Все субклеточные единицы макро-молекулярной кухни (machinery) сложны, и как предполагается в работе из Journal of Biology [1] способ, с помощью которого они оперируют ещё более сложен, чем предполагалось ранее (см 'The bottom line' box). Многие факторы, ассистируют рибосомам в их бизнесе по сращиванию аминокислот вместе в соответствии с инструкциями в мРНК, так что образуется белок. До сих пор предполагалось, что критический, GTPase elongation factor-G (EF-G), попадает на рибосому в GTP-связанной форме, способствуя транслокации peptidyl-tRNAs посредством рибосомы и отделяется от рибосомы вследствие гидролиза GTP (see 'Background' box). Но работы группы исследователей показали, что EF-G фактически соединяется с рибосомами в виде GDP-связанной формы и что обеспечением доставки GTP управляют рибосомы, находясь в промежуточном состоянии. Они также полагают, что жизненно важной ступенью на этом пути является высвобождение энергии из GTP молекул, стимулируемое рибосомами, а не неким мистическим несуществующим фактором, как полагали ранее. Рибосомы являются критическими для каждой клетки и их структура и функция высоко законсервированы у всех организмов. Они состоят главным образом из двух рибосомальных субъединиц, которые скреплены вместе подобно раковине моллюска, остатком центрального канала, через который мРНК

The bottom line The energy required for the translation of mRNA into peptide is provided by GTP, but it has been unclear exactly how and when the energy is released and put to use. o New purification and affinity studies show that the translation elongation factor EF-G has a 60-fold greater affinity for GDP than GTP, making it most probable that EF-G enters the ribosome in GDPbound form. o EF-G.GDP drives the ribosome into a recently described intermediary structural configuration during translocation. o The conditions within the ribosome cause GDP to be exchanged for GTP, with the ribosome itself appearing to act as a guanine-nucleotide exchange factor (GEF) for EF-G; EF-G then adopts a second conformation, driving translocation halfway. o GTP hydrolysis leads to a third structure of EF-G, which drives translocation to completion; EF-G adopts its entry structure and then leaves the ribosome.

вытягивается. Вдоль канала расположены три самостоятельных сайта, сформированные двумя субъединицами (Figure 1). Первый является aminoacyl (A) сайтом, куда свободно-странствующая заряженная молекула tRNA приносит свою соотв. аминокислоту, соединяется, если её антикодон находит соотв. последовательность на мРНК. Далее в канале находится peptidyl (P) сайт, который оккупируется tRNA, которая появилась на момент раньше и теперь удерживает не только свою собственную аминокислоту, но и посредством её формируемый пептид. Этот растущий пептид дополняется теперь аминокислотой, удерживаемой вновь прибывшей tRNA в сайте A и tRNAs протягивается через канал. tRNA, которая перед этим была в сайте P теперь находится на сайте (E) site, третьим в серии и когда процесс запускается снова, то tRNA д. выбрасываться в цитозоль.

Это в целом не противоречиво. Споры начинаются, когда углубитесь в детали. Транслокация tRNA и мРНК через рибосому нуждается в энергии и она поставляется за счёт гидролиза GTP в GDP. Большинство учебников показывает GTP привносится на рибосому, прикрепленный к EF-G. Теперь, однако, Andrey Zavialov et al. [1] показали, что цитозольный EF-G обладает в 60-раз более значительным сродством к GDP, чем к GTP, так что скорее всего, что EF-G доставляет GDP на рибосому. Их исследование, базируется на полной очистке GDP от GTP, тогда как предыдущие измерения производились с GTP, содержащей некоторое загрязнение GDP (и vice versa).

Background The two ribosomal subunits differ between prokaryotes and eukaryotes, but both types include a smaller and a larger subunit, each contributing to the three sites - A, P and E - to which aminoacyltRNAs bind. o GTP hydrolysis releases energy to drive the translocation of mRNA and tRNA through the ribosome, and is catalyzed by the GTPase elongation factor (EF-G). All known GTPases are acted on by guanine-nucleotide exchange factors (GEFs) that promote the exchange of GDP for GTP, and GTPase-activating proteins (GAPs) that stimulate the catalytic activity of the GTPase. The GTPase then cycles between GTP- and GDP-bound forms, acting as a molecular switch. o Molecular motor proteins, by contrast, utilize the hydrolysis of ATP or GTP to drive movement within cells, taking successive 'steps' with successive hydrolyses. o Translocation within the ribosome requires GTP hydrolysis, but it has not been clear precisely how the energy is used, or at what step the hydrolysis occurs. Numerous translation elongation factors, such as EF-G, cooperate with the ribosome to drive the process of growing a peptide (elongation).

Эта находка, Zavialov et al. [1] сделала возможным заявление "We believe that when EF-GoGDP enters the ribosome, this alone causes the ribosome to move into the hybrid configuration identified initially by Harry Noller," Mеns Ehrenberg, проф. Molecular Biology at Uppsala University (см. 'Behind the scenes' box). Noller, который работал в University of California, Santa Cruz, показал в 1989, что во время транслокации tRNAs оказываются связаны с гибридными сайтами, сцепляя A сайт на малой субъединице с P на большой, a P сайт на малой субъединице с E сайтом на большой [2].

Zavialov et al. [1] полагают, что рибосомы в этой гибридной конфигурации несколько меняются структурно и это радикально меняет относительное сродство GDP и GTP к EF-G, так что GDP просто обменивается на GTP. "The ribosome now helps EF-G to adopt its GTP-bound conformation," говорит Ehrenberg. В эффекте на рибосому играет роль guanine-nucleotide exchange factor (GEF) для EF-G. "I think that if this holds up it is really a novel discovery that EF-G in the GDP-bound form binds to the ribosome and the ribosome itself is the guanine-nucleotide

Behind the scenes Journal of Biology asked Mеns Ehrenberg and Andrey Zavialov about their sources of motivation and hopes for the future. What motivated this work? This question of how ribosomes and translocation work has been hanging around for 30 years and goes through all kingdoms of life. If we don't know the basic biochemical facts of translocation then we can't make use of the wonderful information coming from crystal studies and from cryoelectron microscopy. Rodnina, Wintermeyer and their co-workers in Witten came up with their 'motor' idea and afterwards, we decided to address the problem in our own laboratory - it was hard to understand how EF-G in the GTP-bound form and the peptidyl-tRNA could be bound to the ribosome without moving each other. The other idea behind our work was to unify the mechanism of action of the GTPases that work in translation by showing that all of them work as molecular switches and require a guanine-nucleotide exchange factor (GEF) to convert them in the active GTP-bound form. How long did the work take? The experimental work took three or four years of very intense work with two students. The initial idea was explained in our paper published in 2003 but it took at least one year to develop new methods and finalize the results. What were your initial reactions to your findings? When you see something new there is a very pure joy. It has nothing to do with your ego or your career… just pure gold. And also amazement. It's a challenge to stay cool and treat the results critically before gathering enough information to build a new model. How have the results been perceived by others? There were so many new things here that the response has tended to be "this has been very interesting and you should bring it further" - although it is always easier to disbelieve than to accept a new idea. What are the next steps, and what does the future hold? We will certainly try to catch the proposed missing structure by any means - the one we have so far has not been seen by any structural analysis. We will try cryo-electron microscopy and lower-resolution measures, including chemical footprinting, to try to characterize it. We will use fast kinetics with fluorescence stop flow - it won't escape. The future is never clear, but we try to make it more predictable

exchange factor," заявляет Simpson Joseph, который работает со структурой, функцией и динамикой рибосом в Department of Chemistry and Biochemistry at the University of California, San Diego. "It was always a mystery how the exchange of GDP and GTP occurred, because there wasn't an obvious protein that facilitates exchange of GDP with GTP. It is interesting to think that the ribosome is actually performing this role," добавляет он. В конце этого переключения от связи с GDP к GTP, EF-G, как предполагается, воспринимает новую структурную конфигурацию. "When EF-G changes structure, the ribosome is going into some sort of transition state, which we have characterized biochemically, and it's a state just between pre- and posttranslocation states," отмечает Ehrenberg. Чтобы исследовать это, Zavialov et al. [1] использовали GTP аналог, который не может быть гидролизован и установили, что рибосомы могут находиться в этом состоянии несколько мин. В нормальной ситуации, однако, GTP гидролизуется и EF-G меняет конформацию в третью структуру. "This is very important. It goes from a GTP-bound structure to a GDP-bound structure, but it is not like the free EF-G structure. Possibly this structure depends on the presence of the phosphate which still has not left EF-G after hydrolysis of GTP. This is speculation - but it may be the case," заявляет Ehrenberg. Эта предполагаемая третья структура EF-G обладает высоким сродством к пост-транслокационной рибосоме, так что, когда процесс транслокации завершается, то EF-G остается прикрепленным у A сайту рибосомы вплоть до тех пор, пока EF-G не примет снова GDP-связанную структуру, которую имел когда впервые появился на рибосоме. "We suspect that this third structure of EF-G is the one that is 'frozen' by the antibiotic fusidic acid, a classic tool in ribosome research," говорит Ehrenberg, который верит, что когда этот антибиотик соединяется с рибосомальным комплексом, то предупреждает EF-G от возвращения к его свободной GDP-связанной структуре, а , следовательно, останавливает его уход из рибосомы. Данные представленные в статье Zavialov et al. [1] , следовательно, бросают вызов 'classical' модели транслокации, согласно которой EF-G поступает в рибосому в GTP форме, транслоцирует tRNA и мРНК и гидролизует GTP, так что EF-G может уходить. Это бросает вызов и более недавним идеям Marina Rodnina, Wolfgang Wintermeyer с колегами из University of Witten/Herdecke, Germany. В их модели, EF-G вступает в рибосому связанным с GTP, a вскоре после этого GTP гидролизуется, высвобождая энергию для совершения транслокации; эта модель предполагает, что имеется некая форма молекулярного моторного белка внутри рибосомы, вообще-то сам EF-G [3]. "This work and previous work by Ehrenberg's and [Joachim] Frank's labs point to a new way of thinking about the role of EF-G. Interestingly, most GTPases are switches whereas motor proteins are often ATPases, so their work would bring EF-G in line with most other GTPases," говорит Venki Ramakrishnan, эксперт по рибосомальной трансляции из Medical Research Council Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, UK. Кроме того, Moore отмечает, "The model for EF-G action Ehrenberg and co-workers advance is consistent with their data, contradicted by no data that I know about, and does explain some observations made about the properties of EF-G in both my laboratory and Anders Liljas's laboratory (Lund University, Sweden), both published and unpublished, indicating that the conformation of EF-GoGTP in solution may be no different from the conformation of EF-GoGDP or free EF-G in solution. Furthermore, Zavialov and Ehrenberg's model is very different either from the classical model or from Rodnina's more recent model." Многие куски этой работы противоречивы и требуют дальнейших более тщательных исследований. "Their work contradicts findings from other well-established groups, and they also use a new method for measuring the movement of mRNA whose limitations are not clear. So their work needs to be confirmed by further experiments. Hopefully it will spur others in the field to confirm or disprove their findings," заявляет Ramakrishnan. Ehrenberg впервые распознал, что некоторые из подходов его работы являются новыми и что это всегда вызывает вопросы. Joseph отмечает, "In the biochemical data they show that with GDP alone they have only pre-translocation EF-G. That is very clear. But this is a new assay and while the assay is straightforward and there is no reason to assume a problem, it still needs to be proven." Joseph полагает, что хорошо бы повторить это исследование с помощью более обычных подходов к транслокации. Moore соглашается с необходимостью дальнейшего исследования. "Zavialov et al. present persuasive evidence that the effects of EF-GoGDP on translocation reported by Rodnina and co-workers were the result of GTP contamination in the GDP they used. All of their experiments need to be redone with rigorously purified GTP and GDP, and I hope they are stimulated by this paper to redo those experiments," говорит Moore. Один из главных конкурентов в этой области обнаруживает менmit энтузиазма. "To challenge established models is generally stimulating, and this is what the paper of Zavialov and Ehrenberg does," говорит Wolfgang Wintermeyer, но он не убежден новыми доказательствами. В статье предполагается, говорит он, что EF-G вступает в рибосомы в GDP-связанной форме, ноt Wintermeyer уверен, что нет подтверждения, что EF-G не может поступать в рибосомы в GTP-связанной форме. Поэтому он объявляет, что кинетический анализ, осуществленный группой Rodnina's, а также им самим для ситуации, когда EF-G поступает в GTP-связанной форме и модель, вытекающая из этих результатов, всё ещё действенна. "In fact, the kinetic analysis shows that GTP hydrolysis follows binding rapidly, indicating that very little time, if any, is left for nucleotide exchange prior to GTP hydrolysis, which is the major feature of the proposed model," говорит Wintermeyer. Для Wintermeyer наиболее слабым местом работы является то, что в ней не проведено кинетического анализа. "Thus, to assign the ribosome the function of a GEF appears to be premature and would require a more thorough analysis," говорит Wintermeyer. Joseph предлагает пострить эти транслокационные эксперименты с использованием быстрых кинетических методов с GDP-связанной и GTP-связанной формами EF-G. Wintermeyer's и Joseph's сомнения возникают из-за того, что новая работа не дает идеи о скорости процесса. Эксперименты протекали в течение 10-30 мин., предоставляя достаточное время и для GDP- или GTP-связанной формы катализировать транслокацию. "Without the time resolution we cannot know the magnitude of the defect if GTP is missing," говорит Joseph. При нормальной функции рибосомы оперируют 15-20 ступеней элонгации в сек. , при этом скорость ограничивающей ступенью является внесение правильных tRNA в А сайт. “I think it is a good thing for the field in that people will now look at it a bit more closely and maybe once it stands the test by several different groups that will be a great thing,” говорит Joseph. Но Moore предупреждает, “The new model will certainly elicit a reaction from the rest of the community, which is a good thing. The experiments everyone else does in response may prove that this model is right, but decades of experience in this field have taught me not to rush to judgment.”