Рис.1.  |  Morphological abnormalities in brains of GLAST–/–/GLT1–/– mutants.


Рис.2.  |  GLT1 and GLAST immunoreactivity in the mouse forebrain at E16.


Рис.3.  |  Reduced cell proliferation and abnormal neural migration in the GLAST–/–/GLT1–/– mutant neocortex.


Рис.4.  |  Altered radial glial systems and normal Reelin expression in GLAST–/–/GLT1–/– mutants.


Рис.5.  |  Loss of SP neurons and impaired cortical connections in GLAST–/–/GLT1–/– mutants.


Рис.6.  |  Impaired maturation of CP neurons in GLAST–/–/GLT1–/– mutants.


Рис.7.  |  Partial rescue of the GLAST–/–/GLT1–/– mutant brain phenotype by injection of glutamate receptor antagonists.

Data Supplement

Нейронная активность играет важную роль в установлении связей между нейронами в развивающемся мозге (1). Такая активность может влиять на другие, более ранние процессы во время развития мозга – пролиферацию, миграцию, дифференцировку и выживаемость (2, 3). Предполагали, что нейротрансмиттеры, высвобождаемые во время активности нейронов, играют важную роль в передаче сигналов при формировании ЦНС на ранних стадиях развития (3). Предварительные наблюдения подтвердили, что основной возбудительный нейротрансмиттер глутамат обеспечивает важные коммуникационные сигналы во время развития мозга. Было показано, что глутамат модулирует клеточную пролиферацию, радиальную миграцию, выживаемость нейронов, связанную с апоптозом, и дифференцировку нервных клеток (4-7). В отдельных работах было показано, что при блокировании глутаматергической активности (на уровне лиганда или рецептора) наблюдаются незначительные дефекты развития (8-14). Так, при in vivo экспериментах с использованием loss-of-function моделей оказалось, что раннее глутаматовое сигнализирование незначительно. Однако поскольку компенсаторный механизм, связанный с избыточностью механизма глутаматовых рецепторов, способен уменьшать тяжесть аномалий развития мозга у loss-of-function моделей, глутамат может играть важную роль на ранних стадиях развития мозга. Для изучения этого вопроса, авторы сконструировали животных, у которых глутаматовые рецепторы были сверхстимулированы генетической делецией глутаматового транспортера. Транспортеры глутамата важны для поддержания низких внеклеточных уровней глутамата (15). Такие глутаматовые транспортеры как GLAST, GLT1 и EAAC1 экспрессируются в мозге мышей во время эмбриогенеза (16). Предварительные исследования показали, что мыши с отсутствием всех трех транспортеров - GLAST, GLT1 или EAAC1 – характеризуются нормальным развитием мозга (17-19). Эти результаты могут свидетельствовать о том, что подтипы глутаматовых транспортеров могут функционально замещать друг друга во время развития ЦНС. В данной работе авторы инактивировали два члена из семейства глутаматовых транспортеров для выявления роли глутаматовой системы в развитии мозга.

Результаты

GLAST–/–/GLT1–/– Mutants Have Multiple Brain Defects. Нормальное развитие мозга наблюдали у мутантных мышей с отсутствием GLAST/EAAC1 или EAAC1/GLT1 (данные не представлены). Однако мыши с отсутствием GLAST/GLT1 погибают in utero примерно на 17-18 день внутриутробного развития (Е17-18) и демонстрируют аномально развитый мозг после Е15 (РИС. 1 и РИС 8,9 в supplement). Латеральный желудочек у GLAST–/–/GLT1–/– мышей был расширен по сравнению с контрольными животными, у них же наблюдали аномалии структуры на границе палия и субпаллия (pallial–subpallial) (РИС.1 A-D). На стадии Е16 неокортекс имел ламинарную структуру со следующими слоями: маргинальная зона, кортикальная пластинка (cortical plate - CP), субпластинка (subplate – SP), интермедиальная зона и вентрикулярная зона (ventricular zone - VZ) (РИС.1Е). У GLAST–/–/GLT1–/– мутантов CP граница с интермедиальной зоной была нечеткой, а SP не идентифицировалась (РИС.1F). Кроме того, число клеток в VZ оказалось сниженным в мозге этих мутантов (23,558.3 ± 111.6 cells per mm2 for WT(мышей дикого типа); 20,216.6 ± 119.7 cells per mm2 for the double mutant; n = 4; P < 0.0001; РИС.1E и F). У этих мутантов наблюдали также нарушения в организации гиппокмпа и обонятельных луковиц (РИС.8). В гиппокампе пирамидные нейроны были расположены менее плотно по сравнению с нормой, а в обонятельных луковицах мутантных мышей митральный клеточный слой полностью отсутствовал. Авторы далее сфокусировали внимание на изучении аномалий коры мозга у мутантных мышей GLAST–/–/GLT1–/-.

Expression of GLT1 and GLAST in the Embryonic Brain. GLAST относится к глутаматовым транспортерам астроцитов в мозге взрослого организма (20). Предварительные иммунохимические исследования показали, что GLT1 интенсивно экспрессируются преимущественно астроцитами во взрослом мозге (20). Однако недавно было показано, что GLT1 также экспрессируется нейронами гиппокампа (21). Поскольку эти два транспортера динамически меняют свою экспрессию во время развития ЦНС (16), авторы изучили клеточные элементы, экспрессирующие эти транспортеры в эмбриональной коре мозга мышей линии C57BL,применим метод иммуноокрашивания. На стадии Е16 GLT1 экспрессировался в globus pallidus, perirhinal (околоносовой) коре, латеральном гипоталамусе, гиппокампе и в fimbria, а также в аксонных путях, связывающих неокортекс, базальные ганглии и таламус (РИС.2 А и С). В коре мозга GLT1 иммунореактивность наблюдали в SP и вдоль волокон в интермедиальной зоне (РИС.2С, см. также РИС.10 А в Supplement). Для дальнейшего исследования клеточной локализации GLT1 в коре авторы выполнили двойное иммуноокрашивание GLT1 с GAP-43 (growth-associated protein 43) - нейрональным маркером. GLT1 иммунореактивность была дважды мечена GAP-43, подтверждая тем самым, что GLT1 экспрессируется в нейронах на стадии Е16 (РИС.10). В то же время GLAST белок экспрессировался в клетках радиальной глии в VZ конечного и промежуточного мозга на стадии Е16 (РИС.2 B и D). GLAST иммунореактивность также обнаруживалась в palisade волокон радиальной глии, образующихся в VZ вблизи латерального ганглионарного бугорка (lateral ganglionic eminence) – в pallium angle и у поверхности pia (РИС.2В).

Таким образом, авторам удалось выяснить, что GLT1 и GLAST во время развития локализуются на нейронах и клетках радиальной глии соответственно, свидетельствуя о том, что эти два глутаматовых транспортера могут играть кооперативную и комплементарную роли в развитии нервной системы (22). GLAST и GLT1, следовательно, являются основными глутаматовыми транспортерами в эмбриональном мозге, а нарушения развития мозга имеются только у GLAST/GLT1 двойных нокаутов, но не у одиночных нокаутов мышей GLAST или GLT1.

Cell Birth and Death in the GLAST–/–/GLT1–/– Cortex. Уменьшение числа клеток в VZ у мутантных мышей может быть вызвано снижением клеточной пролиферации или преждевременной гибелью клеток. Для оценки профиля пролиферации мутантных предшественников нейронов, эмбрионы были мечены BrdU импульсной меткой in utero . На стадии Е14 доля BrdU-позитивных клеток в VZ была сходной у мышей WT и мутантных животных (25.0 ± 1.7% у WT; 26.0 ± 2.3% у двойных мутантов; n = 6; РИС.3А и В). Однако на стадии Е16 доля BrdU-позитивных клеток в VZ была достоверно ниже у мутантов (18.3 ± 0.3% у WT; 16.2 ± 0.4% у двойных мутантов; n = 4; P < 0.01; РИС.3 С и D). Пролиферация клеток-предшественников также была изучена иммуногистохимически по proliferating cell nuclear antigen (PCNA) – маркеру пролиферирующих клеток. Паттерн PCNA иммуноокрашивания воспроизводил результаты с BrdU (РИС.3 Е и Н). Эти находки находятся в соответствии в результатами предыдущего in vitro исследования, показавшего, что аппликации глутамата снижали число эмбриональных кортикальных клеток, меченых BrdU (5). Чтобы выяснить, увеличена ли клеточная гибель в коре двойных мутантов авторы использовали TUNEL метод окрашивания апоптозных клеток. Апоптоз не был увеличен в коре мутантных животных на стадиях Е14 и Е16 (данные не показаны).

Результаты подтверждают, что и GLT1, и GLAST регулируют нейрогенез посредством контроля внеклеточной концентрации глутамата на стадии Е16.

Migration of CP Neurons Is Impaired in the GLAST–/–/GLT1–/– Cortex. Нарушенная ламинарная организация коры мутантов GLAST–/–/GLT1–/– свидетельствует о нарушениях клеточной миграции. Для исследования нейронной миграции in vivo авторы инъецировали беременным самкам на стадии Е12 или Е14 BrdU и изучили паттерн меченых клеток на Е16. мутантные «Е12» нейроны имели более широкий градиент распространения в сравнении с WT (РИС.3 I-L), а мутантные «Е14» нейроны не мигрировали в СР и оставались в VZ. (РИС.3 М-Р). Эти наблюдения свидетельствуют о нарушениях радиальной миграции у GLAST–/–/GLT1–/– мутантных мышей. Для корректной миграции нейронов необходимы как волокна радиальной глии, управляющие постмитотическими нейронами во время их миграции, так и нейроны Кахаля-Ретциуса (Cajal–Retzius neurons), секретирующие белок Reelin и играющие ключевую роль в радиальной миграции. Выстраивание и плотность волокон радиальной глии, окрашенных anti-nestin антителами, сравнивали у контрольных и опытных животных (РИС.4 А и В), но нарушения радиальных волокон были отмечены также и в коре «Е16» мутантов (РИС.4 С и D). SEM анализ показал, что на стадии Е16 волокна радиальной глии в стенке коры нарушены у GLAST–/–/GLT1–/– мутантов (РИС.4 Е и F). Более того, организация клеток радиальной глии имела грубые нарушения в VZ мутантных мышей (РИС.4 G и Н). Эти клетки утратили присущую им морфологию и приобрели округлую форму. Но число нейронов Кахаля-Ретциуса и их иммунореактивность по Reelin не были изменены у мутантных животных в коре (РИС.4 I и J).

Данные свидетельствуют о том, что нарушения системы волокон радиальной глии м.б. причиной аномальной радиальной миграции у мутантов GLAST–/–/GLT1–/– .

Lack of SP Neurons and Defective Cortical Connections in the GLAST–/–/GLT1–/– Mutants. У двойных мутантов SP трудно различима (РИС.1F).Т.к. SP нейроны крайне чувствительны к эксайтотоксической клеточной гибели (23), то вероятно, что GLAST–/–/GLT1–/– мутанты могут обнаруживать SP дефекты. Для исследования SP дефектов у двойных мутантов авторы изучили microtubule-associated protein 2 (MAP2)-positive SP нейроны и экспрессию специфических для SP маркеров – calretinin и chondroitin sulfate proteoglycans (CSPGs). У двойных мутантов никаких MAP2-positive SP нейронов не было выявлено на стадиях Е14 или Е16 (РИС.5 А-D). Более того, calretinin и CSPGs минимально выявлялись в SP на стадии Е16 (РИС.5 Е-Н). Эти результаты подтверждают отсутствие зрелых SP нейронов у двойных мутантов. SP нейроны участвуют в развитии кортикальных афферентных и эфферентных связей, включая corticothalamic (CT) и thalamocortical (TC) пути (23-26). Для исследования данных путей авторы использовали L1 иммуноокрашивание и 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine (DiI) tracing. В мозге WT мышей L1-positive пучки CT аксонов проходили через стриатум (РИС.5I). WT L1-positive TC аксоны проходили из промежуточного мозга во внутреннюю капсулу и далее входили в кору на стадии Е16 (РИС.5 I и К). У двойных мутантов L1-poisitive TC аксоны слабо иннервировали кору (РИС.5 J и L). DiI инъекции в кору мозга мышей на стадии E16 показали, что CT аксоны не покидают конечный мозг у GLAST–/–/GLT1–/– мутантов (РИС.5M и N). DiI инъекции в таламус на стадии E16 подтвердили, что TC аксоны не входят в GLAST–/–/GLT1–/– кору (РИС.5 O и P). SEM анализ GLAST–/–/GLT1–/– двойных мутантов обнаружил, что на стадии Е16 волокна радиальной глии на pallial–subpallial границе отсутствовали и что CT и TC аксоны могли не пересекать эту границу (РИС.5 Q и R). Мозолистое тело (corpus callosum) не пересекало среднюю линию, но формировало пучок Пробста (Probst bundle) (РИС.1В). У мутантных животных также отсутствовала передняя комиссура (РИС.1 D).

Результаты свидетельствуют о том, что ТС, СТ и проекции мозолистого тела имеют значительные дефекты у мутантов GLAST–/–/GLT1–/– .

Maturation of CP Neurons Is Impaired in the GLAST–/–/GLT1–/– Mutants. На стадии Е16 пирамидоподобные меченые клетки в СР после DiL инъекции в таламус наблюдали у WT мышей (РИС.6А). У мутантных животных наблюдали нарушения и морфологии и роста аксонов в меченых клетках в СР (РИС.6В). Для того чтобы выявить начало таких изменений, авторы исследовали кору мозга у мутантов на стадии Е14. Несмотря на то, что окраска гематоксилином не выявила аномалий морфологии СР нейронов у GLAST–/–/GLT1–/– мутантов (РИС.6 С и D), SEM анализ этих же мутантов показал, что на стадии Е14 радиальное распределение СР нейронов и их аксонов отсутствует. Эти клетки утратили свою пирамидную морфологию и приобрели округлую форму (РИС.6 Е и F). C другой стороны, на стадии Е14 ориентация и плотность клеток радиальной глии в VZ была сравнимой у мутантов и контрольных животных (РИС.6 G и H).

Результаты указывают, что созревание СР нейронов нарушено у мутантов GLAST–/–/GLT1–/– со стадии Е14, а аномальное созревание клеток радиальной глии в VZ становится заметным со стадии Е16 (РИС.4 G и H).

Partial Rescue of the GLAST–/–/GLT1–/– Brain Phenotypes by Glutamate Receptor Antagonists. Ранее авторами было установлено, что базальные уровни внеклеточного глутамата в гиппокампе GLT1 мутантных мышей были значительно выше в сравнении с мышами дикого типа (WT) (27). Следовательно, можно ожидать, что генетическая делеция GLT1 и GLAST ведет к увеличению уровней внеклеточного глутамата, что, в свою очередь, приводит к нарушениям развития коры из-за избыточной активации глутаматовых рецепторов. Для проверки данной гипотезы авторы впервые изучили экспрессию глутаматовых рецепторов в коре мутантов GLAST–/–/GLT1–/–. Экспрессия рецепторов GluR1, GluR2 и GluR4 и NMDA рецептора 1 оказалась сравнимой с таковой у контрольных животных (РИС.7А). Тогда авторы попытались изучить, может ли фенотип мозга мутантных животных реверсировать при фармакологическом введении антагонистов глутаматовых рецепторов. Инъекции α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid (AMPA) receptor antagonist 2,3-dihydroxy-6-nitro-7-sulfamoylbenzo[f]quinoxaline (NBQX) и NMDA receptor antagonist CGS-19755 беременных самкам мышей между стадиями Е8 и Е16 привели к частичному «спасению» аномальной стратификации коры мозга у мутантных животных (РИС.7 B–D) и их гиппокампа (РИС.7 E и G). У GLAST–/–/GLT1–/– мутантов, обработанных антагонистами глутаматовых рецепторов, в коре наблюдали некоторое восстановление ламинарной структуры, хотя в целом она оставалась менее организованной, чем у контрольных животных (РИС.7 B–D). Гиппокамп мутантных мышей характеризовался неплотной упаковкой пирамидных нейронов (РИС.7А). Те же мутантные мыши, обработанные антагонистами глутматовых рецепторов, имели гиппокамп почти неотличимый по своей морфологии от контрольных животных (РИС.7Е и G). Избыточная активация NMDA рецепторов в мозге GLAST–/–/GLT1–/– мутантов была подтверждена исследованиями уровней экспрессии NMDA receptor-regulated gene 1 (NARG1). Предварительные исследования показали, что NARG1 даунрегулируется NMDA рецепторной активацией (28). Авторы обнаружили, что NARG1 mRNA экспрессия даунрегулирована в мозге GLAST–/–/GLT1–/– мутантов при in situ гибридизации (РИС. H и I) и real-time quantitative PCR (Fig. 11 в Supplement). Инъекция NMDA рецепторного антагониста CGS-19755 (одного) могла не восстанавливать GLAST–/–/GLT1–/– фенотип мозга. Более того, и AMPA рецепторный антагонист, и NMDA рецепторный антагонист только частично сохраняли нормальную структуру коры мутантных мышей, подтверждая тем самым, что дополнительная избыточная активация AMPA и NMDA рецепторов, сверхактивация других глутаматовых рецепторов, включая metabotropic глутаматовые рецепторы, может способствовать появлению множественных тяжелых дефектов у GLAST–/–/GLT1–/– мутантов.

Oxidative Glutamate Toxicity Does Not Contribute to the Cortical Malformation of GLAST–/–/GLT1–/– Mice. Избыточность внеклеточного глутамата ведет к повреждениям клеток и это обусловлено как механизмами, связанными с глутаматовыми рецепторами, так и с механизмами, независимыми от глутаматовых рецепторов (29). Независимая от глутаматовых рецепторов токсичность вызвана оксидативной глутаматовой токсичностью. При такой токсичности высокие уровни глутамата блокируют cystine/glutamate обменную систему Xc–, приводя к истощению glutathion и клеточным нарушениям (30). Для выявления того, вовлечена ли оксидативная глутаматовая токсичность в нарушения структуры коры мутантных мышей, авторы измерили общий уровень кортикального глутатиона. Он оказался слегка повышенным в коре GLAST–/–/GLT1–/– мышей на Е16 по сравнению с контрольными животными (РИС.12 в Supplement), свидетельствуя о том, что оксидативная глутоматовая токсичность не играет важной роли в нарушениях морфологии коры у мышей GLAST–/–/GLT1–/–.

Discussion

A large body of in vitro evidence indicates that the neurotransmitter glutamate acts to influence earlier developmental events, such as proliferation, migration, and differentiation (4-7). However, nearly all of the genetic experiments to date, in which glutamatergic signaling was blocked, have shown little, if any, developmental defects (8-14). Our work represents a unique analysis of the direct consequences on brain development of extracellular glutamate buildup due to the depletion of glutamate transporters. In contrast to loss-of-function studies, in vivo excess activation of glutamate receptors can modulate brain maturation, such as stem cell proliferation, radial migration, survival of SP neurons, and neuronal differentiation, including neurite elongation and path finding. This discrepancy may be due to compensation by other neurotransmitters such as GABA, acetylcholine (Ach), and glycine, all of which can depolarize embryonic cortical neurons as does glutamate (31). GABA is also one of the most abundant neurotransmitters detected during mammalian brain development, and its involvement in shaping brain development has also been suggested by recent in vitro investigations (5, 32,33). However, mice lacking the two primary GABA biosynthetic enzymes, GAD65 and GAD67, show no discernible defects of neural development despite having only 0.02% of the normal GABA content (34). This discrepancy might also be due to compensation by other neurotransmitters in vivo. Glutamate, GABA, Ach, and glycine can all depolarize embryonic cortical neurons, so pathways involving more than one of these transmitters could potentially show mitigated severity of defects in single-neurotransmitter loss-of-function mutations. In the future, it will be important to analyze the direct consequences of overactivation of individual neurotransmitter receptors. Such studies could reveal functional roles of early appearing transmitter signaling during development.

The prevailing view of CNS development is that neural activity is, for the most part, important only in the refinement of axonal projections and synaptic connections, whereas early development of the nervous system is likely to be genetically programmed. Two recent studies have challenged this view by providing evidence that neural activity is required for spinal motor neurons to make accurate early path-finding decisions (35) and for embryonic spinal cord neurons to determine which types of neurotransmitters to produce (36). Combined with these studies, the present study suggests that neural activity is likely to be important in shaping early brain development and that glutamate, as a key mediator of neural activity, may play an important role in shaping the early CNS development. For these influences to be physiologically relevant, however, glutamate must be released at an early developmental stage and diffuse to stimulate glutamate receptors. Several observations support this hypothesis: (i) functional glutamate receptors are expressed by neuronal precursors and neurons of several brain areas at a very early stage (3, 37), (ii) exocytosis of glutamate occurs from growing axons and cones before synapse formation (38), (iii) paracrine nonvesicular release of glutamate exists before synapse formation and modulates neuronal migration (39, 40), and (iv) an efficient glutamate transport system is operative at early developmental stages (39). Depending on the neural activity and the location and properties of glutamate receptors and transporters, it is possible that excess activation of glutamate receptors can occur and modulate brain development. Therefore, normal brain development requires tight control of extracellular glutamate by the glutamate transporters GLAST and GLT1. This hypothesis was also confirmed by the severe developmental defects that were observed in the regions of the brain where both GLAST and GLT1 are expressed, such as the inner half of the cortex, the pallium–subpallium boundary, and the SP neurons (Fig. 13, which is published as suppoting on the PNAS web site). GLAST–/–/GLT1–/– double mutants have enabled us to clarify how glutamatergic signaling regulates the molecular pathways that control brain development.

Previous in vitro studies demonstrated that glutamate is involved in modulating the radial migration of cortical projection neurons. Blockade of NMDA receptors decreases cell migration, whereas enhancement of NMDA receptor activity or inhibition of extracellular glutamate uptake increases the rate of cell movement (4, 7). Interestingly, radial migration is impaired in GLAST–/–/GLT1–/– double mutants, in which excess activation of the NMDA receptor may occur. This impairment could be attributed to the fact that excess activation of glutamate receptors in GLAST–/–/GLT1–/– double mutants leads to disruption of the radial glial fiber system. Recent studies have indicated that glutamate released from corticofugal axons could lead to NMDA and AMPA/kainate receptor activation in tangentially migrating cells and thereby modulate their response to guidance cues (41, 42). Furthermore, GLT1 is expressed in corticofugal axons. Future experiments investigating the tangential migration of interneurons in GLAST–/–/GLT1–/– double mutants may clarify the functional significance of glutamate for tangential migration as well as radial migration.

It has been shown that SP cells are necessary for the development of many efferent and afferent cortical connections (23-26). We found that SP neurons were deficient in the neocortex of GLAST–/–/GLT1–/– mutants from E14 onward. Consistent with the defect in SP neurons, TC and CT projections were lacking in mutant mice.

Abnormal development of the brain during fetal life is now thought to contribute to the etiology of many neurological disorders that manifest throughout life (43). Cerebral hypoxia-ischemia is considered to be a major cause of perinatal brain injury. A dysfunction of glutamate transporters and the resulting excess glutamate are important pathophysiological mechanisms in brain injury after hypoxia-ischemia. Therefore, GLAST–/–/GLT1–/– mutants may be useful for characterizing lesions formed in response to hypoxia-ischemia and for developing neuroprotective strategies to reduce the burden of altered brain growth and poor functional and behavioral outcomes (44).