Регуляторные Сети

Название статьи REGULATORY NETWORKS IN EMBRYO-DERIVED PLURIPOTENT STEM CELLS Michele Boiani and Hans R. Schuler NATURE REVIEWS \| MOLECULAR CELL BIOLOGY \| NOVEMBER 2005 \| VOLUME 6 No 11, P.872-884
Extracellular signals and second messengers modulate cell-autonomous regulators such as OCT4, SOX2 and Nanog in a combinatorial complexity. Рис.1. \| Origin of Stem Cells in the mammalian embryo. Рис.1. \| Combinatorial signalling pathways involved in maintaining mouse ESC pluripotency Рис.1. \| The phenotypic effects of gene-targeting experiments in mice Табл.1. \| The best-characterized ESC markers HOMEOSTASIS A property of cells or organisms to regulate the internal environment in response to external cues to maintain a stable condition inside. EMBRYO INVAGINATION In the mouse, the embryo is the developing organism from the time of fertilization until E10.5, when it becomes known as a fetus. The stages are: preimplantation embryo, until E3.5; post-implantation embryo, from E3.5-E10.5; fetus, E10.5 onwards. PLURIPOTENT The ability of a single stem cell to develop into all different cell types of the body but not into the extra-embryonic cell types. EMBRYONIC STEM CELLS (ESCs). Derivative cells of the ICM of the pre-implantation embryo that have the potential to become all specialized cell types of the adult organism. As established cell lines, ESCs have been cultured under in vitro conditions that allow proliferation without differentiation for months or years. TROPHOBLAST STEM CELLS (TSCs). Cells derived from the trophectoderm of the blastocyst or early postimplantation trophoblast that have the potential to form all the cell types of the trophoblast-derived layer of the placenta. INNER CELL MASS (ICM). The prominent cluster of cells inside the blastocyst. In vivo, these cells give rise to the fetus. In vitro, the ICM cells are the source for ESCs. PRIMITIVE ECTODERM Also known as the epiblast. The upper layer of a group of cells derived from the inner cell mass of the blastocyst; it gives rise to all cells of the fetus. BLASTOCYST A pre-implantation mouse embryo of about 40-80 cells at day 3-4 after fertilization (in the case of human blastocysts the pace of development would be slower). The blastocyst consists of a hollow sphere made up of an outer layer of cells (the trophectoderm), a fluid-filled cavity (the blastocyst cavity or 'blastocoel'), and a cluster of cells at one pole on the interior (the inner cell mass). Cells used in co-culture to maintain pluripotent stem cells. Feeder cells usually consist of 'mouse embryonic fibroblasts' (MEFs), which are actually fetal mesenchymal cells obtained from E13.5 fetuses. These cells can proliferate for only a few passages in vitro (primary MEFs) or be immortalized (STO (SIM mouse thioguanineand ouabain-resistant)-SNL (STO, NEO, LIF) cells). CHIMAERISM The contribution to embryonic and fetal tissues of exogenous sources of cells with a different genotype, including cells that come from a different organism or species. For example, the injection of cells from one embryo into the blastocyst cavity of another embryo. MESODERM Germ layer; the middle layer of a group of cells derived from the primitive ectoderm of the fully expanded blastocyst; in general, it gives rise to bone, muscle, connective tissue and the middle layer of the skin. There is also an extra-embryonic mesoderm. TROPHECTODERM The outer cell layer of a blastocyst, made up of a mural and polar component. Gives rise to trophoblast cells upon implantation in the uterine wall. TRANSCRIPTOME The full complement of messenger RNA (mRNA) and non-coding RNAs, transcripts in the cell, weighted by their expression levels. DIAPAUSE In general, a period of physiologically enforced dormancy between periods of activity. In the preimplantation- stage embryo, it is a transient/reversible state of reduced vitality during which the blastocyst floats in the uterus without implanting. SRC-HOMOLOGY.2 -SH2. Src-homology-2 (SH2) domains are modules of ~100 amino acids that bind to specific phosphotyrosine-containing peptide motifs. SH2-domain proteins have numerous roles such as adaptors, scaffolds, kinases, phosphatases, Ras signalling, transcription, ubiquitination, cytoskeletal regulation, signal regulation, phospholipid secondmessenger signalling, and yet others. TERATOMA Also known as terratocarcinoma. A tumour composed of tissues from the three embryonic germ layers, which is usually found in the ovary and testis. It can be produced experimentally in animals by the injection of pluripotent stem cells, to determine the abilities of the stem cells to differentiate into various types of tissues. POU DOMAIN A specific region or amino-acid sequence in a protein that is associated with specific sequences such as the octamer motif (5.-ATGCAAAT-3.) on DNA. It was originally identified in the transcription factors PIT1, OCT1, OCT2 and UNC86. MULTIPOTENT Ability of a single stem cell to differentiate along multiple lineages and give rise to different tissues. It has broad potential but less than a pluripotent cell. TROPHOBLAST The extra-embryonic, highly proliferative tissue that is responsible for implantation, contributing to the placenta that controls the exchange of oxygen and metabolites between mother and embryo. SUPPRESSION.SUBTRACTIVE HYBRIDIZATION A method to identify DNA/ RNA that is present in one sample but not in the others. HOMEODOMAIN A domain in a protein that is encoded for by a homeobox - it consists of about 60 aminoacid residues and recognizes and binds to specific AT-rich DNA sequences. EST .EXPRESSED SEQUENCE TAG. A unique stretch of DNA within a coding region of a gene that is useful for identifying full-length genes and serves as a landmark for gene mapping. CRE/LOXP RECOMBINATION SYSTEM A site-specific recombination system derived from Escherichia coli bacteriophage P1. Two short DNA sequences (loxP sites) are engineered to flank the target DNA. Activation of the Cre-recombinase enzyme catalyses recombination between the loxP sites, leading to excision of the intervening sequence. PRIMITIVE ENDODERM Also known as the hypoblast. Lower layer of a group of cells derived from the inner cell mass of the blastocyst. It gives rise to visceral (lining the inner cell mass) and parietal extraembryonic (lining the trophectoderm) endoderm. NUCLEAR TRANSFER The procedure of removing the nucleus of a donor cell and transplanting it into another. Typically this involves a somatic cell (donor) and an oocyte (recipient) and is instrumental to the cloning procedure therefore known as SCNT (somatic cell nuclear transfer). CLONAL .CLONED. Describes the genetically identical progeny of a single mitotic cell. Also applied to an embryo to indicate its derivation from the splitting of another embryo or by nuclear transfer into a recipient oocyte. UNIPOTENT Refers to a cell that can only differentiate in one specific way. METHYLATION Covalent modification of the DNA nucleotide cytosine by addition of a methyl (CH3) group.	Стволовые клетки обладают способностью делиться неопределенный период в недифференцированном состоянии, но при этом сохраняют потенциал давать специализированные клетки. Многоклеточные организмы нуждаются в точном контроле за стволовыми клетками, которые поддерживают тканевой гомеостаз путем замещения окончательно дифференцированных., старых или поврежденных клеток. В дополнение к естественно возникшей системе соматических стволовых клеток у плодов и взрослых, стволовые клетки могут быть получены из эмбрионов пред- и ранних пост-имплатанционных стадий. Эмбриональные плюрипотентные стволовые клетки могут рассматриваться как представляющие исходное (archetypal) состояние генома, из которого возникают позднее в ходе развития другие паттерны геномной активности. Эти происходящие из эмбрионов стволовые клетки принято разделять на три категории (эмбриональные стволовые клетки (ЭСК), эмбриональные карциномные клетки (ЭКК) и эмбриональные зародышевые клетки (ЭЗК); FIG. 1). Правда эти определения туманны и разные клетки могут иметь перекрывающиеся свойства, унифицирующие их по сравнению со взрослыми стволовыми клетками. Они легче идентифицируются, выделяются и поддерживаются в виде линий стволовых клеток, которые могут содержаться в культуре неопределенное время. Т.к. они плюрипотентны, то они могут быть превращены в зародышевые клетки или любые производные трех первичных эмбриональных зародышевых слоёв. Они могут быть также изменены генетически и многочисленными протоколами, которые делают возможной дифференцировку эмбриональных стволовых клеток в почти любой тип клеток. Соответственно регуляторные механизмы, которые контролируют плюрипотентность стволовых клеток, должны быть достаточно гибки. Плюрипотентность является фундаментальной биологической функцией многоклеточных организмов, она возможно эволюционно защищена многочисленными генетическими системами отката (backup) и законсервирована в разных типах стволовых клеток (TABLE 1). Необходимо знать, как in vivo, стволовые клетки дирижируют генерацией, поддержанием и регенерацией ткани, в то же время предупреждая или супрессируя аберрантный рост и избегая истощения. ESCs as a cell-line model of pluripotency Плюрипотентные ESC клеточные линии могут быть получены из внутренней клеточной массы (ICM) или примитивной эктодермы (известной также как эпибласт) пери-имплантационных бластоцистов1 (FIG. 1). После трансплантации в неродственные бластоцисты эти клетки могут инкорпорироваться в эмбрион и участвовать в развитии. Плюрипотентные клетки впервые распознаются в ICM мышиных бластоцистов на 3.5 день эмбриогенеза (E3.5) и присутствуют самое позднее в эмбрионе перед гаструляцией (FIG. 1). Вплоть до стадии ~E5.5, по крайней мере, некоторые клетки примитивной эктодермы остаются плюрипотентными. Однако, их потенциал как стволовых клеток может быть выявлен с помощью экспериментальных вмешательств. В отсутствие кондиционированной среды самообновление и плюрипотентность ESC фенотипа не сохранялись, что вело к преимущественно нейрональной дифференцировке. Плюрипотентность ESCs может быть оценена по их способности интегрироваться после трансплантации в ICM E3.5 бластоцистов и по экспрессии, как и в ICM, alkaline phosphatase, E-cadherin, stage-specific embryonic antigen-1 (SSEA1) и octamer-binding transcription factor-4 (OCT4)4 (TABLE 1). Мышиные ESCs не дают трофэктодермы. Как и у мышей, были выявлены клоны клеток, напоминающие ESCs, и у некоторых приматов7, включая людей8. Способность давать ESCs после somatic-cell nuclear transfer (SCNT) - впервые достигнута на мышах^12,13, а теперь и на человеке14 - это может служить более униформным источником ESCs. Signalling that controls nuclear decisions Гены, которые экспрессируют белки, участвующие в сигнальной трансдукции и регуляции, составляют большую часть транскриптома у ESCs. Эти гены кодируют несколько пар лиганд-рецептор и секретируемые ингибиторы сигнальных путей fibroblast growth factor (FGF), transforming growth factor (TGF)-β/bone morphogenetic protein (BMP), Nodal и Wingless type (WNT)^16,17. The LIF signal cascade. In vitro, leukaemia inhibitory factor (LIF; известный также как ингибитор, Dia¹⁸) является важным для поддержания недифференцированного состояния мышиных ESCs. Интересно, что LIF является единственным, способным поддержанию ESCs в присутствии сыворотки, это указывает на необходимость дополнительных факторов. LIF осуществляет свой эффект путем связывания LIF receptor (LIFR)-gp130 гетеродимерного рецептора на клеточной мембране и путем активации signal transducer and activator of transcription-3 (STAT3; FIG. 2). В присутствии LIF в культуральной среде, STAT3 соединяется с остатками фосфотирозина активированных LIFR-gp130 гетеродимерных рецепторов²¹ и сам подвергается фосфорилированию и димеризации. Фосфорилированные STAT3 димеры затем транслоцируются в ядро, где они функционируют как транскрипционные факторы. Условно активная форма STAT3, которая индуцируется с помощью tamoxifen (STAT3-oestrogen-receptor (ER) слитого белка)²², может быть использована для подержания плюрипотентного фенотипа, если LIF удаляется из культуральной среды. Однако, минимальная доза STAT3, по-видимому, необходима для умножения и плюрипотентности ESC. Помимо пути, ведущего к транслокации в ядро STAT3, внутриклеточные домены гетеродимеров LIFR-gp130 могут, после связывания LIF, рекрутировать не-рецепторную тирозин киназу Janus (JAK) и antiphosphotyrosine immunoreactive kinase (TIK) и активировать др. пути (FIG.2). Например, индуцируется фосфорилирование extracellular signal-regulated protein kinases, ERK1 и ERK2 (REF. 23), и увеличивается активность mitogen-activated protein kinase (MAPK)24. Это происходит благодаря активации образующего связи между цитокинами и MAPKs фактора - широко экспрессируемыми tyrosine phosphatase SRC-HOMOLOGY-2 (SH2)-DOMAIN-содержащим белком tyrosine phosphatase-2 (SHP2; REF. 25). Несмотря на способность передачи сигналов LIF-STAT3 для поддержания само-обновления мышиных ESCs, это не предупреждает дифференцировку человеческих ESCs²⁶ (TABLE 1). В частности, даже с человеческим LIF в культуральной среде, активность гена OCT4 снижается и человеческие ESCs дифференцируются²⁷. Неясно, оказывают ли LIF др. эффекты на ESCs людей. Напр., он м. не быть достаточно эффективным для поддержания недифференцированного роста или он м. активно ингибироваться28. Хотя LIF-(LIFR-gp130)-STAT3 сигнальный путь не является универсальным, он представляет собой четкий пример того, как активация цитокинового пути м.б. использована для изменения клеточной судьбы и потенциала. BMP4. Нет определенного мнения о том, как этот фактор укладывается в общую молекулярную схему плюрипотентности. Подобно LIF, BMP4 рассматривается ключевым анти-нейрогенным фактором в эмбрионе и его эффект на культивируемые ESCs напоминает LIF, тем, что ESCs дифференцируются в нейроны в его отсутствие²⁹. Более того, мышиные эмбрионы без BMP4 развиваются до стадии, на которой возникают ESCs³⁰. В присутствии LIF, BMP4 вносит вклад в LIF каскад, усиливая само-обновление и плюрипотентность ESCs путем активации гена, кодирующего транскрипционный фактор SMAD4 (similar to mothers against decapentaplegic homologue-4), который, в свою очередь, активирует членов Id (inhibitor of differentiation) семейства генов²⁹ (FIG. 2). Напротив, в отсутствие LIF, BMP4 противодействует LIF каскаду, взаимодействуя с разными SMAD транскрипционными факторами (напр., SMAD1, 5 и 8), которые обладают ингибирующим эффектом на Id гены. BMP белки, как было установлено, являются мишенями др. лигандного каскада, который инициируется соединением WNT со свои рецептором³². WNT proteins. Канонический WNT путь активируется в результате связывания WNT белка с рецептором Frizzled на клеточной мембране (FIG. 2). Активация пути ведет к ингибированию glycogen-synthase kinase-3 (GSK3), последующему накоплению в ядре ?-catenin и экспрессии генов мишеней. Sato и др. показали, что активация канонического WNT пути поддерживает недифференцированный фенотип ESCs мышей и людей и поддерживает экспрессию специфичных для плюрипотентного состояния транскрипционных факторов OCT4, REX1 (известного также как zinc-finger protein-42; ZFP42) и Nanog²⁷ в отсутствие добавления LIF. Это происходило также после активации нижестоящих мишеней передачи сигналов WNT, таких как cyclin-D1 (REF. 35), MYC36 и BMP белков³². Emerging transcriptional regulators of ESCs. Выявлен также сигнальный путь, который регулирует взаимодействие между mammalian target of rapamycin (mTOR) и двумя нижестоящими субстратами, eukaryotic translation-initiation factor 4E (eIF4E)-binding protein-1 и ribosomal-protein-S6 kinase42. А inositols участвуют также в другом пути, который нацелен на ген phosphatase and tensin (Pten). Основным субстратом для PTEN является phosphatidylinositol-3,4,5-triphosphate (PtdIns(3,4,5)P3). PTEN, следовательно, завершает передачу сигналов phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) путем дефосфорилирования PtdIns(3,4,5)P3 вторичного мессенджера43. Серин/треониновая киназа AKT является нижестоящим эффектором PI3K, которая фосфорилирует mTOR in vitro, указывая тем самым на прямую связь между mTOR и PI3K-AKT путем, который негативно регулируется с помощью PTEN46. Выявляется также и функция microRNAs (miRNAs) в транскрипционном регуляторном циркуите (circuitry) ESCs. ESCs, лишенные кухни (machinery), которая осуществляет процессинг miRNA транскриптов, не способны дифференцироваться⁴⁹. Nuclear (transcription factor) pathways Сигнальные пути в конечном счете ведут в ядро, а в случае ESCs, приводят в результате к индукции транскрипции или репрессии генов, которые ответственны за поддержание плюрипотентности стволовых клеток. Хотя статус stemness (т.е. генов, которые наделяют свойствами стволовых клеток клетки) приложим к таким генам, как Oct4 и Nanog , но они не могут рассматриваться как 'master genes' плюрипотентности - т.к. по удалению LIF Oct4 не может предупредить дифференцировку ESCs самостоятельно, а Nanog не эффективен без Oct4 (BOX 4). The transcription factor OCT4. OCT4 является POU-DOMAIN транскрипционным фактором, который экспрессируется всеми плюрипотентными клетками во время эмбриогенеза мышей и обильно экспрессируется недифференцированными мышиными ESCs и ECC клеточными линиями^52-55, также как и EGC клеточными линиями⁵⁶. OCT4, как было установлено, является и маркером плюрипотентных ESCs человека16. Это наблюдение следует использовать с осторожностью из-за наблюдения, что нейрональная дифференцировка происходит при сохранении экспрессии Oct4 (REF. 58), что ставит под сомнение общепринятое мнение, что подавление Oct4 необходимо для дифференциации соматических клонов. OCT4 может рассматриваться как участвующий в предупреждении дифференцировки трофэктодермы и вообще соматических клеток из ICM, а также как являющийся критическим для поддержания плюрипотентного состояния во время эмбрионального развития. Однако, гены мишени, которые в действительности ответственны за выполнение решений OCT4, известны только частично^61,62. Пока потенциальные взаимодействия OCT4 с др. (ко)факторами - за исключением SOX2 (SRY related high-mobility group (HMG)-box protein-2; FIG. 2) - остаются неясными. The transcription factor SOX2. SOX2 является членом семейства HMG-доменовых ДНК-связывающих белков, которые участвуют в регуляции транскрипции и архитектуры хроматина63. SOX2 формирует четвертичный комплекс или с OCT4 или повсеместным OCT1 белком на энхансерных ДНК последовательностях Fgf4 (REF. 64). Это позволяет SOX2 участвовать в регуляции ICM и её потомков или производных клеток. С этой ролью согласуется то, что Sox2 экспрессируется в ESCs, но он экспрессируется также в нервных стволовых клетках. У мутантов Sox2 примитивная эктодерма оказывалась дефектной, но она могла быть нормализована (хотя только выживала дольше) с помощью инъекций ESCs дикого типа в Sox2-/- бластоцисты⁶⁵. С помощью проверки фенотипических последствий у мутантных Sox2 эмбрионов и у химер, была выявлена клеточно автономная потребность в гене как в примитивной, так и вне-эмбриональной эктодерме (мультипотентных предшественниках всех эмбриональных и трофобластных типов клеток, соотв.) Сходные роли были выявлены и для др. генов, которые экспрессируются в популяции клеток-основательниц эмбрионов - Foxd3 (ген транскрипционного фактора, который также известен как Genesis и принадлежит к forkhead семейству транскрипционных факторов с winged-helix ДНК-связывающей структурой). Заметная потеря клеток примитивной эктодермы происходит в Foxd3-/- бластоцистах, а Foxd3-/- ESCs не могут возникнуть, хотя экспрессия Oct4, Sox2 и Fgf4, по-видимому, нормальна в Foxd3-/- ICM⁶⁶. Эти данные подтверждают прямое взаимодействие между OCT4 и FOXD3, точно также как оно очевидно между OCT4 и SOX2 (REF. 67). The transcription factor Nanog. Исследования по поддержанию плюрипотентности привели к идентификации нового гена, кодирующего гомеодомен-содержащий транскрипционный фактор, который отвечает за LIF-независимую способность обновления и плюрипотентности мышиных ESCs. Этот ген стал называться Tir nan Og или Tir Na Nog, по мифологической стране Кельтов 'вечной молодости'^70,71 (BOX 4). Nanog мРНК присутствует в примордиальных зародышевых и EGCs, и выявлена также генитальном гребне⁷⁰, и она может быть обнаружена с помощью RT-PCR во взрослых тканях⁷². Nanog мРНК не выявляется на более поздних стадиях - ни в зрелых овариях, ни в тестисах⁷¹ ни в GSC клеточных линиях, происходящих из тестисов новорожденных⁵⁷. Это указывает на то, что функция Nanog в зародышевых клетках прогрессивно уменьшается по мере из созревания. Недифференцированные дикого типа ESCs обычно экспрессируют Nanog. Однако, физиологические уровни Nanog в ESCs не предупреждают их дифференцировку после удаления LIF. Так, при физиологических условиях, Nanog , по-видимому, является одним из нескольких факторов, которые экспрессируются в плюрипотентных клетках и подавляются в начали дифференцировки. Однако, NANOG не входит в группу из 532 генов. которые были идентифицированы, как специфичные для ESCs людей¹⁶. Nanog-/- мышиные ESCs дифференцируются медленно в клоны вне-эмбриональной энтодермы, что согласуется с отсутствием примитивной эктодермы у Nanog-/- эмбрионов, которые были проанализированы на ст. E5.5 in vivo71 (FIG. 3). Итак, экспрессия Nanog ответственна за поддержание примитивной эктодермы у эмбрионов. Персистенция Nanog скорее задерживает, чем блокирует дифференцировку ESCs. Напротив, избыточная экспрессия Nanog дает в результате лабильную более устойчивую плюрипотентность⁷³. Итак, количество Nanog на клетку является критическим для стабильного поддержания в недифференцированном состоянии даже в присутствии LIF. Как и в случае с OCT4, было предположено, что Nanog может регулировать дифференцировку посредством репрессии транскрипции генов, которые способствуют дифференцировке (напр., энтодермальный GATA-binding protein-6, Gata6, Rex1/Zfp42 )(REF. 71). Мало известно о регуляции гена Nanog, за исключением того, что активатор транскрипции и опухолевый супрессор p53 соединяется с промотором Nanog, делая тем самым возможной p53-зависимую супрессию экспрессии Nanog75. Интересно, что p53-связывающий элемент был также обнаружен непосредственно выше PTEN77. STAT3, OCT4, SOX2 and Nanog are not alone. В отсутствие LIF, форсированная экспрессия Pem78 - ещё одного гена помимо Oct4 и Nanog, который продуцирует гомеодомен-содержащий белок - блокирует дифференцировку ESCs как in vitro, так и in vivo. ESCs, которые постоянно экспрессируют Pem не способны формировать опухоли после подкожных инъекций, это указывает на роль PEM в регуляции перехода между недифференцированными и дифференцированными клетками у ранних эмбрионов мышей. Из-за скоротечности существования клеточной популяции ICM или примитивной эктодермы, ранняя роль PEM in vivo менее очевидна, чем его поздняя роль на пост-имплантационных стадиях. После имплантации, экспрессия PEM обнаруживается в ectoplacental cone, примитивной энтодерме (гипобласт), париетальной и висцеральной энтодерме (но не в примитивной эктодерме), указывая тем самым, что PEM выполняет вне-эмбриональные функции. Combinatorial signals for pluripotency Обсудив элементы программы отдельно, теперь необходимо описать комбинаторную модель их функции. Combinatorial signalling of Nanog and OCT4. Пониженная экспрессия Oct4 заставляет мышиные ESCs дифференцироваться трофэктодерму, это выявляется по клеточной морфологии и экспрессии маркерных генов (напр., caudal-type homeobox transcription factor-2, Cdx2). Однако Nanog-дефицитные эмбрионы не формируют примитивную эктодерму и Nanog-/- клетки дифференцируются в висцеральную и париетальную энтодерму (GATA6- и GATA4-позитивные клетки соотв.). Эти наблюдения указывают на то, что два гена оперируют независимо др. от др., но их функции скоординированы. Первичная функция OCT4 и Nanog может заключаться в репрессии дифференциации эмбриональных клеток, а комбинационный сигнал от обоих белков ведет к обновлению и плюрипотентности примитивной эктодермы. Исходя из предположения, что OCT4 и Nanog последовательно супрессируют дифференцировку ICM во вне-эмбриональные клоны - сначала в трофэктодерму (OCT4), затем в примитивную энтодерму (Nanog) - т.к. их уровни снижаются в примитивной эктодерме, то дальнейший онтогенетический контроль последующей дифференцировки примитивной эктодермы может обеспечиваться др. генами, такими как Sox2 (REF. 65) и Foxd3 (REF. 66). Nanog and STAT3 function in parallel. Установлено отсутствие взаимодействия между OCT4 и STAT3 и появление взаимодействия между Nanog и STAT3, природу которого еще предстоит установить. WNT and OCT4. Эффект мутантных Wnt3 на уровни OCT4 в мышиных ESCs, и участие и WNT и OCT4 в порогами опосредованных реакциях, указывают на интригующую возможность, что каскад передачи сигналов WNT и роль OCT4 в качестве детерминанта клеточной судьбы непосредственно связаны. Oct4 and Sox2. Соседние octamer и sox элементы были также идентифицированы как цис-регуляторные элементы в Fgf4 (REF. 64), Sox2 (REF. 82), Utf1 (REF. 81) и Fbx15 (REF. 88) генах, которые экспрессируются в ECC и ESCs и во время эмбриогенеза. Pluripotency pathways in other systems На базе данных, представленных выше, интересно бы определить, може ли плюрипотентность устанавливаться и размножаться in vitro с помощью методов, иных, чем возникновение ESCs от зиготических эмбрионов. Современное отсутствие контроля над судьбами эмбриональных стволовых клеток приводит к интересной параллели отсутствия дефинитивного контроля над ядрами дифференцированных клеток, которые приобретают повторно плюрипотентность после переноса в ооциты (cloning). Недавние успехи в получении линий плюрипотентных стволовых клеток человека^14,89 и успехи в клонировании эмбрионов млекопитающих с помощью NUCLEAR TRANSFER, создают привлекательные возможности для восстановления функции ткани с помощью клеточных трансплантаций с использованием SCNT - часто обозначаемым как терапевтическое клонирование. CLONAL бластоцисты могут быть использованы для получения почти безупречно подходящих ESC клеточных линий, которые можно будет заставить дифференцироваться in vitro и обеспечить пациента клетками для аутологичных трансплантаций. Терапевтическое клонирование не является неразумным предположение, т.к. было продемонстрирована его осуществимость на мышах^90,91, а недавно и на людях89. Прежде чем эта процедура будет разрешена для клинического применения необходимо установить, как заканчивается в действительности процесс ре-программирования. Контроль экспрессии Oct4 и Nanog является важным для успешного клонирования, при котором унипотентное клеточное ядро становится плюрипотентным, перенесенное в ооплазму, установлено, что ряд онтогенетических генов, ассоциированных с плюрипотентностью, экспрессируется^92,93. Потребность в Oct4 и Nanog для поддержания плюрипотентности указывает на то, что аллели, производные соматических клеток, могут реактивироваться в результате ядерного ре-программирования после SCNT в ооциты. Показано, что реактивация молчащих соматических аллелей Oct4 и Nanog происходит только частично в мышиных клонах^73,92. Интересно, что частота реактивации Nanog превосходит таковую Oct4 (REF. 73). Напротив, инактивация Х хромосомы, по-видимому, происходит также как во время нормального развития⁹⁴. Однако, даже в случае Х инактивации, как было показано, когда она происходит собственно в производных соматических клеток клонируемых эмбрионах мышей, то незначительные аномалии в экспрессии и METHYLATION некоторых импринтируемых генов происходят в мышиных клонах, которые происходят из соматических клеток⁹⁵ и ESCs⁹⁶. Однако, жизнеспособное клональное 'offspring' может доживать до взрослого состояния несмотря на распространенные нарушения в экспрессии этих генов. Внутри клональных эмбрионов ре-программирование соседних бластомеров, по-видимому, происходит независимо др. от др. и на ст. бластоциста OCT4 экспрессируется соматическими клетками, но не др. в ICM - феномен известный как 'mosaicism'. Хотя частичное ре-программирование одного ключевого гена, ассоциирующее с частичным ре-программированием др., и т.д., показывает, что имеется субнабор клонов, в которых имеются, по крайней мере, некоторые клетки, которые ре-программированы по всем генам. ESC-производная, дифференцировочная и трансплантационная терапия после SCNT не нужна для полноценного эмбрионального развития. Она необходима для формирования бластоцистов, возникновения ESCs из них, и затем дифференцировки ESCs в специфические типы клеток. Итак, частичное превращение однопотентной программы в плюрипотентную может быть достаточным для терапевтического клонирования. Мы задавались вопросом, может ли плюрипотентность вызвана и умножена in vitro с помощью методов, иных, чем базирующиеся на ESCs из зиготических эмбрионов - и ответ до с помощью SCNT. Сходным образом было бы интересно определить, могут ли методы, иные, чем клонирование с помощью SCNT в ооцитах, достичь подобных результатов. Когда плюрипотентные стволовые клетки используются вместо ооцитов в качестве реципиентов для переносимых ядер, которое осуществляется в результате межклеточного слияния, то гибридные клетки обнаруживают потерю стадио- и ткане-специфических маркеров родительских соматических клеток (gene extinction) и de novo активацию признаков и генов, которые характерны для плюрипотентных клеток. X инактивация, напр., является процессом, который тесно связан с дифференцировкой и происходит в теле самок. Путем демонстрации ре-активации X хромосомы после слияния клеток и и её последующей случайной инактивация во время дифференцировки возможно подтвердить, что плюрипотентные стволовые клетки могут перенастроить метку инактивации правильно^97,98. Более того, индуцированные к дифференцировке или in vitro или in vivo, может быть получен широкий спектр дифференцирующихся клеток несмотря на их тетраплоидное состояние. Гибридные клетки могут быть также проверены в отношении их онтогенетического потенциала путем инъекций их в хозяйский бластоцист. Путем генерации жизнеспособных химер возможно получать клеточные гибриды в разных тканях, это указывает на способность этих инъецированных клеток вносить вклад во все клеточные клоны. Имеется заманчивая возможность, что клеточное слияние может естественно происходить in vivo, так что взрослые стволовые клетки одной ткани могут генерировать дифференцированные клетки, которые специфичны для др. ткани путем слияния с местными клетками^99-102 и последующей сегрегацией. Однако, клеточное слияние не может обяснить всех появляющихся кажущихся трансдифференцировок¹⁰³. Безусловно было бы интересно определить, может ли плюрипотентность быть достигнута и умножена in vitro с помощью методов, иных чем перенос ядер - или в ооциты или др. клетки (слияние) - используя клеточную и регуляторную системы, иные, чем ESCs, и вообще в отсутствие внеклеточных факторов. Напр., мультипотентные взрослые клетки предшественники, MAP-C клетки, которые происходят из стромы взрослого костного мозга, по-видимому, приобретают снова плюрипотентность in vitro в отсутствие компании др. клеток, которые могли бы секретировать плюрипотентные факторы. Однако, это долговременный процесс, а уровень экспрессии клетками MAP-C Oct4 в 1,000-раз меньше, чем в ESCs104. Итак, очевидно, что плюрипотентность достигается посредством комбинации собственно последовательно расположенных процессов, которые контролируют доступность хроматина, модификации хроматина, активацию и экспрессию специфических генов. Это осложняется потребностью в тонко настроенной регуляции относительных уровней экспрессии. Nanog оказался прославленным как столь же важный, как и OCT4, который в течение многих лет считался единственным транскрипционным фактором, который строго и без сомнения ассоциирован с плюрипотентностью. Однако, OCT4-связывающие сайты недавно были обнаружены в вышестоящей контролирующей области Nanog, что подкрепляет центральную тему этого обзора. Мы подтвердили, что невозможно, чтобы скрининг 'pluripotent' библиотеки кДНК не привел к открытию того, что действительно наделяет плюрипотентностью. Некоторые вопросы, связанные с плюрипотентностью остаются открытыми. Учитывая , что прирожденные регуляторы OCT4 и Nanog существенны, но недостаточны для спецификации плюрипотентного состояния клеток, мы д. открыть гены, лежащие выше и контролирующие экспрессию Oct4 и Nanog. Имеются ли и др. гены, которые обеспечивают плюрипотентность, в частности какие-либо 'master' гены? Манипуляции с такими 'master' генами могли бы послужить инструментом для разрешения этических затруднений, связанных с клонированием человека, т.к. такой ген мог бы быть мишенью для ANT (altered nuclear transfer)¹⁰⁵. Этот подход мог бы послужить панацеей для современной регенеративной медицины, хотя нет согласия относительно правомерности этого предположения¹⁰⁶. Note added in proof Boyer et al.135 картировали транскрипционные факторы OCT4, SOX2 и Nanog в промоторах большой популяции генов, которые предопределяют позитивно или негативно ESCs человека. Авт. показали, что промоторные области ко-оккупируются OCT4, SOX2 и Nanog как в транскрипционно активных генах, которые выполняют роль в предопределении качественных особенностей ESC (недифференцированный фенотип) и в неактивных генах, которые способствуют их развитию, будучи депрессированными (дифференцировка). Совместное присутствие OCT4, SOX2 и Nanog на генных промоторах интерпретируется клетками комбинационным способом посредством ауторегуляторных и петель прямой связи (feed-forward). Это исследование предоставило более исчерпывающую карту основных регуляторных циркуитов плюрипотентности

Стволовые клетки обладают способностью делиться неопределенный период в недифференцированном состоянии, но при этом сохраняют потенциал давать специализированные клетки. Многоклеточные организмы нуждаются в точном контроле за стволовыми клетками, которые поддерживают тканевой гомеостаз путем замещения окончательно дифференцированных., старых или поврежденных клеток. В дополнение к естественно возникшей системе соматических стволовых клеток у плодов и взрослых, стволовые клетки могут быть получены из эмбрионов пред- и ранних пост-имплатанционных стадий. Эмбриональные плюрипотентные стволовые клетки могут рассматриваться как представляющие исходное (archetypal) состояние генома, из которого возникают позднее в ходе развития другие паттерны геномной активности. Эти происходящие из эмбрионов стволовые клетки принято разделять на три категории (эмбриональные стволовые клетки (ЭСК), эмбриональные карциномные клетки (ЭКК) и эмбриональные зародышевые клетки (ЭЗК); FIG. 1). Правда эти определения туманны и разные клетки могут иметь перекрывающиеся свойства, унифицирующие их по сравнению со взрослыми стволовыми клетками. Они легче идентифицируются, выделяются и поддерживаются в виде линий стволовых клеток, которые могут содержаться в культуре неопределенное время. Т.к. они плюрипотентны, то они могут быть превращены в зародышевые клетки или любые производные трех первичных эмбриональных зародышевых слоёв. Они могут быть также изменены генетически и многочисленными протоколами, которые делают возможной дифференцировку эмбриональных стволовых клеток в почти любой тип клеток. Соответственно регуляторные механизмы, которые контролируют плюрипотентность стволовых клеток, должны быть достаточно гибки. Плюрипотентность является фундаментальной биологической функцией многоклеточных организмов, она возможно эволюционно защищена многочисленными генетическими системами отката (backup) и законсервирована в разных типах стволовых клеток (TABLE 1). Необходимо знать, как in vivo, стволовые клетки дирижируют генерацией, поддержанием и регенерацией ткани, в то же время предупреждая или супрессируя аберрантный рост и избегая истощения.

ESCs as a cell-line model of pluripotency

Плюрипотентные ESC клеточные линии могут быть получены из внутренней клеточной массы (ICM) или примитивной эктодермы (известной также как эпибласт) пери-имплантационных бластоцистов1 (FIG. 1). После трансплантации в неродственные бластоцисты эти клетки могут инкорпорироваться в эмбрион и участвовать в развитии. Плюрипотентные клетки впервые распознаются в ICM мышиных бластоцистов на 3.5 день эмбриогенеза (E3.5) и присутствуют самое позднее в эмбрионе перед гаструляцией (FIG. 1). Вплоть до стадии ~E5.5, по крайней мере, некоторые клетки примитивной эктодермы остаются плюрипотентными. Однако, их потенциал как стволовых клеток может быть выявлен с помощью экспериментальных вмешательств. В отсутствие кондиционированной среды самообновление и плюрипотентность ESC фенотипа не сохранялись, что вело к преимущественно нейрональной дифференцировке.

Плюрипотентность ESCs может быть оценена по их способности интегрироваться после трансплантации в ICM E3.5 бластоцистов и по экспрессии, как и в ICM, alkaline phosphatase, E-cadherin, stage-specific embryonic antigen-1 (SSEA1) и octamer-binding transcription factor-4 (OCT4)4 (TABLE 1). Мышиные ESCs не дают трофэктодермы. Как и у мышей, были выявлены клоны клеток, напоминающие ESCs, и у некоторых приматов7, включая людей8. Способность давать ESCs после somatic-cell nuclear transfer (SCNT) - впервые достигнута на мышах^12,13, а теперь и на человеке14 - это может служить более униформным источником ESCs.

Signalling that controls nuclear decisions

Гены, которые экспрессируют белки, участвующие в сигнальной трансдукции и регуляции, составляют большую часть транскриптома у ESCs. Эти гены кодируют несколько пар лиганд-рецептор и секретируемые ингибиторы сигнальных путей fibroblast growth factor (FGF), transforming growth factor (TGF)-β/bone morphogenetic protein (BMP), Nodal и Wingless type (WNT)^16,17.

The LIF signal cascade. In vitro, leukaemia inhibitory factor (LIF; известный также как ингибитор, Dia¹⁸) является важным для поддержания недифференцированного состояния мышиных ESCs. Интересно, что LIF является единственным, способным поддержанию ESCs в присутствии сыворотки, это указывает на необходимость дополнительных факторов. LIF осуществляет свой эффект путем связывания LIF receptor (LIFR)-gp130 гетеродимерного рецептора на клеточной мембране и путем активации signal transducer and activator of transcription-3 (STAT3; FIG. 2).

В присутствии LIF в культуральной среде, STAT3 соединяется с остатками фосфотирозина активированных LIFR-gp130 гетеродимерных рецепторов²¹ и сам подвергается фосфорилированию и димеризации. Фосфорилированные STAT3 димеры затем транслоцируются в ядро, где они функционируют как транскрипционные факторы. Условно активная форма STAT3, которая индуцируется с помощью tamoxifen (STAT3-oestrogen-receptor (ER) слитого белка)²², может быть использована для подержания плюрипотентного фенотипа, если LIF удаляется из культуральной среды. Однако, минимальная доза STAT3, по-видимому, необходима для умножения и плюрипотентности ESC.

Помимо пути, ведущего к транслокации в ядро STAT3, внутриклеточные домены гетеродимеров LIFR-gp130 могут, после связывания LIF, рекрутировать не-рецепторную тирозин киназу Janus (JAK) и antiphosphotyrosine immunoreactive kinase (TIK) и активировать др. пути (FIG.2). Например, индуцируется фосфорилирование extracellular signal-regulated protein kinases, ERK1 и ERK2 (REF. 23), и увеличивается активность mitogen-activated protein kinase (MAPK)24. Это происходит благодаря активации образующего связи между цитокинами и MAPKs фактора - широко экспрессируемыми tyrosine phosphatase SRC-HOMOLOGY-2 (SH2)-DOMAIN-содержащим белком tyrosine phosphatase-2 (SHP2; REF. 25).

Несмотря на способность передачи сигналов LIF-STAT3 для поддержания само-обновления мышиных ESCs, это не предупреждает дифференцировку человеческих ESCs²⁶ (TABLE 1). В частности, даже с человеческим LIF в культуральной среде, активность гена OCT4 снижается и человеческие ESCs дифференцируются²⁷. Неясно, оказывают ли LIF др. эффекты на ESCs людей. Напр., он м. не быть достаточно эффективным для поддержания недифференцированного роста или он м. активно ингибироваться28. Хотя LIF-(LIFR-gp130)-STAT3 сигнальный путь не является универсальным, он представляет собой четкий пример того, как активация цитокинового пути м.б. использована для изменения клеточной судьбы и потенциала.

BMP4. Нет определенного мнения о том, как этот фактор укладывается в общую молекулярную схему плюрипотентности. Подобно LIF, BMP4 рассматривается ключевым анти-нейрогенным фактором в эмбрионе и его эффект на культивируемые ESCs напоминает LIF, тем, что ESCs дифференцируются в нейроны в его отсутствие²⁹. Более того, мышиные эмбрионы без BMP4 развиваются до стадии, на которой возникают ESCs³⁰. В присутствии LIF, BMP4 вносит вклад в LIF каскад, усиливая само-обновление и плюрипотентность ESCs путем активации гена, кодирующего транскрипционный фактор SMAD4 (similar to mothers against decapentaplegic homologue-4), который, в свою очередь, активирует членов Id (inhibitor of differentiation) семейства генов²⁹ (FIG. 2). Напротив, в отсутствие LIF, BMP4 противодействует LIF каскаду, взаимодействуя с разными SMAD транскрипционными факторами (напр., SMAD1, 5 и 8), которые обладают ингибирующим эффектом на Id гены. BMP белки, как было установлено, являются мишенями др. лигандного каскада, который инициируется соединением WNT со свои рецептором³².

WNT proteins. Канонический WNT путь активируется в результате связывания WNT белка с рецептором Frizzled на клеточной мембране (FIG. 2). Активация пути ведет к ингибированию glycogen-synthase kinase-3 (GSK3), последующему накоплению в ядре ?-catenin и экспрессии генов мишеней. Sato и др. показали, что активация канонического WNT пути поддерживает недифференцированный фенотип ESCs мышей и людей и поддерживает экспрессию специфичных для плюрипотентного состояния транскрипционных факторов OCT4, REX1 (известного также как zinc-finger protein-42; ZFP42) и Nanog²⁷ в отсутствие добавления LIF. Это происходило также после активации нижестоящих мишеней передачи сигналов WNT, таких как cyclin-D1 (REF. 35), MYC36 и BMP белков³².

Emerging transcriptional regulators of ESCs. Выявлен также сигнальный путь, который регулирует взаимодействие между mammalian target of rapamycin (mTOR) и двумя нижестоящими субстратами, eukaryotic translation-initiation factor 4E (eIF4E)-binding protein-1 и ribosomal-protein-S6 kinase42. А inositols участвуют также в другом пути, который нацелен на ген phosphatase and tensin (Pten). Основным субстратом для PTEN является phosphatidylinositol-3,4,5-triphosphate (PtdIns(3,4,5)P3). PTEN, следовательно, завершает передачу сигналов phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) путем дефосфорилирования PtdIns(3,4,5)P3 вторичного мессенджера43. Серин/треониновая киназа AKT является нижестоящим эффектором PI3K, которая фосфорилирует mTOR in vitro, указывая тем самым на прямую связь между mTOR и PI3K-AKT путем, который негативно регулируется с помощью PTEN46. Выявляется также и функция microRNAs (miRNAs) в транскрипционном регуляторном циркуите (circuitry) ESCs. ESCs, лишенные кухни (machinery), которая осуществляет процессинг miRNA транскриптов, не способны дифференцироваться⁴⁹.

Nuclear (transcription factor) pathways

Сигнальные пути в конечном счете ведут в ядро, а в случае ESCs, приводят в результате к индукции транскрипции или репрессии генов, которые ответственны за поддержание плюрипотентности стволовых клеток. Хотя статус stemness (т.е. генов, которые наделяют свойствами стволовых клеток клетки) приложим к таким генам, как Oct4 и Nanog , но они не могут рассматриваться как 'master genes' плюрипотентности - т.к. по удалению LIF Oct4 не может предупредить дифференцировку ESCs самостоятельно, а Nanog не эффективен без Oct4 (BOX 4).

The transcription factor OCT4. OCT4 является POU-DOMAIN транскрипционным фактором, который экспрессируется всеми плюрипотентными клетками во время эмбриогенеза мышей и обильно экспрессируется недифференцированными мышиными ESCs и ECC клеточными линиями^52-55, также как и EGC клеточными линиями⁵⁶. OCT4, как было установлено, является и маркером плюрипотентных ESCs человека16. Это наблюдение следует использовать с осторожностью из-за наблюдения, что нейрональная дифференцировка происходит при сохранении экспрессии Oct4 (REF. 58), что ставит под сомнение общепринятое мнение, что подавление Oct4 необходимо для дифференциации соматических клонов. OCT4 может рассматриваться как участвующий в предупреждении дифференцировки трофэктодермы и вообще соматических клеток из ICM, а также как являющийся критическим для поддержания плюрипотентного состояния во время эмбрионального развития. Однако, гены мишени, которые в действительности ответственны за выполнение решений OCT4, известны только частично^61,62. Пока потенциальные взаимодействия OCT4 с др. (ко)факторами - за исключением SOX2 (SRY related high-mobility group (HMG)-box protein-2; FIG. 2) - остаются неясными.

The transcription factor SOX2. SOX2 является членом семейства HMG-доменовых ДНК-связывающих белков, которые участвуют в регуляции транскрипции и архитектуры хроматина63. SOX2 формирует четвертичный комплекс или с OCT4 или повсеместным OCT1 белком на энхансерных ДНК последовательностях Fgf4 (REF. 64). Это позволяет SOX2 участвовать в регуляции ICM и её потомков или производных клеток. С этой ролью согласуется то, что Sox2 экспрессируется в ESCs, но он экспрессируется также в нервных стволовых клетках. У мутантов Sox2 примитивная эктодерма оказывалась дефектной, но она могла быть нормализована (хотя только выживала дольше) с помощью инъекций ESCs дикого типа в Sox2-/- бластоцисты⁶⁵. С помощью проверки фенотипических последствий у мутантных Sox2 эмбрионов и у химер, была выявлена клеточно автономная потребность в гене как в примитивной, так и вне-эмбриональной эктодерме (мультипотентных предшественниках всех эмбриональных и трофобластных типов клеток, соотв.) Сходные роли были выявлены и для др. генов, которые экспрессируются в популяции клеток-основательниц эмбрионов - Foxd3 (ген транскрипционного фактора, который также известен как Genesis и принадлежит к forkhead семейству транскрипционных факторов с winged-helix ДНК-связывающей структурой). Заметная потеря клеток примитивной эктодермы происходит в Foxd3-/- бластоцистах, а Foxd3-/- ESCs не могут возникнуть, хотя экспрессия Oct4, Sox2 и Fgf4, по-видимому, нормальна в Foxd3-/- ICM⁶⁶. Эти данные подтверждают прямое взаимодействие между OCT4 и FOXD3, точно также как оно очевидно между OCT4 и SOX2 (REF. 67).

The transcription factor Nanog. Исследования по поддержанию плюрипотентности привели к идентификации нового гена, кодирующего гомеодомен-содержащий транскрипционный фактор, который отвечает за LIF-независимую способность обновления и плюрипотентности мышиных ESCs. Этот ген стал называться Tir nan Og или Tir Na Nog, по мифологической стране Кельтов 'вечной молодости'^70,71 (BOX 4). Nanog мРНК присутствует в примордиальных зародышевых и EGCs, и выявлена также генитальном гребне⁷⁰, и она может быть обнаружена с помощью RT-PCR во взрослых тканях⁷². Nanog мРНК не выявляется на более поздних стадиях - ни в зрелых овариях, ни в тестисах⁷¹ ни в GSC клеточных линиях, происходящих из тестисов новорожденных⁵⁷. Это указывает на то, что функция Nanog в зародышевых клетках прогрессивно уменьшается по мере из созревания. Недифференцированные дикого типа ESCs обычно экспрессируют Nanog. Однако, физиологические уровни Nanog в ESCs не предупреждают их дифференцировку после удаления LIF. Так, при физиологических условиях, Nanog , по-видимому, является одним из нескольких факторов, которые экспрессируются в плюрипотентных клетках и подавляются в начали дифференцировки. Однако, NANOG не входит в группу из 532 генов. которые были идентифицированы, как специфичные для ESCs людей¹⁶. Nanog-/- мышиные ESCs дифференцируются медленно в клоны вне-эмбриональной энтодермы, что согласуется с отсутствием примитивной эктодермы у Nanog-/- эмбрионов, которые были проанализированы на ст. E5.5 in vivo71 (FIG. 3). Итак, экспрессия Nanog ответственна за поддержание примитивной эктодермы у эмбрионов. Персистенция Nanog скорее задерживает, чем блокирует дифференцировку ESCs. Напротив, избыточная экспрессия Nanog дает в результате лабильную более устойчивую плюрипотентность⁷³. Итак, количество Nanog на клетку является критическим для стабильного поддержания в недифференцированном состоянии даже в присутствии LIF. Как и в случае с OCT4, было предположено, что Nanog может регулировать дифференцировку посредством репрессии транскрипции генов, которые способствуют дифференцировке (напр., энтодермальный GATA-binding protein-6, Gata6, Rex1/Zfp42 )(REF. 71). Мало известно о регуляции гена Nanog, за исключением того, что активатор транскрипции и опухолевый супрессор p53 соединяется с промотором Nanog, делая тем самым возможной p53-зависимую супрессию экспрессии Nanog75. Интересно, что p53-связывающий элемент был также обнаружен непосредственно выше PTEN77.

STAT3, OCT4, SOX2 and Nanog are not alone. В отсутствие LIF, форсированная экспрессия Pem78 - ещё одного гена помимо Oct4 и Nanog, который продуцирует гомеодомен-содержащий белок - блокирует дифференцировку ESCs как in vitro, так и in vivo. ESCs, которые постоянно экспрессируют Pem не способны формировать опухоли после подкожных инъекций, это указывает на роль PEM в регуляции перехода между недифференцированными и дифференцированными клетками у ранних эмбрионов мышей. Из-за скоротечности существования клеточной популяции ICM или примитивной эктодермы, ранняя роль PEM in vivo менее очевидна, чем его поздняя роль на пост-имплантационных стадиях. После имплантации, экспрессия PEM обнаруживается в ectoplacental cone, примитивной энтодерме (гипобласт), париетальной и висцеральной энтодерме (но не в примитивной эктодерме), указывая тем самым, что PEM выполняет вне-эмбриональные функции.

Combinatorial signals for pluripotency

Обсудив элементы программы отдельно, теперь необходимо описать комбинаторную модель их функции.

Combinatorial signalling of Nanog and OCT4. Пониженная экспрессия Oct4 заставляет мышиные ESCs дифференцироваться трофэктодерму, это выявляется по клеточной морфологии и экспрессии маркерных генов (напр., caudal-type homeobox transcription factor-2, Cdx2). Однако Nanog-дефицитные эмбрионы не формируют примитивную эктодерму и Nanog-/- клетки дифференцируются в висцеральную и париетальную энтодерму (GATA6- и GATA4-позитивные клетки соотв.). Эти наблюдения указывают на то, что два гена оперируют независимо др. от др., но их функции скоординированы. Первичная функция OCT4 и Nanog может заключаться в репрессии дифференциации эмбриональных клеток, а комбинационный сигнал от обоих белков ведет к обновлению и плюрипотентности примитивной эктодермы. Исходя из предположения, что OCT4 и Nanog последовательно супрессируют дифференцировку ICM во вне-эмбриональные клоны - сначала в трофэктодерму (OCT4), затем в примитивную энтодерму (Nanog) - т.к. их уровни снижаются в примитивной эктодерме, то дальнейший онтогенетический контроль последующей дифференцировки примитивной эктодермы может обеспечиваться др. генами, такими как Sox2 (REF. 65) и Foxd3 (REF. 66). Nanog and STAT3 function in parallel. Установлено отсутствие взаимодействия между OCT4 и STAT3 и появление взаимодействия между Nanog и STAT3, природу которого еще предстоит установить. WNT and OCT4. Эффект мутантных Wnt3 на уровни OCT4 в мышиных ESCs, и участие и WNT и OCT4 в порогами опосредованных реакциях, указывают на интригующую возможность, что каскад передачи сигналов WNT и роль OCT4 в качестве детерминанта клеточной судьбы непосредственно связаны. Oct4 and Sox2. Соседние octamer и sox элементы были также идентифицированы как цис-регуляторные элементы в Fgf4 (REF. 64), Sox2 (REF. 82), Utf1 (REF. 81) и Fbx15 (REF. 88) генах, которые экспрессируются в ECC и ESCs и во время эмбриогенеза.

Pluripotency pathways in other systems

На базе данных, представленных выше, интересно бы определить, може ли плюрипотентность устанавливаться и размножаться in vitro с помощью методов, иных, чем возникновение ESCs от зиготических эмбрионов. Современное отсутствие контроля над судьбами эмбриональных стволовых клеток приводит к интересной параллели отсутствия дефинитивного контроля над ядрами дифференцированных клеток, которые приобретают повторно плюрипотентность после переноса в ооциты (cloning). Недавние успехи в получении линий плюрипотентных стволовых клеток человека^14,89 и успехи в клонировании эмбрионов млекопитающих с помощью NUCLEAR TRANSFER, создают привлекательные возможности для восстановления функции ткани с помощью клеточных трансплантаций с использованием SCNT - часто обозначаемым как терапевтическое клонирование. CLONAL бластоцисты могут быть использованы для получения почти безупречно подходящих ESC клеточных линий, которые можно будет заставить дифференцироваться in vitro и обеспечить пациента клетками для аутологичных трансплантаций. Терапевтическое клонирование не является неразумным предположение, т.к. было продемонстрирована его осуществимость на мышах^90,91, а недавно и на людях89. Прежде чем эта процедура будет разрешена для клинического применения необходимо установить, как заканчивается в действительности процесс ре-программирования. Контроль экспрессии Oct4 и Nanog является важным для успешного клонирования, при котором унипотентное клеточное ядро становится плюрипотентным, перенесенное в ооплазму, установлено, что ряд онтогенетических генов, ассоциированных с плюрипотентностью, экспрессируется^92,93. Потребность в Oct4 и Nanog для поддержания плюрипотентности указывает на то, что аллели, производные соматических клеток, могут реактивироваться в результате ядерного ре-программирования после SCNT в ооциты. Показано, что реактивация молчащих соматических аллелей Oct4 и Nanog происходит только частично в мышиных клонах^73,92. Интересно, что частота реактивации Nanog превосходит таковую Oct4 (REF. 73). Напротив, инактивация Х хромосомы, по-видимому, происходит также как во время нормального развития⁹⁴. Однако, даже в случае Х инактивации, как было показано, когда она происходит собственно в производных соматических клеток клонируемых эмбрионах мышей, то незначительные аномалии в экспрессии и METHYLATION некоторых импринтируемых генов происходят в мышиных клонах, которые происходят из соматических клеток⁹⁵ и ESCs⁹⁶. Однако, жизнеспособное клональное 'offspring' может доживать до взрослого состояния несмотря на распространенные нарушения в экспрессии этих генов. Внутри клональных эмбрионов ре-программирование соседних бластомеров, по-видимому, происходит независимо др. от др. и на ст. бластоциста OCT4 экспрессируется соматическими клетками, но не др. в ICM - феномен известный как 'mosaicism'. Хотя частичное ре-программирование одного ключевого гена, ассоциирующее с частичным ре-программированием др., и т.д., показывает, что имеется субнабор клонов, в которых имеются, по крайней мере, некоторые клетки, которые ре-программированы по всем генам. ESC-производная, дифференцировочная и трансплантационная терапия после SCNT не нужна для полноценного эмбрионального развития. Она необходима для формирования бластоцистов, возникновения ESCs из них, и затем дифференцировки ESCs в специфические типы клеток. Итак, частичное превращение однопотентной программы в плюрипотентную может быть достаточным для терапевтического клонирования.

Мы задавались вопросом, может ли плюрипотентность вызвана и умножена in vitro с помощью методов, иных, чем базирующиеся на ESCs из зиготических эмбрионов - и ответ до с помощью SCNT. Сходным образом было бы интересно определить, могут ли методы, иные, чем клонирование с помощью SCNT в ооцитах, достичь подобных результатов. Когда плюрипотентные стволовые клетки используются вместо ооцитов в качестве реципиентов для переносимых ядер, которое осуществляется в результате межклеточного слияния, то гибридные клетки обнаруживают потерю стадио- и ткане-специфических маркеров родительских соматических клеток (gene extinction) и de novo активацию признаков и генов, которые характерны для плюрипотентных клеток. X инактивация, напр., является процессом, который тесно связан с дифференцировкой и происходит в теле самок. Путем демонстрации ре-активации X хромосомы после слияния клеток и и её последующей случайной инактивация во время дифференцировки возможно подтвердить, что плюрипотентные стволовые клетки могут перенастроить метку инактивации правильно^97,98. Более того, индуцированные к дифференцировке или in vitro или in vivo, может быть получен широкий спектр дифференцирующихся клеток несмотря на их тетраплоидное состояние. Гибридные клетки могут быть также проверены в отношении их онтогенетического потенциала путем инъекций их в хозяйский бластоцист. Путем генерации жизнеспособных химер возможно получать клеточные гибриды в разных тканях, это указывает на способность этих инъецированных клеток вносить вклад во все клеточные клоны. Имеется заманчивая возможность, что клеточное слияние может естественно происходить in vivo, так что взрослые стволовые клетки одной ткани могут генерировать дифференцированные клетки, которые специфичны для др. ткани путем слияния с местными клетками^99-102 и последующей сегрегацией. Однако, клеточное слияние не может обяснить всех появляющихся кажущихся трансдифференцировок¹⁰³.

Безусловно было бы интересно определить, может ли плюрипотентность быть достигнута и умножена in vitro с помощью методов, иных чем перенос ядер - или в ооциты или др. клетки (слияние) - используя клеточную и регуляторную системы, иные, чем ESCs, и вообще в отсутствие внеклеточных факторов. Напр., мультипотентные взрослые клетки предшественники, MAP-C клетки, которые происходят из стромы взрослого костного мозга, по-видимому, приобретают снова плюрипотентность in vitro в отсутствие компании др. клеток, которые могли бы секретировать плюрипотентные факторы. Однако, это долговременный процесс, а уровень экспрессии клетками MAP-C Oct4 в 1,000-раз меньше, чем в ESCs104.

Итак, очевидно, что плюрипотентность достигается посредством комбинации собственно последовательно расположенных процессов, которые контролируют доступность хроматина, модификации хроматина, активацию и экспрессию специфических генов. Это осложняется потребностью в тонко настроенной регуляции относительных уровней экспрессии. Nanog оказался прославленным как столь же важный, как и OCT4, который в течение многих лет считался единственным транскрипционным фактором, который строго и без сомнения ассоциирован с плюрипотентностью. Однако, OCT4-связывающие сайты недавно были обнаружены в вышестоящей контролирующей области Nanog, что подкрепляет центральную тему этого обзора. Мы подтвердили, что невозможно, чтобы скрининг 'pluripotent' библиотеки кДНК не привел к открытию того, что действительно наделяет плюрипотентностью. Некоторые вопросы, связанные с плюрипотентностью остаются открытыми. Учитывая , что прирожденные регуляторы OCT4 и Nanog существенны, но недостаточны для спецификации плюрипотентного состояния клеток, мы д. открыть гены, лежащие выше и контролирующие экспрессию Oct4 и Nanog. Имеются ли и др. гены, которые обеспечивают плюрипотентность, в частности какие-либо 'master' гены? Манипуляции с такими 'master' генами могли бы послужить инструментом для разрешения этических затруднений, связанных с клонированием человека, т.к. такой ген мог бы быть мишенью для ANT (altered nuclear transfer)¹⁰⁵. Этот подход мог бы послужить панацеей для современной регенеративной медицины, хотя нет согласия относительно правомерности этого предположения¹⁰⁶.

Note added in proof

Boyer et al.135 картировали транскрипционные факторы OCT4, SOX2 и Nanog в промоторах большой популяции генов, которые предопределяют позитивно или негативно ESCs человека. Авт. показали, что промоторные области ко-оккупируются OCT4, SOX2 и Nanog как в транскрипционно активных генах, которые выполняют роль в предопределении качественных особенностей ESC (недифференцированный фенотип) и в неактивных генах, которые способствуют их развитию, будучи депрессированными (дифференцировка). Совместное присутствие OCT4, SOX2 и Nanog на генных промоторах интерпретируется клетками комбинационным способом посредством ауторегуляторных и петель прямой связи (feed-forward). Это исследование предоставило более исчерпывающую карту основных регуляторных циркуитов плюрипотентности

Название статьиREGULATORY NETWORKS IN EMBRYO-DERIVED PLURIPOTENT STEM CELLS Michele Boiani and Hans R. Schuler NATURE REVIEWS | MOLECULAR CELL BIOLOGY | NOVEMBER 2005 | VOLUME 6 No 11, P.872-884

Название статьи
REGULATORY NETWORKS IN EMBRYO-DERIVED PLURIPOTENT STEM CELLS

Michele Boiani and Hans R. Schuler

NATURE REVIEWS | MOLECULAR CELL BIOLOGY | NOVEMBER 2005 | VOLUME 6 No 11, P.872-884