ECM | ILK | PtdIns(3,4,5)P3 | PH |

Extracellular matrix (ECM) создает структурную поддержку для формирования тканей и органов. ECM соединяется с substrate-adhesion молекулами на поверхности клеток и влияет на различные пути передачи внутриклеточных сигналов, которые регулируют жизнеспособность, пролиферацию, полярность и дифференцировку. Важным семейством адгезивных молекул, которые соединяются с ECM являются integrins. Интегрины являются гетромерными трансмембранными белками, которые состоят из α и β субъединиц, и они состоят из крупных внеклеточных доменов и относительно небольших цитоплазматических доменов¹. Интегрины могут переключаться между активной и неактивной конформацией. В активном состоянии интегрины обладают низким сродством к лигандам. Внутриклеточные сигнальные события, такие как стимуляция protein-kinase-C, могут быть первичными для интегринов, они приводят в результате к конформационным изменениям, которые приводят к экспозиции лиганд-связывающего сайта (FIG. 1). Связывание лиганда активирует сигнальные каскады, которые ведут к сборке мультибелковых комплексов в местах клеточной адгезии с ECM. Эти события имеют два важных значения для клетки: они образуют соединение между ECM и актиновым цитоскелетом и они изменяют ход путей многих внутриклеточных сигналов.

Среди интегринов, β1 integrin вносит вклад в большое количество интегриновых гетеродимеров, тогда как β3 integrin dsgkyztn важную адгезивную роль в тромбоцитах - выдающаяся система для изучения адгезии между ECM и клетками¹. β1 и β3 integrins экспрессируются широко, а изучение функции β1 и β3 integrins предоставляет много общей информации на обеспечиваемую интегринами адгезию. Делеция высоко законсервированного гена β1 integrin у разных организмов ассоциирует с дефектами адгезии, пролиферации, жизнеспособности и полярности^2-6. Однако, хотя эти эксперименты и показали, что integrins важны для этих процессов, они дали моло информации о том, как эти процессы регулируются. Делеции определенных молекул фокальной адгезии у разных организмов приводят к довольно сходным фенотипам, к β1-integrin-нулевому фенотипу, это указывает на то, что определенные внутриклеточные белки могут играть ключевую роль в регуляции функции β1 integrins.

Три белка, которые были выявлены в этих исследованиях в качестве важных регуляторов передачи интегринами обеспечиваемых сигналов, это integrin-linked kinase (ILK), адапторный белок PINCH (наиболее интересный Cys-His-rich белок) и parvin. Эти молекулы формируют гетеротрехмерный комплекс, который мы обозначили как IPP комплекс, который назван по входящим в него компонентам. Рассмотрим современные знания от функции IPP комплекса. Взаимодействия между компонентами IPP и многочисленными партнерами по связыванию будут обсуждены, чтобы объяснить, как комплекс IPP функционирует в качестве адаптора между интегринами и актиновым цитоскелетом, и как центр (hub), который регулирует несколько сигнальных путей.

Identification, architecture and assembly of IPP

ILK была идентифицирована в 1996 в двугибридном скрининге у дрожжей на белки, которые могут соединяться с цитоплазматическим концом β1 integrin⁷. Белок, который был клонирован содержал три домена (FIG. 2). N-terminal домен содержит 3 ankyrin повтора, которые обеспечивают межбелковые взаимодействия, и предположительно четвертый ankyrin повтор, который лишен законсервированных остатков. C конец обладает значительной гомологичной последовательностью с Ser/Thr protein kinases. Предполагаемый pleckstrin homology (PH) домен располагается между этими двумя доменами и частично ч ними перекрывается. Эксперименты с культурой клеток показали, что физиологическим лигандом ILK PH домена является phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate (PtdIns(3,4,5)P3)^8,9. ILK является центральным компонентом комплекса IPP; он связывает PINCH белки посредством N-терминального домена ankyrin-повтора и parvins посредством киназного домена. Он также связывает комплекс с цитоплазматическими концами β1 и β3 integrins^7,10-14, но пока не известно, связывает ли он др. интегрины. Одиночная изоформа ILK идентифицирована у всех видов, обсуждаемых в этом разделе.

PINCH1 (известный также как LIMS1) первоначально был идентифицирован в 1994 как маркер стареющих эритроцитов, а его связь с ILK обнаружена в 1999 (REFS 15,16). Вторая изоформа, PINCH2 (известная также как LIMS2), была предсказана на основании последовательностей бызы данных и в последствие охарактеризована^17,18. PINCH1 и PINCH2 являются адапторными белками, которые состоят из 5 LIM доменов и тандемных nuclear localization signals^17,19, обе изоформы соединяются с ILK посредством N-терминального LIM домена взаимно исключающим способом^10,18. Имеется существенное перекрывание в паттернах экспрессии PINCH1 и PINCH2 во взрослых тканях и оба гена экспрессируются в слоях гладких мышц развивающегося эмбриона₁₉.

Parvins - семейство белков, которое состоит из actopaxin/CH-ILKBP/α-parvin, affixin/β-parvin и γ-parvin - соединяется с ILK посредством второго из двух calponin homology (CH) доменов^13,14,20,21. Взаимодействие между α-parvin и ILK частично зависит от PtdIns(3,4,5)P3 (REF. 22) и от фосфорилирования α-parvin с помощью CDC2 и mitogen-activated protein kinase (MAPK)^23-25. Неясно, регулируются ли др. parvins сходным образом, хотя β-parvin также может быть фосфорилирован¹⁴ (TABLE 1). α- и β-parvin имеют перекрывающиеся паттерны экспрессии в разных тканях, но экспрессия γ-parvin ограничена гематопоэтической системой²⁶. Следовательно, возможно, что разные IPP комплексы могут собираться внутри одной и той же клетки. Эта идея в дальнейшем была подтверждена, т.к. было показано, что small inhibitory RNA (siRNA)-обусловленный нокдаун α-parvin в клетках HeLa стимулирует активность Rac и образование lamellipodium. Это говорит о том, что α-parvin может функционировать как негативный регулятор Rac в клетках, которые экспрессируют как α- так и β-parvin²⁷. Избыточная экспрессия β-parvin в клетках HeLa способствует апоптозу, вообще-то из-за конкуренции с α-parvin за связывание ILK. Мониторинг уровней экспрессии parvins в клетках, которые подверглись воздействию специфических условий, и иммунопреципитация дискретных комплексов IPP д. определить, имеют ли эти данные биологическое значение и позволяют ли они исследования механизмов, которые регулируют экспрессию разных изоформ parvin.

IPP-complex assembly and stability. Ансамбль IPP-комплекса предшествует клеточной адгезии, это указывает на то, что комплексы сначала образуются в цитозоле, независимо от адгезивных сигналов²⁸. Стабильность индивидуальных компонентов IPP зависимт от формирования комплекса, т.к. RNA interference (RNAi)-обусловленное истощение одного из членов комплекса приводит в результате к деградации др. компонетов с помощью proteasome-обусловленного процесса²⁹. Это осложняет интерпретацию результатов по генетическим делециям или RNAi деплеции, из-за дефектов, которые ассоциируют с делецией одного из компонентов, что может быть обусловлено снижением уровней др. компонентов. Начато исследование специфических ролей членов IPP-комплекса, принимая во внимание их взаимную стабилизацию и деградацию³⁰. Деградация ILK или PINCH белков может быть предупреждена экспрессией PINCH1 или PINCH2 LIM1 домена в Pinch1-дефицитных клетках³¹ или экспрессией ILK ankyrin повторов в Ilk-дефицитных клетках, соотв. (C. Grashoff and R.F., unpublished data), но только комплекс, который состоит из белков полной длины эффективно собирается в фокальные адгезии в культуре клеток позвоночных^20,28,32. Хотя полной длины IPP комплекс необходим для сборки фокальных адгезий у позвоночных, др. факторы также необходимы для сборки IPP комплексов в фокальные адгезии, включая адапторную молекулу paxillin и возможно MIG2/kindlin-2 (REFS 28,33). Оба эти белка непосредственно соединяются с IPP комплексом посредством киназного домена ILK^33,34. Значительно больше белков может участвовать на этой стадии сборки и таргетинга IPP-комплексов. Интересно, что у эмбрионов Drosophila melanogaster PINCH гомолог, steamer duck (STCK), не нужен, чтобы локализовать ILK в сайтах клеточной адгезии³⁵.

IPP-binding partners

Имеется множество молекул, которые, как было установлено, взаимодействуют с IPP комплексами³⁶. Функция IPP комплекса в качестве сигнальной платформы достигается посредством его непосредственного взаимодействия с факторами. которые функционируют в качестве вышестоящих регуляторов многих различных сигнальных путей (FIG. 3).

ILK-interacting partners. Как упоминалось выше, ILK позвоночных может непосредственно соединяться с цитоплазматическими концами β1 и β3 integrins^7,11,12 и тем самым косвенно соединяется с актиновым цитоскелетом посредством своего взаимодействия с parvins. Взаимодействия с цитоскелетом могут также происходить посредством LD мотива и LIM-доменоваого адапторного белка paxillin, которые соединяются с F-actin путем взаимодействий α-parvin и actin-связывающей адапторной молекулы vinculin^20,37,38. Paxillin соединяется с ILK посредством paxillin-binding site (PBS) внутри киназного домена ILK³³. Более того, Caenorhabditis elegans ILK соединяется с UNC-112, ортологом MIG2/kindlin-2 позвоночных (REF. 34). У позвоночных, kindlin-1 соединяется с цитоплазматическими доменами β1 и β3 integrins³⁹, a его потеря вызвает синдром Kindler⁴⁰. MIG2/kindlin-2 соединяется с migfilin, который в свою очередь соединяется с filamin - адапторным белком, который взаимодействует с несколькими молекулами, включая filamentous (F)-actin и integrins^41,42 - и предоставляет др. соединение между ILK и актиновым цитоскелетом.

Binding partners of the PINCH isoforms. Специфичность передачи сигналов IPP комплексов зависит от присутствия разных изоформ PINCH или parvin. Когда PINCH2 избыточно экспрессируется в базовом PINCH1-экспрессирующем фоне, то он конкурирует с PINCH1 за связывание ILK, но не может передавать интегринами обусловленные сигналы, которые контролируют распространение и миграцию клеток¹⁸. Также. хотя экспрессия химерного PINCH, который состоит из PINCH1 LIM доменов и PINCH2 C-терминального хвоста, не м. восстанавливать распространение PINCH1-knockdown HeLa клеток³⁰, тогда как экспрессия полной длины PINCH2 на Pinch1-нулевом фоне полностью восстанавливает дефекты адгезии и распространения Pinch1-нулевых фибробластов³¹. Следовательно, изоформы возможно ответственны за передачу сигналов, которые контролируют распространение клеток. Функциональные различия между PINCH1 и PINCH2 м. возникать в результате дифференциального связывания Ras-супрессорного белка RSU1. RSU1, как было показано, функционирует как негативный регулятор индуцированной ростовым фактором активации Jun N-terminal kinase (JNK)^43-46 (FIG. 3). RSU1 взаимодействует также с LIM5 доменом PINCH1 у D. melanogaster⁴⁵ и позвоночных⁴⁶, но это взаимодействие специфично для PINCH1. PINCH2 не соединяется с RSU1, т.к. последовательности LIM5 домена отличны¹⁹.

Thymosin-β4 соединяется с LIM доменами -4 and -5 PINCH1, усиливает активность ILK и позитивно влияет на миграцию и жизнеспособность кардиальных клеток⁴⁷. Взаимодействуют ли PINCH2 и thymosin-β4 не известно, но при условном нокауте Pinch1 в вентрикулярных кардиомиоцитах мышей не обнаруживается заметных фенотипических отклонений⁴⁸, указывая тем самым, что PINCH2, который также экспрессируется в сердце¹⁹, м. компенсировать потерю PINCH1. PINCH1 соединяется также с receptor-tyrosine-kinase адапторным белком NCK2 in vitro посредством LIM4-SH3-домена (Src-homology-3 домена) взаимодействия^49,50. Мутации у позвоночных в PINCH1, которые разрушают PINCH1-NCK2 связывание, редуцируют количества PINCH1, которые обнаруживаются в фокальных адгезиях⁴⁹, но значение PINCH1-NCK2 взаимодействия неясно. Нет доказательств такого взаимодействия у C. elegans или D. melanogaster. Мыши, которые несут Nck1 или Nck2 генетическую делецию, фенотипически нормальны, тогда как мыши. которые лишены обоих белков погибают во время эмбриогенеза. Дефекты миграции и цитоскелета Nck1-/- Nck2-/- фибробластов⁵¹ устраняются, когда NCK1 вносится повторно, хотя PINCH1-NCK взаимодействие специфично для NCK2. Более того, NCK1, как было показано, не соединяется с PINCH1 (REF. 52). Эти результаты указывают на то, что взаимодействие между PINCH1 и NCK2 м.б. несущественными in vivo.

Parvins have overlapping binding partners. α-Parvin соединяется с F-actin непосредственно, а также косвенно путем взаимодействия с paxillin²⁰. Пока не известно. соединяются ли ILK и изоформы parvin с одной и той же молекулой paxillin, или только если две молекулы paxillin соединяются с одиночным IPP комплексом. HIC5, родственный paxillin белок, также связывается с α-parvin²⁰. HIC5 соединяется со многими из белков, которые связывают paxillin, но он также снует в ядро, где он модулирует экспрессию некоторых генов^53,54. Кроме того, α-parvin специфически соединяется с TESK1, Ser/Thr киназой, которая фосфорилирует actin-регулируемый белок cofilin⁵⁵. β-Parvin соединяется с F-actin, но м. также соединяться с actin-crosslinking белком α-actinin⁵⁶ и guanine nucleotide-exchange factor α-PIX⁵⁷. Он следовательно, предоставляет связь между IPP комплексом и actin-регулирующими GTPases Rac1 и Cdc⁴² (FIG. 3). α-PIX, в свою очередь соединяется с PAK1 (REF. 58), Rac1/Cdc42 эффектором. который регулирует динамику цитоскелета посредством LIM-kinase-ADF-cofilin пути (где ADF является поддержкой actin-depolymerizing factor)⁵⁹. Более того, α-PIX соединяется с протеазной субъединицей calpain-4 (REF. 60). Calpain-4 как было показано, расщепляет talin и это расщепление является скорость-ограничивающей ступенью в разборке фокальныйх адгезий⁶¹. Функции parvin-связывающих партнеров указывают на то, что parvins играют роль в регуляции динамики актина и обороте фокальных адгезий. β-Parvin соединяется также с мембраны репарирующим белком dysferlin на сарколемме скелетных мышц; наблюдение, которое выявило потенциальную роль β-parvin в репарации мембран⁶². Партнеры по связыванию менее охарактеризованного γ-parvin ещё не идентифицированы.

Other roles of the IPP-complex proteins? Делеция одного из компонентов IPP комплекса приводит к деградации др. компонентов, но эта деградация оказывается незавершенной^29,63, это указывает на то, что индивидуальные компоненты могут выполнять дополнительную роль вне комплекса. PINCH1 снует между ядром и цитоплазмой в Шванновских клетках и он обнаружен в ядрах первичной энтодермы мышей и мышечных клетках C. elegans. Эти наблюдения указывают на то, что PINCH1 может играть роль в регуляции генов или передаче сигналов между цитоплазмой и ядром^17,63,64. β-Parvin локализуется в сарколемме скелетных мышц, где он может играть роль в Ca²⁺-зависимой репарации мембран вместе с dysferlin⁶². ILK распределяется по межклеточным контактам в дифференцирующихся кератиноцитах, где он участвует в ранних ступенях формирования слипчивых соединений (adherens-junction)^65,66.

ILK catalytic activity

ILK функционирует в качества адапторного белка, но недавно было установлено, что ILK обладает также каталитической активностью. Киназный домен ILK обнаруживает существенную гомологию с Ser/Thr protein kinases, за исключением последовательностей внутри каталитической петли и законсервированного DXG мотива^67,68. Эти отличия от канонических киназных последовательностей трудно согласо, т.к. ILK лишен обычной каталитической базы и Mg2+-chelating остатков. Более того, последовательность ILK каталитического домена различна у разных видов⁶⁹ (FIG. 4). Такая толерантность к мутациям указывает на то, что ILK обладает киназной активностью, которая возможно необязательна для его функции. Тем не менее, рекомбинантная, очищенная ILK, ка было установлено, фосфорилирует некоторые субстраты in vitro^7,70,71 (TABLE 1), и вполне возможно, что ILK сохраняет остаточную киназную активность, которая выявляется in vitro. Т.к. кинетические скорости киназной реакции не были определены, а доказательства киназной активности in vivo слабы, то нельзя пока решить, обладает ли ILK достаточной активностью, чтобы действовать как физиологически действующая киназа in vivo.

ILK model substrates. Наиболее широко используемые последствия активности ILK это фосфорилирование GSK3β и AKT/PKB (protein kinase B), которые регулируют многие различные сигнальные пути (FIG. 3). Активация AKT/PKB нуждается в фосфорилировании по Thr в положении 308 с помощью phosphatidylinositol3-kinase (PI3K)-dependent kinase-1 (PDK1) и по Ser в положении 473 с помощью PDK2 (которая известна также как hydrophobic-motif kinase (HMK)). Идентификация PDK1 является однозначной, но качественные особенности PDK2/HMK всё ещё предмет споров. ILK, среди др. кандидатов (BOX 1), как было предположено, действует как HMK и эта идея находит себе подтверждение в иммунопреципитации. показавшей, что ILK непосредственно связана с AKT/PKB71.

Regulation of ILK activity. ILK-зависимое фосфорилирование регулируется PI3K-зависимым способом. Ингибиторы активности PI3K редуцируют и активность ILK в лизированных клеточных иммунопреципитатах и нарушают фосфорилирование предполагаемых ILK субстратов в клеточных культурах, в то время как избыточная экспрессия PI3K каталитической субъединицы или добавление PtdIns(3,4,5)P3 усиливает ILK-зависимую киназную активность в культурах клеток и in vitro, соотв.⁸. Экспрессия thymosin-β4 в кардиомиоцитах также увеличивает активность ILK, как показывает уровень фосфорилирования AKT/PKB и Ser473⁴⁷. Напротив, каталитическая активность ILK негативно регулируется с помощью phosphatase, ILK-associated protein (ILKAP). ILKAP редуцирует киназную активность ILK in vitro и фосфорилирование GSK3β in vivo, но фосфорилирование AKT/PKB остается неизменным^72,73. Это демонстрирует, что механизмы активации GSK3β и AKT/PKB разные, несмотря на тот факт, что оба белка описаны как субстраты для ILK. Механизмы, с помощью которых ILKAP редуцирует активность ILK в отношении определенных субстратов, не известны. Сообщалось, что ILK может аутофосфорилироваться in vitro², но функция аутофосфорилирования ILK in vivo не изучена.

Perturbation of ILK function. Несмотря на доказательства в пользу киназной активности ILK, генетические эксперименты не смогли продемонстрировать критическую роль киназной активности ILK в некоторых типах клеток. Альтерации в статусе фосфорилирования AKT/PKB или GSK3β не выявляются в Ilk^-/- фибробластах⁷⁴. Более того, статус фосфорилирования предполагаемых ILK субстратов остается неизменным в хондроцитах или кератиноцитах, которые не экспрессируют ILK (K. Lorenz and R.F., unpublished data, and REF. 75). Напротив, делеция Ilk в иммортализованных макрофагах приводит к уменьшению фосфорилирования AKT/PKB и GSK3β, которое устраняется при трансфекции ILK дикого типа, но не киназа-дефицитной мутантной ILK⁷⁶. Это расхождение может отражать клеточно-специфические различия или может указывать на повышенную зависимость от киназной активности ILK в результате иммортализации.

Низко-молекулярные ингибиторы, которые созданы для специфического подавления киназной активности ILK, предупреждают фосфорилирование AKT/PKB и GSK3β? когда вносятся в клеточные линии с избыточной экспрессией ILK^9,71,77. Дальнейшая характеристика одного из этих ингибиторов, KP-392, показала. что он нарушает взаимодействие между ILK и α-parvin и paxillin, и блокирует накопление α-parvin и paxillin в фокальных адгезиях²².

Сходным образом, некоторые различные точковые мутации в ILK, которые были разработаны для устранения каталитической активности, нарушают межбелковые взаимодействия и могут действовать, предупреждая сборку функциональных комплексов IPP. избыточная экспрессия дикого типа ILK в клеточных культурах приводит к усилению фосфорилирования AKT/PKB и GSK3β во многих типах клеток. Напротив, избыточная экспрессия доминантно-негативной мутации ILK (Glu359Lys) редуцирует фосфорилирование AKT/PKB и GSK3β. Хотя мутация Glu359Lys м нарушает киназную активность ILK8,⁷⁸, но в др. исследованиях утверждается, что эта мутация не влияет на киназную активность ILK in vitro^14,79. Вместо этого Glu359Lys мутация нарушает взаимодействие между ILK и α-parvin и paxillin, что приводит в результате к неспособности сборки ILK в фокальные адгезии^14,79. Некоторые инактивирующие точковые мутации в киназном домене ILK были использованы для вычленения киназной функции, но эти мутации (Arg211Ala, Ser343Ala и Lys220Ala) нарушали также ILK-белок взаимодействия, что делает невозможным интерпретацию отсутствия киназной активности. Мутация Arg211Ala приводит в результате к дефициту связывания α-parvin²², a это взаимодействие необходимо для доставки ILK в фокальные адгезии²⁸. Мутация Ser343Ala устраняет связывание с AKT/PKB, но этот мутантный белок локализуется в фокальных адгезиях^71,80. Мутанты Lys220Ala не способны связывать β-parvin⁸¹. Др. мутация в этом сайте, Lys220Met позволяет связывать β-parvin, но не обнаруживает каталитической активности¹⁴, а др. активирующая мутация, Ser343Asp, обращает этот эффект⁶⁹ несмотря на потребность в Lys220 для протеин-киназной активности^68,82. Мутация Phe438Ala, которая делает невозможной сборку в фокальные адгезии, как полагают, не связывает MIG2/kindlin-2 (REF. 28). Более того, мутации в ILK, которые обнаруживают доминантно-негативные эффекты в клеточной культуре (Glu359Lys или Lys220Met), или устраняют активность protein kinase Raf при не-пермиссивных температурах (Pro358Ser), полностью нормализуют фенотип мутаций ILK с потерей функции у C. elegans (тестирована только Glu359Lys) и у D. melanogaster (все три ILK мутации). Это указывает на то, что киназная активность безразлична для функции ILK у этих организмов^34,83. Однако, остаточная киназная активность может быть достаточной для полного восстановления фенотипа дикого типа.

RNAi исследования в трансформированных клетках показали, что нокдаун экспрессии ILK, PINCH1 или α-parvin белка коррелирует со снижением фосфорилирования AKT/PKB Ser473 (REFS 29,76,84-86). Более того, AKT/PKB Thr308 фосфорилирование также редуцирует отсутствие PINCH1 (REF.29). AKT/PKB не располагается в плазматической мембране в α-parvin истощенных HeLa клетках, несмотря на присутствие ILK в фокальных адгезиях, это демонстрирует, что α-parvin необходим для правильного таргетинга AKT/PKB перед активацией⁸⁴. Однако, если AKT/PKB постоянно поставляется в мембрану, то фосфорилирование Ser473 не зависит от ILK^29,84. Необходимо отметить, что повышенный апоптоз, который возникает в результате нокдауна ILK или PINCH1 не устраняется восстановлением фосфорилирования AKT/PKB, это указывает на то, что эти молекулы регулируют многочисленные пути выживания. Все эти данные по мутагенезу, ингибированию малыми молекулами и RNAi указывают на модель, согласно которой ILK активирует AKT/PKB непрямо, путем облегчения транслокации AKT/PKB в плазматическую мембрану α-parvin-зависимым способом. Будучи локализованным в плазматической мембране AKT/PKB может быть фосфорилирован с помощью др. киназ.

The role of the IPP complex in invertebrates

To study the contribution of the IPP complex to development, genetic deletion of most components has been achieved in C. elegans, D. melanogaster and mice (see Supplementary information S1 (table)). The phenotypes caused by these deletions confirm a role for the IPP complex as an adaptor complex between the ECM and the actin cytoskeleton, but insights into the signalling function are not as forthcoming, and a role for the ILK catalytic activity has not been established. Differences in phenotypes among IPP components, particularly in mice, reveal that, in addition to a common function as part of the IPP complex, each component has discrete functions.

Invertebrates represent relatively simple systems to study integrin-mediated functions. C. elegans has one в integrin (βPAT-3) and two α integrin (αPAT-2 and αINA-1) subunits; D. melanogaster has two β integrin (βPS and βv) and five α integrin (αPS1-5) subunits. Both organisms have a single orthologue of ILK, PINCH and parvin, which allows straightforward analysis of deletion phenotypes. C. elegans has a second PINCH1- related gene but this shows only 34% identity with PINCH1 and contains a putative endoplasmic reticulum (ER) targeting sequence.

Studies in C. elegans. In C. elegans, genetic deletion of вpat-3 (REF. 3), pat-4 (which encodes the ILK orthologue)34, unc-97 (which encodes the PINCH orthologue)¹⁷ or pat-6 (which encodes the parvin orthologue)⁸⁷ all produce mutants with a similar PAT phenotype. Although a direct physical interaction between βPAT-3 and PAT-4 has not been reported, deletion of вpat-3 or the ECM component unc-52 (which encodes the orthologue of perlecan) results in mislocalization of PAT-4, which indicates that PAT-4 requires integrins and ECM to localize to dense bodies³⁴. Recruitment of PAT-4 to dense bodies, and the correct organization of βPAT-3 at the cell membrane also depend on UNC-112 (the orthologue of MIG2/kindlin-2)^34,88. However, there is no evidence that PAT-4 regulates the GSK3β signalling pathway in this organism, as the defects that arise from deletion of pat-4 are distinct from the phenotype of the GSK-3β mutant in C. elegans³⁴. A novel Zn²⁺-finger protein that is unique to C. elegans, UNC-98, binds to UNC-97 at M-lines and dense bodies⁸⁹. Both proteins are also detected in the nucleus, which indicates that they might be involved in gene regulation^17,89.

Studies in D. melanogaster. In D. melanogaster, deletion of βPS, the orthologue of the vertebrate в1 integrin subunit², or loss of function of ILK⁸³ or the PINCH orthologue³⁵, result in striking embryonic muscle-attachment defects. вPS and PINCH-deficient flies also show dorsal-closure defects, which indicates that cell migration is impaired2,45. Adult chimeric flies display a blister phenotype in wing regions that lack these proteins. These phenotypes are consistent with the loss of cell adhesion to the ECM. However, βPS mutants show adhesion defects that result from the detachment of the cell membrane from the ECM, whereas the ILK and PINCH mutants are characterized by the detachment of the actin cytoskeleton from the cell membrane. Interestingly, ILK localizes normally to muscle-attachment sites in PINCH-mutant embryos, which indicates that the PINCH loss-of-function phenotype is not caused by the mislocalization of ILK³⁵. The loss-offunction mutations in PINCH affect the LIM domains 3-5, therefore it is possible that the LIM domains 1 and 2 are still expressed, and are sufficient to retain correct ILK localization in this organism.

Cytoskeletal reorganization and changes in cellular shape that are required during dorsal closure are coordinated by the JNK signalling pathway (for a review see REF. 90). Therefore, the dorsal-closure defect in PINCHmutant flies might be explained, in part, by disrupted JNK signalling. PINCH might regulate JNK signalling through two distinct pathways. The first involves the interaction between PINCH and RSU1 (FIG. 3). Both PINCH and RSU1 genetically interact with Misshapen, a MAPK-kinase-kinase kinase (MAP4K) in the JNK signalling pathway, which demonstrates that both proteins can negatively regulate this pathway⁴⁵. The expression and/or stability of PINCH and RSU1 are mutually dependent on one another, so the relative contributions of PINCH and RSU1 in modulating JNK signalling have not been determined. The second and more-speculative mechanism involves a PINCH-Dreadlocks-Misshapen pathway. Dreadlocks, the D. melanogaster orthologue of NCK2, interacts with Misshapen⁹¹. Although mammalian PINCH1 binds to NCK2 in vitro⁵², an interaction between Dreadlocks and PINCH has not been reported. However, the affinity between mammalian NCK2 and PINCH1 is weak in vitro, and it is possible that it could not be detected.

The two main pathways that regulate survival and proliferation involve the phosphorylation of AKT/PKB and the stabilization and nuclear translocation of β-catenin as a consequence of GSK3β phosphorylation (FIG. 3). However, there is no evidence that ILK is involved in these pathways in D. melanogaster as ILK loss-of-function produces a different phenotype to loss of в-catenin or AKT/PKB^34,83,92,93. Furthermore, overexpression of ILK does not affect signalling through β-catenin⁸³.

Functions of IPP in mammalian systems

Биологические функции членов IPP комплекса были изучены на нескольких типах клеток. Большинство IPP функций может быть соотнесено с ролью IPP комплекса в фокальных адгезиях. Напр., регуляция адгезии распространения подоцитов²³, миграция эндотелиальных клеток и кардиомиоцитов^47,85, агрегация тромбоцитов^11,12, распространение и рост нейронов^77,94, и рекрутирование лейкоцитов⁹⁵ указывают на роль IPP комплекса в динамике актинового цитоскелета и активации интегринов.

Studies in mice. Потеря экспрессии β1 integrin^4,5, ILK⁷⁴, PINCH1 (REFS 48,63) или α-parvin (H. Chu and R.F., unpublished data) приводит к эмбриональной летальности. Однако. эти мутации обнаруживают незначительные различия в своих фенотипах, это указывает на то, что в основе этих фенотипов могут лежать самостоятельные дефекты. β1 Integrin^-/-, Ilk^-/- и Pinch1^-/- эмбрионы прекращают развитие на пери-имплантационных стадиях эмбрионального развития, но Pinch1^-/- эмбрионы погибают на эмбриональный день (E)6.5-E7.5, тогда как β1 integrin^-/- и Ilk^-/- эмбрионы погибают на E5.5-E6.5. α-Parvin^-/- развиваются далее, но погибают вследствие имплантации. Эти временные различия в эмбриональной гибели вряд ли обусловлены PINCH2 компенсацией, т.к. экспрессия PINCH2 не выявляется вплоть до поздних стадий развития¹⁹. С др. стороны, Pinch2^-/- мыши жизнеспособны, возможно в результате PINCH1 компенсации³¹. Важно бы установить, не является ли сравнительно более длительное выживание α-parvin^-/- эмбрионов результатом компенсации др. членов семейства parvin и чтобы исследовать, могут ли parvins выполнять критическую функцию или до, или во время пери-имплантационного развития.

Эмбриональная летальность Pinch1-нулевых мышей ассоциирует с повышенным апоптозом энтодермальных клеток, это указывает на то, что PINCH1 регулирует клеточную жизнеспособность⁶³. Это наблюдение было подтверждено данными по PINCH1-нокдауну в HeLa клетках²⁹. Однако, ещё необходимо установить, вовлекается ли AKT/PKB в PINCH1-опосредованный апоптический путь у эмбрионов и если так, то как в клетках HeLa существует AKT/PKB-независимый путь.

Условные нокауты членов IPP получены, чтобы преодолеть трудности. связанные с ранней эмбриональной летальностью. Мыши, несущие условные делеции β1 integrin или Ilk в хондроцитах, обнаруживают скелетные дефекты^75,96,97 и у них формируется chondrodysplasia. В культуре, β1 integrin- и Ilk-мутантные хондроциты обнаруживают нарушение распространения, аномальное распределение F-actin и нарушение адгезии, хотя Ilk-мутантные хондроциты имеют менее выраженный дефект адгезии. Следовательно, делеция любого белка нарушает соединение между ECM и актиновым цитоскелетом, что необходимо для распространения клеток. Кроме того, снижение пролиферации β1 integrin- или Ilk-дефицитных хондроцитов ассоциирует с дефектом перехода G1-S, но нарушения цитокинеза у β1 integrin^-/- хондроцитов выявляют дефект перехода G2-M.

Условные делеции Ilk в эндотелиальных клетках приводят к нарушению сосудистого развития и эмбриональной летальности⁹⁸. Активация интегринов снижается в отсутствие ILK, что указывает на дефекты миграции, а наблюдаемое увеличение апоптоза согласуется с пониженным фосфорилированием AKT/PKB по Ser473. Однако, апоптоз уменьшается, когда ILK вносится повторно, но не когда вносится постоянно активный AKT/PKB. Это указывает на то, что как и в клетках HeLa может оперировать ILK-зависимый, AKT/PKB-независимый путь в эндотелиальных клетках, чтобы регулировать апоптоз.

Иммортализованный Ilk^-/- макрофаги также обнаруживают пониженное фосфорилирование AKT/PKB по Ser473⁷⁶. Кроме того, ингибирование активности ILK или PI3K, экспрессия доминантно-негативной ILK и нокдаун ILK белка выявляет роль IPP комплекса в AKT/PKB- и GSK3β-обусловленной передаче сигналов в нейронах и лейкоцитах^{77,94,95,99,100}. Однако, фибробласты и хондроциты, которые происходят от Ilk^-/- мышей, не обнаруживают изменений фосфорилирования AKT/PKB^74,75,97. Эти расхождения могут отражать специфичные для типов клеток различия в потребности для ILK в использовании вышестоящих AKT/PKB и GSK3β.

Insights from studies using embryonic bodies. Т.к. мыши, которые лишены β1 integrin, ILK или PINCH1 погибают в раннем развитии, то эмбриоидные тельца использовали для идентификации специфических дефектов, которые приводят к пери-имплантационной гибели (BOX 2). β1 Integrin^-/- эмбриоидные тельца не способны откладывать базальную мембрану из-за дефекта в синтезе laminin^101,102. Напротив, Ilk^-/- (BOX 2, figure, part c) и Pinch1^-/-(BOX 2, figure, part d) эмбриоидные тельца продуцируют базальную мембрану, но обнаруживают дефекты в поляризации эпибласта и образовании полости; эти дефекты менее выражены в Pinch1^-/- эмбриоидных тельцах, что согласуется с их более длительной выживаемостью in vivo^63,74. Дефекты в поляризации эпибласта сопровождаются аномальной локализацией F-actin. Эти исследования предоставили доказательства того, что β1 интегрины выполняют иные функции по сравнению с ILK и PINCH1 на пери-имплантационной стадии и подчеркнули важную роль IPP комплексов в организации актинового цитоскелета. Показано также, что IPP комплексы могут регулировать актиновый цитоскелет косвенно посредством NCK2, которая соединяется с модуляторами актина WASP (Wiskott-Aldrich syndrome protein), PAK (p21-activated kinase) или DOCK180 (180-kDa protein downstream of CRK)¹⁰³. Кроме того, Pinch1^-/- эмбриоидные тельца обнаруживают аномальную межклеточную слипчивость и нарушение жизнеспособности энтодермы⁶³.

Снижение уровня белка ILK в Pinch1^-/- эмбриоидных тельцах, сходно с тем, что наблюдается в Pinch1-siRNA-обработанных клетках HeLa²⁹, это дает возможность объяснить фенотипическое сходство между Ilk^-/- и Pinch1^-/- эмбриоидными телами⁶³. Однако, дефекты, которые наблюдаются в Pinch1^-/- эмбриоидных тельцах, представляют ILK-независимые функции и указывают на то, что функциональная независимость между ILK и PINCH1 не полная. Это подтверждается наблюдением, что Ilk^-/- клетки всё ещё экспрессируют низкие уровни PINCH1 и vice versa³¹, показывая существование разных функциональных пулов этих белков: основной пул, в котором ILK и PINCH1 взаимно зависимы, и второй, небольшой пул, в котором эти белки функционируют независимо.

Недавние данные также подтвердили роль членов IPP в регуляции клеточной полярности и межклеточных контактов^63,74,104. Дефекты межклеточной слипчивости в Pinch1^-/- эмбриоидных тельцах ассоциированы с диффузным распределением E-cadherin и отсутствием слипчивых соединений⁶³. Однако. как PINCH1 регулирует межклеточную адгезию, изучено плохо. Локализация PINCH1 в межклеточных контактах не описана, но возможно, что PINCH1 регулирует межклеточную слипчивость косвенно. Хотя роль ILK в межклеточных контактах базируется на исследованиях кератиноцитов^65,66, но в Ilk^-/- эмбриоидных тельцах не выявлено дефектов межклеточной адгезии. Следовательно, PINCH1-обусловленная регуляция межклеточной слипчивости может быть независимой от ILK. В отличие от кератиноцитов⁶⁶ и клеток эпибласта, клетки трофэктодермы и первичной энтодермы эмбриоидных телец могут поляризоваться в отсутствие ILK74, это указывает на то, что разные эпителиальные клетки могут иметь разные потребности в ILK.

Conclusions

The IPP complex serves as an important transducer of extracellular signals to control many aspects of cell morphology and cell behaviour. Although there are many functions that are likely to be common among all cell types, certain functions seem to be cell-type specific. How does the IPP complex achieve specificity? The answer is not clear, but differential binding of ILK to PINCH and parvin isoforms is likely to be involved. Titration of binding sites by one isoform might lead to trans-dominant effects on other isoforms. Therefore, understanding how cells that express numerous isoforms of PINCH and parvin control the composition of the IPP complex to achieve spatial and temporal control over IPP function will be an important direction for future investigations.

In addition, the role of ILK as a kinase that is involved in the phosphorylation of AKT/PKB and GSK3β is still unclear. Immortalized cell lines or overexpressed ILK have been used in most of the studies, and few reports have examined the role of ILK in primary cells. Many of the effects of ILK-specific inhibitors or PI3K inhibitors that are observed in ILK-overexpressing cell lines do not manifest in cells that express basal levels of ILK. For example, cyclin-D1-promoter activity in epithelial cells is reduced in response to PI3K inhibitors only when ILK is overexpressed, which indicates that PI3K-mediated pathways are not involved in the basal control of cyclin-D1 expression105. On the other hand, cyclin-D1 expression in endothelial cells is upregulated in the presence of vascular endothelial growth factor (VEGF) in an ILK-dependent manner⁸⁵, and peroxisomeproliferator- activated receptor-β (PPARβ)-dependent upregulation of ILK expression in keratinocytes correlates with increased phosphorylation of AKT/PKB on Ser473 (REFS 106,107). Interestingly, ILK expression is upregulated in many human tumours^108–110, and in vivo models have revealed that ILK overexpression leads to the development of mammary tumours in mice111. Differentiating the functions of ILK under normal and pathological conditions will provide insights into how ILK contributes to disease, and under which conditions ILK can be exploited therapeutically.

More fundamentally, careful enzymatic analysis of the kinase activity of ILK and determining the substrate specificity will address whether ILK is a biologically relevant AKT/PKB HMK. Furthermore, the elucidation of the three-dimensional structure of ILK is critical to adequately address the functions of ILK as a kinase and as an adaptor molecule. A structure will provide insights into how a kinase activity can be achieved in the absence of conserved subdomains, and will identify potential mechanisms whereby ILK activity is regulated by PtdIns(3,4,5)P3 and ILKAP. Extending a structural analysis to PINCH and parvin isoforms will allow us to identify the differences in their structures that lead to their distinct biological functions.

ILK, PINCH and parvin: the tIPP of integrin signalling Kyle R. Legate, Eloi Montaсez, Oliver Kudlacek and Reinhard Fassler NATURE REVIEWS | MOLECULAR CELL BIOLOGY VOLUME 7 |No 12 | P. 20-31 | JANUARY 2006

ILK, PINCH and parvin: the tIPP of integrin signalling
Kyle R. Legate, Eloi Montaсez, Oliver Kudlacek and Reinhard Fassler
NATURE REVIEWS | MOLECULAR CELL BIOLOGY VOLUME 7 |No 12 | P. 20-31 | JANUARY 2006