные УФЛ CPDs, pyrimidine-pyrimidone (6-4) фотопродукты (6-4PP) и большие adducts, индуцированные в результате воздействия многочисленными химическими соединениями. NER определяет порядок многоступенчатой реакции и нуждается в скорординированном действии приблизительно 30 белков, которые участвуют в детекции повреждений, открытии спиали, верификации повреждения, в двоных разрезах поврежденной нити, удалении 25-30-оснований нити ДНК, содержащей повреждение, заполнении пробела синтезом ДНК и лигацией2,54. Нарушение активности NER ассоциирует с несколькими редкими аутосомно-рецессивными нарушениями у людей, такими как XP и синдром Cockayne (CS)2,55.
NER can operate through two pathways: GGR and TCR. Путь GGR репарирует повреждения ДНК по всему геному, тогда как путь TCR удаляет повреждения ДНК существенно быстрее с транскрибируемой нити или с большей части генома56. Пациенты с XP клинически характеризуются гиперчувствительностью к солнечному свету и имеют предрасположенность к раку кожи. Исследования по слиянию клеток выявили 7 комплементарных групп XP (XPA, -B, -C, -D, -E, -F и -G). В целом пациенты с мутациями в XPA, -B, -D, -F или -G дефектны по TCR и GGR, в то время как те же самые мутации в XPC дефектны только по GGR.
XPE-дефицитные клетки лишены активности, которая связывает с поврежденной ДНК (CPDs и 6-4PPs), это важно для GGR. Эта активность ассоциирует с UV-damaged-DNA-binding компонентом, DDB, который состоит из DDB1 (p127) и DDB2 (p48) субъединиц. Мутации в гене DDB2 вызывают фенотип генетической комплементационной группы XPE, пациенты, которые принадлежат к этой группе, лишены активности DDB по связыванию с повреждением. Точный механизм того, как DDB вносит вклад в NER, неясен. Однако, установлено, что DDB является частью первой ступени в распознавании повреждений для GGR, т.к. он рекрутирует факторы, такие как XPC-HR23B на поврежденную ДНК57,58.
Подобно пациентам с XP, пациенты с CS обнаруживают гиперчувствительность к солнечному свету. Напротив, пациенты с CS не обнаруживают предрасположенности к раку. Однако, они обнаруживают тяжелые онтогенетические и неврологические аномалии, а также преждевременное старение59. Классический CS вызывается мутациями или в CSA или CSB гене. CS клетки, которые дефицитны или по CSA или CSB белкам искусны в GGR, но обнаруживают дефект в TCR. Интересно, что мутации в XPB, XPD и XPG генах также объясняют небольшое количество случаев CS, указывая тем самым, что продукты этих генов также участвуют в TCR. Такие пациенты обладают комбинированными признаками XP и CS.
Ubiquitin ligase activity of DDB2 and CSA complexes. Недавнее исследование Nakatani и др. показало, что DDB2 и CSA белки существуют в отдельных, но почти идентичных, больших молекулярных комплексах внутри клетки60. DDB2 и CSA каждый интегрируется в эти комплексы посредством взаимодействия с DDB1. Интересно, что комплексы содержат CUL4A (cullin-4A) и ROC1, которые являются ubiquitin-ligase субъединицами. Два комплекса содержат также COP9 signalosome (CSN), известный негативный регулятор . Однако, очищенные DDB2 и CSA комплексы во всей своей полноте не обладают ubiquitin-ligase активностью. С др. стороны, частичные комплексы, которые были лишены CS , обладают мощной ubiquitin-лигазной активностью. Это указывает на то, что CSN может негативно регулировать лигазные функции этих комплексов. CSN5, каталитическая субъединица CSN, может деконъюгировать как ubiquitin-модифицированные, так и NEDD8 (neuronal-precursor-cell-expressed developmentally downregulated protein-8)-модифицированные виды CUL4A.
В предыдущей работе группы Deshaies было продемонстрировано, что Schizosaccharomyces pombe CSN5 содержит JAMM metalloprotease домен, который функционирует как каталитический сайт для активности NEDD8-isopeptidase, которая ингибирует cullin-based ubiquitin лигазу29. Как упоминалось в Box 2, конъюгация NEDD8 на cullins стимулирует 61. Интересно, что хотя и DDB2 и CSA комплексы содержат CSN, ассоциация CSN с этими комплексами по-разному регулируется с помощью повреждений УФЛ. В комплексе DDB2, CSN быстро диссоциирует из комплекса после облучения УФЛ, позволяя CUL4A в комплексе модифицироваться с помощью NEDD8. Это указывает на то, что ubiquitin-лигазная активность комплекса DDB2 стимулируется в ответ на воздействие УФЛ. Предполагается, что после репарации повреждений ДНК от УФЛ CSN повторно ассоциирует с DDB2 комплексом, приводя к деконъюгации NEDD8 с CUL4A и к последующей инактивации её E3 активности.
Для комплекса CSA, воздействие УФЛ стимулирует быструю ассоциацию CSN с CSA, приводя к супрессии ubiquitin-ligase активности. При TCR, процесс, который нуждается в РНК полимеразе II и останавливает РНК полимеразу на нити транскрибируемой ДНК, д. служить в качестве активирующего сигнала для сборки TCR. Остаётся неясным, как ингибирование ubiquitin-ligase активности комплекса CSA в присутствии остановленной транскрипционной кухни будет облегчать TCR.
Polyubiquitylation of XPC. Недавнее исследование Sugasawa et al. показало, что DDB2 ubiquitin-ligase комплекс участвует в убиквитилировании XPC, генного продукта, который необходим для GGR в месте поврежднной ДНК после облучения УФЛ62 (Fig. 3). Белок XPC существует in vivo в виде гетеротримерного комплекса с одним из двух гомологов у млекопитающих S. cerevisiae Rad23, HR23A и HR23B. Обычным партнером XPC является HR23B, но в отсутствие HR23B, HR23A может его замещать63,64. Этот комплекс соединяется с разного типа NER повреждениями in vitro, возможно благодаря распознаванию вторичной структуры ДНК скорее, чем собственно повреждений65. Как упоминалось выше, UV-damaged-DNA-binding белок DDB также участвует в распознавании повреждений в GGR из NER. DDB может транслоцироваться на места, поврежденные УФЛ, в ядре даже в отсутствие XPC, это указывает на то, что DDB может действовать нгаа более ранней ступени в GGR, чтобы рекрутировать XPC и тем самым найти поврежденное место66.
Sugasawa и др. попытались показать, что DDB-индуцированное полиубиквитилирование XPC, по-видимому, обратимо и что XPC не является субстратом для протеасом. Хотя они и не определили типы формируемых полиубиквитиновых цепей (то ли Lys48- то ли Lys63-сцепленные цепоки) (Box 1), они предположили, что убиквитилированный XPC может каким-то образом защищать от обеспечиваемо протасомами деградации. Один возможный механизм стабилизации, может функционировать посредством функции HR23A и HR23B, т.к. было показано, что HR23 белки стабилизируют XPC путем взаимодействия с ubiquitin-associated (UBA) доменом HR23 белков, и предупреждает их деградацию с помощью ubiquitin-proteasome пути67,68. В согласии с этим мнением исследования на дрожжах, показавшие, что Rad23 взаимодействует биохимически и функционально с регуляторными субъединицами протеосом, не вызывая деградации, чтобы способствовать NER69-71.
Они также установили, что DDB2, даже если он убиквитилирован с помощью самого DDB комплекса, по-видимому, деградирует после иррадиации УФЛ. Интересно, что судьбы убиквитилированных XPC и DDB2 совершенно различны, несмотря на тот факт, что оба белка модифицируются одним и тем же E3-ligase компонентом. В то время как полиубиквитилированный DDB теряет свою активность связывания поврежденной ДНК, связывание ДНК у XPC усиливается за счет убиквитилирования. Это приводит в конечном итоге к вытеснению DDB с помощью XPC с повреждения, приводя к деградации, DDB с помощью протеосом. Даже хотя эти комбинированные наблюдения указывают на новые функции убиквитилирования в распознавании и репарации повреждений ДНК, ключевой вопрос остается необъясненным. Напр., места убиквитилирования на XPC и DDB2 не были картированы, а это могло быть информативным для генерации дефектных по убиквитилированию мутаций XPC и DDB2, чтобы выявить их роль в NER боле четко. Было бы также интересно идентифицировать факторы, которые взаимодействуют специфически с убиквитилированными XPC и/или DDB2.
Polyubiquitylation of RNA polymerase II. Как было описано выше, повреждения ДНК в кодирующих нитях активных генов представляют серьёзную угрозу для клеток эукариот и уникальные механизмы TCR участвуют в репарации этих повреждений. В процессе TCR, кодирующая (транскрибируемая) нить репарируется значительно быстрее, чем некодирующая нить. Клетки имеют дело с транскрипционными блокадами из-за полиубиквитилирования РНК полиеразы II.
Интересно, что CS клетки, дефицитные по индуцированному УФЛ убиквитилированию РНК полимеразы II, указывают на то, что нормальные клетки в ответ на облучение УФЛ активируют CSA- и CSB-зависимое полиубиквитилирование РНК полимеразы II72. Полиубиквитилированная РНК полимераза II может затем или подвергаться деградации или обходит транскрипционный блок и продолжать синтез мРНК. Показано, что CSA и CSB бели очищаются совместно с CSN комплексом и что этот комплекс обладает E3-ligase активностью60. Пока ещё не установлено, может ли активность этой E3-ligase направлена также на РНК полимеразу II. Также не установлен ни тип полиубиквитилирования (через Lys6, Lys48 или Lys63, напр.), ни молекулярная функция убиквитилированной РНК полимеразы II. Роль BRCA1-BARD1 в TCR (как упоминалось выше) также неясна. Недавние находки показали, что этот E3-ligase комплекс участвует в инициации деградации остановленной РНК полимеразы II73.
Исследования на дрожжах Svejstrup и др. показали функциональную связь между TCR и деградацией РНК полимеразы II: Rad26, дрожжевой ортолог CSB, взаимодействует с Def1 - белком, который необходим для убиквитилирования РНК полимеразы II в ответ на повреждение ДНК, но не для TCR74. Наоборот, хотя Rad26 необходим для нормальной TCR, он не нужен для деградации РНК полимеразы II. Итак, следующая модель была предложена для описания того, как клетка борется с остановленной повреждением РНК полимеразой II. Осуществляется быстрая репарация повреждения с помощью Rad26-обусловленной TCR. Однако, если этого не происходит, то РНК полимераза II должна деградировать вследствие Def1-обусловленного убиквитилирования и пути деградации. Это позволяет повреждению ДНК иметь дело позднее с GGR75.
Regulation of BER by sumoylation
Thymine-DNA glycosylase (TDG) является энзимом BER, который расщепляет glycosidic связь T или U, когда эти основания неправильно спариваются с G (Refs 76, 77). Расщепление приводит к генерации сайта без основания (abasic) в двунитчатой ДНК, которое затем выщепляется с помощью apurinic и apyrimidinic endonuclease (APE). Вырезание с помощью APE ведет к замещению сайта C основанием, который соответственно спаривается с G.
Важным событием этого процесса выщепления является высвобождение субстрата (T или U), чтобы создать место без основания. Schar и др. впервые продемонстрировали, что TDG энзим sumoylated (т.е., конъюгирует с SUMO1 модификатором) in vitro78. Ковалентное прикрепление SUMO1 к C-терминальной области TDG, как было позднее установлено, редуцирует сродство TDG к AP сайту. Интересно, что это событие sumoylation делает возможным быструю замену G-U неправильного спаривания (Fig. 4).
недавно Steinacher and Schar продемонстрировали, что изменение в сродстве TDG и каталитической активности в отношении G-U и G-T несоответствий является непосредственным результатом sumoylation белка79. Sumoylation C конца TDG индуцирует конформационное изменение N конца белка. Эта модификация ведет к эффективному высвобождению продукта с модифицированной ДНК матрицы.
Sumoylation этого репарирующего ДНК энзима предоставляет важный пример широкого круга эффектов модификации белка. Для др. белков sumoylation (Box 2), как было показано, увеличивает стабильность путем ингибирования полиубиквитилирования того же самого лизинового остатка (sumoylation I&kappa:Bα, ингибитора ядерного фактора (NF)κB)79, изменяя ассоциации субстрата associations с др. белками партнерами (sumoylation of PCNA у дрожжей) и изменяя субклеточную локализацию белков (sumoylation of RanGAP или NEMO)80. Сумоилирование TDG, которое меняет ферментативную активность белка, расширяет увеличивающийся список функций, которые приписываются SUMO модификатору81. Было бы интересно исследовать, является ли важным desumoylation TDG с помощью специфической SUMO протеазы в регуляции BER у людей. С помощью тщательной регуляции высвобождения энзима посредством контроля конъюгации SUMO и возможно deconjugation, клетка может защищать abasic сайты ДНК и ограничивать их расщепляющие активности на AP сайтах.
Conclusions and future directions
At least three of the five major DNA-repair pathways — HR, NER and BER — are regulated by ubiquitin or a ubiquitin-like modification. Probably the remaining two pathways, MMR and NHEJ, will also include ubiquitin-mediated regulatory events. In addition, the TLS pathway is regulated by ubiquitylation and sumoylation events. Each of these events are probably governed by distinct pairs of E2 and E3 enzymes, DUBs and other protein partners that harbour UBDs. Based on the examples, the predicted function of these newly identified ubiquitylation events might involve the regulation of repair-complex assembly, targeting, substrate recruitment and the catalytic activity of DNA-repair enzymes. We speculate that these post-translational events might also provide attractive cancer therapeutic targets (Box 3) that inhibit specific DNA-repair pathways in order to promote the chemosensitization of tumours.
