Небольшие GTPases играют центральную роль в катализе каждой из стадий синтеза белка на рибосомах. У прокариот сототв. GTPases являются: initiation factor IF2, который доставляет initiator tRNA на P (peptide) сайт 30S рибосомальной субъединицы; elongation factor EF-Tu, который доставляет aminoacyl-tRNA на 70S рибосому (состоящую из 50S и 30S субъединиц); elongation factor EF-G, который способствует транслокации tRNAs и mRNA внутри рибосом; и peptide release factor RF3, который способствует отделению release факторов RF1 и RF2 после высвобождения пептида. Эти факторы, как было оценено, напоминают классические GTPases, с активной формой белка, представляющей собой GTP бинарный комплекс. Напр., активный EF-TuoGTP комплекс связывает aminoacyl-tRNA и транспортирует её на рибосому, которая затем стимулирует GTPase активность EF-Tu (функционируя в качестве GTPase-activator protein, или GAP) после детекции корректного взаимодействия кодон-антикодон [1]. Вследствие диссоциации EF-TuoGDP от рибосом, GDP заменяется на GTP в результате реакции замены guanine-нуклеотида, катализируемой с помощью elongation factor (EF-T), действующего в качестве guanine-nucleotide exchange factor (GEF). Для др. трех факторов, считается, что рибосомы также обеспечивают GAP функцию, тогда как потребность в GEF не была определена. Группа Ehrenberg [2] установила, что рибосома является фактически GEF для RF3 GTPase. Теперь та же самая группа сообщает, что активная форма EF-G для связывания рибосом является EF-GoGDP комплексом, а не EF-GoGTP комплексом, и что рибосомы действуют также как GEF для EF-G [3]. Это вместе с публикациями др. групп [4-6], проливает новый свет на GTP и EF-G во время реакции транслокации.

Чтобы понять полностью функцию трансляционных факторов и рибосом во время каждой стадии белкового синтеза, важно выяснить динамичные конформации, которым они подвергаются. Интенсивные исследования с использованием крио-электронной микроскопии и рентгеновской кристаллографии внесли существенный вклад в наше понимание функции рибосом и предоставили структурный каркас для рассмотрения этой огромной макромолекулярной машины [7,8]. Получены атомные структуры высокого разрешения для большинства трансляционных факторов. Одной из наиболее вызывающих проблем, связанных с функцией рибосом, определение, как координируются перемещения tRNA и mRNA в рибосомах, осуществляемых во время транслокации.

Мы знаем, что tRNAs соединяются с рибосомами, занимая пространство (interface) между рибосомными субъединицами, так что aminoacyl конец соединяется с 50S рибосомальной субъединицей, а антикодоновая петля соединяется с кодоном мРНК внутри 30S рибосомальной субъединицы. Рибосома содержит три самостоятельных сайта связывания tRNA: aminoacyl-tRNAs соедеиняются с A сайтом; peptidyl-tRNA соединяются с P; и голая tRNA соединяется с E (exit) сайтом (Figure 1a). Перемещения tRNAs между этими сайтами во время транслокации катализируется с помощью гидролиза EF-G и GTP. Классические модели транслокации, впервые предложенные Bretscher [9] и Spirin [10], предполагают, что непосредственно после синтеза пептидных связей peptidyl-tRNA располагается на A сайте, а не заряженная tRNA располагается на P сайте (Figure 1b). Но происходят спонтанные перемещения aminoacyl концов tRNAs относительно 50S субъединицы, приводящие в результате peptidyl-tRNA в P/A гибридное состояние (P на большой рибосомальной субъединице, но A на малой субъединице) не заряженную tRNA в E/P гибридное состояние (Figure 1c) [11]. Транслокация, катализируемая с помощью гидролиза EF-G и GTP, использует перемещения этих tRNA производных внутри 30S субъединицы (Figure 1d), чтобы создать peptidyl-tRNA в сайте P/P , а не заряженную tRNA в E/E сайте, одновременно с перемещением ассоциированной mRNA на один кодон (Figure 1e). Несмотря на очевидное разрыхление (loosening) связанных tRNAs, делающим возможным перемещения, связи тем не менее д. оставаться достаточно сильными, чтобы сохранить тесную ассоциацию между peptidyl-tRNA и мРНК, чтобы предупредить буксование (slippag) рамки считывания, и чтобы не приводить в результате к отделению от рибосомы. Т.к. возможно наблюдать транслокацию in vitro в отсутствие EF-G и GTP [12,13], то процесс транслокации кажется прирожденным свойством рибосом, которое усиливается в присутствии EF-G and GTP. Классическая модель указывает на то, что EF-G, связанный с GTP, управляет транслокационным движением и что последующий гидролиз GTP приводит в результате к отделению EF-G. На самом деле, очевидная транслокация может происходить с EF-G, связанным с неспособным к гидролизации GTP аналогом GMPPNP, если измерять способность peptidyl-tRNA реагировать с aminoacyl-tRNA, мимикрирующей лекарство puromycin [13,14]. Недавно предложены изменения модели группой Wintermeyer, показавшей, что EF-G обладает двумя самостоятельными функциями при транслокации [15,16]. Первая - это индукция конформационных изменений, которые способствуют 'unlocking' рибосомы, которая д. предшествовать перемещению tRNA-mRNA; вторая - это усиление спонтанного перемещения вперед (forward), которое возникает в результате разомкнутости (unlocked) рибосомы. Даже вооруженные выдающимися знаниями структуры рибосом, однако, мы сталкиваемся с неполным пониманием механизма транслокации (rev. [17-19]).

Современная статья Ehrenberg и др. [3], вместе с двумя недавними публикациями [6,20], существенно расширили наше понимание реакции транслокации. Установлено, что рибосома является фактически GEF для RF3 GTPase [2], поэтому Ehrenberg и др. решили исследовать верно это или нет и для EF-G. На базе своих новых находок, что EF-G соединяется с GDP 60-раз более прочно, чем с GTP и что транслокация с ограниченным EF-G только слегка ингибируется с помощью GDP, они пришли к выводу, что EF-GoGDP является формой, которая преимущественно связывается с пре-транслокационными рибосомами (Figure 1b) [3]. Это открытие оказалось неожиданным, т.к. считалось, что EF-G соединяется с рибосомами в виде EF-GoGTP бинарного комплекса. Они предположили, что EF-GoGDP связывание способствует образованию гибридного состояния (Figure 1c), которое связано с медленным движением 30S субъединицы относительно 50S субъединицы, как это было установлено с помощью cryo-electron микроскопии [6]. EF-GoGDP связывание с pre-translocation комплексом нуждается, чтобы не заряженная tRNA была бы способна к переходу в E/P гибридный сайт, т.к. мутации, которые блокируют такое связывание предупреждают и связывание EF-GoGDP. Остается выяснить, действительно ли связывание EF-GoGDP вызывает перестройку рибосом или проще стабилизирует hybrid/ratcheted состояние (Figure 1c), которое может быть сформировано спонтанно как результат предпочтительных взаимодействий peptidyl части peptidyl-tRNA с P сайтом 50S субъединицы, как полагают Moazed and Noller [11]. После связывания EF-GoGDP, субъединица 50S подвергается ряду конформационных изменений, приводящих в результате к изменению контактов с 30S субъединицей [6]. Чтобы визуализовать возможное перемещения мРНК на один кодон во время этого процесса, Ehrenberg и др. [3] разработали новый метод, который использует специфическое расщепление с помощью бактериального токсина RelE мРНК, расположенной в A сайте рибосомы. Рибосомы в финальном пост-транслокационном состоянии (Figure 1f) обнаруживают расщепление, т.к. А сайт становится доступным, но RelE не расщепляет мРНК в hybrid-state комплексе, связанным с EF-GoGDP (Figure 1c), т.к. А сайт блокируется. Состояние храповика (ratcheted) (Figure 1c) также не взаимодействует сpuromycin, указывая тем самым, что peptidyl-tRNA расположена неудобно в 50S peptidyl transferase центре для puromycin, чтобы добавляться к растущей пептидной цепи. Ehrenberg и др. затем предположили, что рибосомы действуют как GEF, чтобы превратить EF-GoGDP в EF-GoGTP [2,3]. Т.к. скорость замещения GDP на GTP в действительности не была измерена в 70S комплексе, то остается неясным, действительно ли рибосомы катализируют реакцию обмена. После связывания GTP, EF-G подвергается существенным конформационным изменениям [6], генерируя тем самым измененный 70S комплекс, названный переходным состоянием (Figure 1d). Переходное состояние позволяет puromycin реагировать с peptidyl-tRNA и частично воздействовать на кодон, стоящий ниже от peptidyl-tRNA кодона, чтобы отщепить с помощью RelE, показывая, что этот кодон располагается в или вблизи 30S A сайта. Кроме того, переходное состояние может быть возвращено добавлением GDP, но пост-транслокационное состояние не может быть возвращено, указывая, что переходное состояние и пост-транслокационное состояние отличны. Ehrenberg и др. [3] предположили, что переходное состояние служит в качестве GAP, способствуя гидролизу GTP. К сожалению, cryo-electron микроскопическая структура еще не установлена для переходного состояния, так что структура, показанная как комплекс IV на Figure 1d остаются гипотетической и упрощенной. После гидролиза GTP и удаления неорганических фосфатов рибосоьы достигают пост-транслокационного состояния (Figure 1e), к которому EF-GoGDP обладает низким сродством, это приводит в результате к его диссоциации и формированию комплекса VI, финальному пост-транслокационному состоянию (Figure 1f). Остается показать, на какой ступени - генерации переходного комплекса или пост-транслокационного комплекса - происходит перемещение мРНК относительно 30S субъединицы.

Комбинация недавних структурных, кинетических и биохимических исследований дает более удовлетворительное объяснение, как рибосомы и их комплексы вызывают направленные перемещения tRNAs и мРНК. Остается выяснить еще некоторые критические детали. Необходим быстрый кинетический анализ с высоко очищенными GDP и GTP. Более того, структуры, базирующиеся на крио-элемтроннтой микроскопии для EF-GoGTP-связывающего переходного комплекса и EF-GoGDP-связанного пост-транслокационного комплекса отсутствуют и мы всё ещё нуждаемся в выяснении точного времени, когда мРНК движется по 30S субъединице. Не исключены сюрпризы.