Стволовые клетки являются клетками. которые могут само-обновляться в недифференцированном состоянии и дифференцироваться в один или несколько типов клеток. Согласно этому определению эмбрионы могут рассматриваться как популяция стволовых клеток, т.к. недифференцированные клети эмбриона и пролиферируют и дифференцируются. Однако, в отличе от стволовых клеток, которые могут поддерживаться в недифференцированном состоянии, большинство клеток эмбриона в конечном итоге дифференцируются. Напротив, стволовые клетки, происходящие из ранних эмбрионов, могут культивироваться неопределенно длительное время не дифференцируясь, не смотя на побуждение некоторых экзогенных сигналов. Т.о., стволовые клетки не иденнтичны клеткам целого эмбриона, но они обладют важными свойствами: способностью генерировать множественные типы клеток из в общем-то униформной стартовой популяции. Не удивительно, что ранние эмбрионы мышей являются богатым источником для выделения стволовых клеток.

Три типа клеток происходят из ранних эмбрионов мышей, которые могут рассматриваться как стволовые: embryonic stem (ES) клетки, trophoblast stem (TS) клетки и extraembryonic endoderm (XEN) клетки (1-4). Все они выделяются из эмбрионов на ст. бластоциста, когда, как известно, существуют три листка: эмбриональный клон (эпибласт) и два важных внеэмбриональных клона (трофэктодерма и первичная энтодерма). Некоторые признаки, включая морфологию и профили экспрессии генов, подтверждают, что ES клетки являются производными эпибласта, TS клетки производные трофэктодермы, а XEN клетки являются производными первичной энтодермы (3-6). Более того, каждый тип стволовых клеток может вносить вклад в свой родственный клон у химерных эмбрионов (3, 4, 7), подтверждая сохранение соотв. онтогенетической компетентности. Недавние успехи в понимании происхождения и поддержания этих стволовых клеток, позволили понять, как эти три клона расположены в бластоцисте.

Две последовательные ступени дифференцировки ведут к формированию бластоциста: образование трофэктодермы и образование первичной энтодермы. До этих событий эмбрион существует в виде более или менее округлых клеток. Первым распознаваемым событием дифференцировки в развитии мышей является появление на стадии поздней морулы наружного слоя компактно упакованных окуглых клеток, воспринимающих эпителиальную структуру (Fig. 1). Эта структура, формирующаяся трофэктодерма, герметично закрывает доступ внутрь шара, а насос-подобные белки трофэктодермы облегчают образование и расширение внутренней полости или бластоцеля. Эмбрион теперь называется бластоцист и содержит два типа клеток: трофэктодерму и внутреннюю клеточную массу. Трофэктодерма начинает формировать трофобласт, предшественник не-материнскоих компонентов плаценты, тогда как внутренняя клеточная масса подвергается второй ступени дифференцировки.

Вторая ступень дифференцировки происходит, когда внутренняя клеточная масса дифференцируется на эпибласт и первичную энтодерму (Fig. 1). Первичная энтодерма или гипобласт, формируется как эпителиальное покрытие внутренней клеточной массы, обращенной в бластоцель. Эпибласт иногда обозначается как первичная эктодерма, он развивается между первичной энтодермой и трофэктодермой и дает собственно эмбрион. Первичная энтодерма становится вне-эмбриональной энтодермой, которая поставляет питательные вещества и информацию для формирования паттерна эмбриона во время раннего развития (rev. 8), а позднее вносит вклад в желточный мешок. На поздней стадии бластоциста три типа клеток, эпибласт, трофэктодерма и первичная энтодерма оказываютя предопределенными к разным поздним клонам и оказываются больше не тотипотентными. Однако, постоянные клеточные линии могут быть получены из клонов эпибласта, трофэктодермы и первичной энтодермы бластоциста, которые сохраняют способность к само-обновлению и дают многие дифференцированные клетки соотвествующего клона.

ES клетки происходят из эпибластного клона бластоциста (1, 2). Эти плюрипотентные клетки могут расти неопределенно долго как недифференцированные клетки в стандартных средах клеточных культур с добавлением цитокина leukemia inhibitory factor (LIF). ES клетки часто растут на слое мышиных эмбриональных фибробластов 'feeder' клетках. В среде с добавлением LIF, ES клетки растут как гладкие колонии из округлых клеток (Fig. 2). В отсутствие LIF, ES клетки спонтанно дифференцируются в ряд клеточных типов тела (rev. 9). Онтогенетический потенциал ES был изучен in vivo с помощью инъекций меченных ES клеток немеченным эмбрионам хозяевам, чтобы получить химерных эмбрионов. У химер ES клетки могут вность вклад во все части эмбриона, включая и зародышевую линию. Однако, они обычно не вносят вклада в клоны трофэктодермы или первичной энтодермы (7), что согласуется с их происхождением из клонально ограниченного эпибласта. ES клетки, следовательно, рассматриваются как плюрипотентные, тогда как клетки раннего эмбриона являются тотипотентными.

TS клетки, происходящие из клона трофэктодермы, морфологически отличаются от ES клеток (Fig. 2) и обнаруживают потребности в др. факторах роста. TS клетки растут в виде эпителиальных колоний, если в среду добавляется fibroblast growth factor 4 (FGF4), heparin и питающими клетками кондиционированная среда (3). Недавние данные подтвердили, что члены семейства transforming growth factor ОІ (TGF-ОІ) Activin (10) и возможно Nodal (11, 12) могут замещать потребность в кондиционированной среде для поддержания в недифференцированном состоянии TS клеток. TS клетки могут пассироваться в течение многих поколений без дифференцировки, но после удаления FGF4 приобретают более дифференцированную морфологию и насинают экспрессировать маркеры дифференцированного трофобласта (3). В химерах TS клетки может вносить вклад в клон трофобласта, включая главные плодные компоненты плаценты (3).

Третьи подобные стволовым клеткам, XEN клетки, также могут быть получены из бластоциста (4) и, по-видимому, представлют собой клон первичной энтодермы. XEN клетки нуждаются только в gelatin и кондиционированной фидерными клетками среде и экспрессируют маркеры производных первичной энтодермы (4). Интересно, что XEN клетки имеют две морфологии (Fig. 2) и наблюдается обмен между ними при time-lapse видеомикроскопии (4). XEN клетки могут вносить вклад в желточный мешок у химер (4).

Как эти три типа стволовых клеток остаются в основном не дифференцированными, сохраняют относительно ограниченный онтогенетический поенциал, может быть связано с молекулярными механизмами, которые ведут к установлению или поддержанию клонов, из которых они происходят.

POU доменовый транскрипционный фактор Oct4 (называемый также Oct3/4 и Pou5f1) экспрессируется по всему раннему эмбриону вплоть до ст. бластоциста, когда его экспрессия становится ограниченной внутренней клеточной массой (13). Oct4 мутантные мыши погибают примерно во время имплантации и обнаруживаются только трофэктодерм-подобные клетки (14), указывая тем самым, что Oct4 необходим для спецификации внутренней клеточной массы. Это наблюдение привело к предположению, что трофэктодерма изначально (default) пртедетерминирована в эмбрионе и это предопределение д.б. преодолено с помощью генов, способствующих образованию внутренней клеточной массы, таких как Oct4. Однако, недавно были идентифицированы некоторые гены, которые способствуют приобретению судьбы трофэктодермы (15). Один из них, Cdx2, кодирует caudal-родственный транскрипционный фактор и экспрессируется в формирующейся трофэктодерме со стадии поздней морулы (15). В отсутствие Cdx2, судьбы трофэктодермы не поддерживается и эмбрион погибает до имплантации (15, 16). Очевидно, что Oct4 аберрантно экспрессируется в трофэктодерме мутантов Cdx2 (15), подтверждая, что одной из ролей Cdx2 является преодоление судьбы клеток внутренней массы в клоне трофэктодермы. Эти данные подтверждают модель, согласно которой Oct4 и Cdx2 действуют как 'selector genes' для предопределения судьбы внутренней клеточной массы и трофэктодермы и негативно регулируют др. др. , чтобы обеспечить сегрегацию этих двух клонов ((Fig. 3).

Дальнейшие подтверждения этой модели получены в исследованиях in vitro с использованием стволовых клеток. Oct4 экспрессируется в ES клетках (13), но не в TS или XEN клетках (3, 4). ES клетки не могут быть получены из мутантных Oct4 эмбрионров (14), а генетические нарушения в Oct4 в уже существующих ES клеточных линиях заставляют их дифференцироваться в производные трофобласта (17). Интересно, что они растут в среде TS клеток, то эти клетки растут как TS (17). Напротив, некоторая часть доказательств указывает на то, что Cdx2 необходим для установления или поддержания TS клеток. Во-первых, Cdx2 экспрессируется в TS, но не в ES клетках (3, 17). Во-вторых, TS клетки не могут быть получены из Cdx2 мутантных эмбрионов (15), тогда как ES клетки могут (18). Однако, неясно, может ли потеря Cdx2 из существующих TS линий заставлять их расти как ES клетки, Тем не менее, неотразимая модель утверждает, что предопределение судьбы ES vs TS регулируется в основном активностью двух взаимоно антогонистических транскрипционных факторов Oct4 и Cdx2 (Fig. 3).

Во время дифференцировки первичной энтодермы экспрессия Oct4 подавляется в презумптивной первичной энтодерме (13), также как др. гена, называемого Nanog (19, 20). Nanog кодирует транскрипционный фактор, похожий на Oct4, он экспрессируется в клоне внутренняя клеточная масса/эпибласт (19, 20). Некоторые наблюдения указывают на то, что Nanog действует как ген селектор судьбы эпибласта относительно судьбы первичной энтодермы. В отсутствие функционального гена Nanog эмбрионы формируют трофэктодерму и первичную энтодерму, но не дают эпибласт (20). Вторичная потеря Nanog из ES клеток заставляет их приобретать признаки вне-эмбриональной энтодермы (20). Хотя Oct4 и Nanog ко-экспрессируются, Nanog и Oct4, по-видимому, участвуют в параллельных путях, т.к. потеря Nanog не влияет на экспрессию Oct4, а потеря Oct4 не затрагивает экспрессии Nanog в бластоцисте (9). Nanog, следовательно, действует предположительно как ген селектор во время выбора решения эпибласт/первичная энтодерма (Fig. 3b).

Гены, необходимые внутри клона первичной энтодермы, также были идентифицированы. Gata6 кодирует транскрипционный фактор и экспрессируется в первичной энтодерме на ст. бластоциста (21). Gata6 экспрессируется также во вне-эмбриональных энтодермальных клетках (4). Усиленная экспрессия Gata6 в ES клетках заставляет их дифференцироваться во вне-эмбриональную энтодерму (22), указывая тем самым, что Gata6 функционирует рано в иерархии регуляции развития энтодермы. Однако, мутанты Gata6 не обнаруживают дефектов XEN вплоть до нескольких дней после образования бластоциста (21, 23). Это может указывать на то, что др. факторы первоначально специфицируют первичную энтодерму в бластоцисте. Хотя не известны мутации индивидуального транскрипционного фактора, ведущие к полному отсутствию образования первичной энтодермы, имеются доказательства, что передача сигналов receptor tyrosine kinase необходима для развития первичной энтодермы. Grb2 кодирует адапторный белок для receptor tyrosine kinases, такой как FGF рецептор, Потеря Grb2 нарушает образование первичной энтодермы (24) и экспрессию Gata6 на поздней стадии бластоциста. Качественные особенности участвующих receptor tyrosine kinase(s) не были определены. Тем не менее, ясно, что передача сигналов Nanog и Gata6/Grb2 облегчает рассортировку клонов эпибласт/первичная энтодерма в бластоцисте (Fig. 3).

ES клетки человека были выделены из внутренней клеточной массы бластоцистов человека (5, 6). Т.к. онтогенетический потенциал человеческих ES клеток не может быть оценен в химерных эмбрионах по этиическим причинам, но было показано, что ES клетки человека дают эмбриональные типы тканей in vitro и в in vivo моделях (5, 6). Человеческие ES клетки нуждаются в feeder клетках и сыворотке или FGF скорее, чем в LIF, чтобы избежать дифференцировки(5, 6, 25). Человеческие ES клетки экспрессируют Oct4 (6) и Nanog (26) и не экспрессируют Cdx2 (27, 28).

Имеется несколько различий между мышиными и человеческими ES клетками, включая морфологию, скорость роста и потребность в LIF (5, 6). Одним из главных различий, имеющим онтогенетичекое значение, является тот факт, что человеческие ES клетки могут давать спонтанно трофэктодерм-подобные клетки (5), в присутствии фактора роста BMP4 (29) или в эмбриоидных телах (30). Это указывает на то, что расположение клонов может быть различным в бластоцистах человека и мышей. Напр., внутренняя клеточная масса бластоцистов человека может сохранять потенциал генерации трофэктодермы. human blastocyst may retain the potential to generate trophectoderm. Могут ли и когда Oct4, Cdx2 и др. ассоциированные с клонами гены регулировать это клональное решение в бластоцистах человека информирует данный номер.

Информативные результаты были получены при анализе этих генов в человеческих ES клетках, Напр., подавление Oct4 может вызывать усиление активности Cdx2 (27) и др. маркеров трофобласта в человеческих ES клетках (31). Курьезно, но подавление Oct4 также может приводить к усилению активности Gata6 (26, 27), a подавление Nanog также может приводить к активности трофобластных маркеров (31) ES клетках человека, что согласуется с различиями между ES клетками человека и мышей. Всё это указывает на т, что возможно происхождение человеческих TS и XEN клеток непосредственно из ES клеток человека. Человеческие TS и XEN клетки могут служить уникальным инструментом in vitro для изучения взаимодействий между этими клонами во время развития. Более того, такого типа исследования будут создавать основу для попыток проведения дифференцировки ES клеток человека по избранному пути развития с целью терапевтического использования.

Помимо потенциального использования стволовых клеток в качестве терапевтических агентов при дегенеративыных заболеваниях и повреждениях ткани, стволовые клетки являются неоценимым инструментом исследования для биологов развития. В этом отношении имеются два основных пути, которые используют стволовые клетки. Во-первых, т.к. стволовые клетки могут по определению вносить вклад в нормальное развитие, когда помещаются в контекст разивающегося животного, стволовые клетки могут быть также использованы для создания разнообразных химерных животных (rev. 32). Одним из чрезвычайно важных применений этой концепции является продукция трансгенных животных. Мутации, внесенные в ES клетки, могут составить часть зародышевой линии у химерных животных, а мутантные эживотные могут быть воспроизведены путем скрещиваний. Кроме того, целиком из ES-клеток полученные мыши могут быть получены с помощью агрегации ES клеток с тетраплоидными мышиными эмбрионами, так что доминанрные альерации в ES клетках может быть изучены непосредственно без необходимости передачи через зародышевую линию (33). Стволовые клетки могут быть также использованы как инструмент для исследования их собстванных прав для осуществления исследований in vitro, что может быть технически трудным для осуществления на эмбрионах. Разработан ряд in vitro подоходов для дифференцировки, включая добавление экзогенных факторов к клеточным культурам или растущим ES клеткам в суспензии для получения т.наз. эбриоидных тел (34). Эти in vitro подходы к дифференцировке могут быть использоаны для изучения ES клеток от мышиных и человечкских эмбрионов (rev. 35).

Фундаментальные исследования, определяющие свойства клонально ограниченных стволовых клеток из бластоцистов мышей и людей м. пролить свет на то, как контролируется клональное ограничение и как репреограммируется судьба взрослых клеток. Они предоставляют также новые инструмены дифференцировки ES клеток с долговременно терапевтической целью. С точки зрения биологии развития предсказание происхождения линий человеческих TS и XEN клеток открывают дорогу для использования ранних онтогенетических решений и клеточных взаимодействий у людей в принципе недоступное другими средствами.

1.Evans MJ, Kaufman MH. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature 1981: 292: 154-156.
2.Martin GR. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Natl Acad Sci USA 1981: 78: 7634-7638.
3.Tanaka S, Kunath T, Hadjantonakis AK, Nagy A, Rossant J. Promotion of trophoblast stem cell proliferation by FGF4. Science 1998: 282: 2072-2075.
4. Kunath T, Arnaud D, Uy GD et al. Imprinted X-inactivation in extra-embryonic endoderm cell lines from mouse blastocysts. Development 2005: 132: 1649-1661.
5. Thomson JA, Itskovitz-Eldor J, Shapiro SS et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science 1998: 282: 1145-1147.
6. Reubinoff BE, Pera MF, Fong CY, Trounson A, Bongso A. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat Biotechnol 2000: 18: 399-404.
7. Beddington RS, Robertson EJ. An assessment of the developmental potential of embryonic stem cells in the midgestation mouse embryo. Development 1989: 105: 733-737.
8. Bielinska M, Narita N, Wilson DB. Distinct roles for visceral endoderm during embryonic mouse development. Int J Dev Biol 1999: 43: 183-205.
9. Chambers I, Smith A. Self-renewal of teratocarcinoma and embryonic stem cells. Oncogene 2004: 23: 7150-7160.
10. Erlebacher A, Price KA, Glimcher LH. Maintenance of mouse trophoblast stem cell proliferation by TGF-beta/activin. Dev Biol 2004: 275: 158-169.
11. Ma GT, Soloveva V, Tzeng SJ et al. Nodal regulates trophoblast differentiation and placental development. Dev Biol 2001: 236: 124-135.
12. Guzman-Ayala M, Ben-Haim N, Beck S, Constam DB. Nodal protein processing and fibroblast growth factor 4 synergize to maintain a trophoblast stem cell microenvironment. Proc Natl Acad Sci USA 2004: 101: 15656-15660.
13. Palmieri SL, Peter W, Hess H, Scholer HR. Oct-4 transcription factor is differentially expressed in the mouse embryo during establishment of the first two extraembryonic cell lineages involved in implantation. Dev Biol 1994: 166: 259-267.
14. Nichols J, Zevnik B, Anastassiadis K et al. Formation of pluripotent stem cells in the mammalian embryo depends on the POU transcription factor Oct4. Cell 1998: 95: 379-391.
15. Strumpf D, Mao CA, Yamanaka Y et al. Cdx2 is required for correct cell fate specification and differentiation of trophectoderm in the mouse blastocyst. Development 2005: 132: 2093-2102.
16. Chawengsaksophak K, James R, Hammond VE, Kontgen F, Beck F. Homeosis and intestinal tumours in Cdx2 mutant mice. Nature 1997: 386: 84-87.
17. Niwa H, Miyazaki J, Smith AG. Quantitative expression of Oct-3/4 defines differentiation, dedifferentiation or self-renewal of ES cells. Nat Genet 2000: 24: 372-376.
18. Chawengsaksophak K, de Graaff W, Rossant J, Deschamps J, Beck F. Cdx2 is essential for axial elongation in mouse development. Proc Natl Acad Sci USA 2004: 101: 7641-7645.
19. Chambers I, Colby D, Robertson M et al. Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells. Cell 2003: 113: 643-655.
20. Mitsui K, Tokuzawa Y, Itoh H et al. The homeoprotein Nanog is required for maintenance of pluripotency in mouse epiblast and ES cells. Cell 2003: 113: 631-642.
21. Koutsourakis M, Langeveld A, Patient R, Beddington R, Grosveld F. The transcription factor GATA6 is essential for early extraembryonic development. Development 1999: 126: 723-732.
22. Fujikura J, Yamato E, Yonemura S et al. Differentiation of embryonic stem cells is induced by GATA factors. Genes Dev 2002: 16: 784-789.
23. Morrisey EE, Tang Z, Sigrist K et al. GATA6 regulates HNF4 and is required for differentiation of visceral endoderm in the mouse embryo. Genes Dev 1998: 12: 3579-3590.
24. Cheng AM, Saxton TM, Sakai R et al. Mammalian Grb2 regulates multiple steps in embryonic development and malignant transformation. Cell 1998: 95: 793-803.
25. Amit M, Carpenter MK, Inokuma MS et al. Clonally derived human embryonic stem cell lines maintain pluripotency and proliferative potential for prolonged periods of culture. Dev Biol 2000: 227: 271-278.
26. Clark AT, Rodriguez RT, Bodnar MS et al. Human Stellar, Nanog, and GDF3 genes are expressed in pluripotent cells and map to chromosome 12p13, a hotspot for teratocarcinoma. Stem Cells 2004: 22: 169-179.
27. Hay DC, Sutherland L, Clark J, Burdon T. Oct-4 knockdown induces similar patterns of endoderm and trophoblast differentiation markers in human and mouse embryonic stem cells. Stem Cells 2004: 22: 225-235.
28. Matin MM, Walsh JR, Gokhale PJ et al. Specific knockdown of Oct4 and beta2-microglobulin expression by RNA interference in human embryonic stem cells and embryonic carcinoma cells. Stem Cells 2004: 22: 659-668.
29. Xu RH, Chen X, Li DS et al. BMP4 initiates human embryonic stem cell differentiation to trophoblast. Nat Biotechnol 2002: 20: 1261-1264.
30.Gerami-Naini B, Dovzhenko OV, Durning M, Wegner FH, Thomson JA, Golos TG. Trophoblast differentiation in embryoid bodies derived from human embryonic stem cells. Endocrinology 2004: 145: 1517-1524.
31. Zaehres H, Lensch MW, Daheron L, Stewart SA, Itskovitz-Eldor J, Daley GQ. High-efficiency RNA interference in human embryonic stem cells. Stem Cells 2005: 23: 299-305.
32. Tam PP, Rossant J. Mouse embryonic chimeras: tools for studying mammalian development. Development 2003: 130: 6155-6163.
33. Nagy A, Rossant J, Nagy R, Abramow-Newerly W, Roder JC. Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci USA 1993: 90: 8424-8428.
34. Desbaillets I, Ziegler U, Groscurth P, Gassmann M. Embryoid bodies: an in vitro model of mouse embryogenesis. Exp Physiol 2000: 85: 645-651.
35. Odorico JS, Kaufman DS, Thomson JA. Multilineage differentiation from human embryonic stem cells lines. Stem Cells 2001: 19: 193-204.

Дополнительная Литература

Kelly Okazaki, Emin Maltepe. (2006) Oxygen, epigenetics and stem cell fate. Regenerative Medicine 1:1, 71


Haibin Wang, Sudhansu K. Dey. (2006) Roadmap to embryo implantation: clues from mouse models. Nature Reviews Genetics 7:3, 185


Kazuhiko Imakawa, Min-Su Kim, Fuko Matsuda-Minehata, Shohei Ishida, Masateru Iizuka, Masako Suzuki, Kyu-Tae Chang, Sherrill E. Echternkamp, Ronald K. Christenson>. (2006) Regulation of the ovine interferon-tau gene by a blastocyst-specific transcription factor, Cdx2. Molecular Reproduction and Development 73:5, 559


Mary Familari, Lynne Selwood>. (2005) The potential for derivation of embryonic stem cells in vertebrates. Molecular Reproduction and Development 


Andrea Jurisicova, Jacqui Detmar, Isabella Caniggia. (2005) Molecular mechanisms of trophoblast survival: From implantation to birth. Birth Defects Research Part C Embryo Today Reviews 75:4, 262