Пролиферирующие клетки удваивают свою ядерную ДНК перед каждым делением во время S фазы клеточного цикла. Несмотря на крупные размеры геномов метазоа, репликация осуществляется в течение часов благодаря тому факту, что геном подразделен на тысячи индивидуальных репликативных единиц или репликонов, с 10-15% одновременно активных в любой данный промежуток времни во время S фазы¹¹. Важно, что каждая последовательность ДНК реплицируется только однажды на клеточный цикл. Следовательно, репликация строго контролируется¹². Пульсовое мечение и прямая визуализация вновь синтезированных ДНК выявили, что синтез ДНК происходит в специфических специализированных репликативных сайтах или репликативных факториях, каждая из которых совместно оккупируется несколькими активными репликонами^13-15. В течение всей S фазы эти фактории собираются драматически (Рис.1). Репликоны, которые располагаются в их непосредственной близости временно рекрутируются в синтетический суб-компартмент и в конечном итоге вновь синтезированные ДНК отправляются обратно в области, богатые хроматином, прочь от места своей репликации^15,16. Исследования на живых клетках подтвердили, что отсутствуют широкомасштабные перемещения хроматина в S фазе, скорее хроматиновые домены подвергаются локальным перестройкам¹⁷

Пол завершению репликации внутри локального репликона, синтезирующие сайты разбираются и новые фактории формируются в непосредственной близости в трехмерном пространстве^14,17,18. Этот паттерн клонально наследуется так, что последовательности, которые реплицируются синхронно в одной S фазе будут реплицироваться синхронно в следующей^13,14,17. Домены хроматина, которые реплицируются совместно остаются ассоциированными в течение всего клеточного цикла, это позволяет предположить, что они представляют собой стабильные хромосомные единицы¹⁴. Хотя точные молекулярные силы, которые составляют эти структурные единицы в основном неизвестны, можно предположить вовлечение взаимодействий между доменами хроматина и подлежащими ядерными структурами, такими как NUCLEAR LAMINA, NUCLEOLUS and NUCLEAR MATRIX^19-21.

Репликация ДНК контролируется также и во времени. Недавние исследования по всему геному у Drosophila melanogaster и людей выявили корреляцию между временем ранней репликации и увеличением вероятности экспрессии гена^4,5,22. Соответствие между активными областями и ранней репликацией и неактивными областями и поздней репликацией не является абсолютным. Имеются исключения в каждом случае, но в целом GC-богатые, плотно насыщенные генами области имеют тенденцию реплицироваться раньше, тогда как AT-богатые области, которые обычно бедны генами и имеют высокое содержание LONG INTERSPERSED NUCLEAR ELEMENT (LINE) реплицируются позже. В одном случае, в котором время репликации ограничено рядом специфических генов, характерных для разных типов клеток, временной паттерн репликации довольно сходен между одним типом клеток и следующим. Большинство генов не меняют времени своей репликации несмотря на имеющиеся изменения в экспрессии²³. Недавние широко масштабные исследования на D. melanogaster обнаружили неожиданное сходство во временных параметрах репликации поздно реплицирующихся последовательностей у двух неродственных типов клеток²⁴. Однако, недавние оценки временных параметров репликации 54 генов, экспрессируемых на разных стадиях во время дифференцировки эмбриональных стволовых клеток в нейральные предшественники, показали, что временные параметры репликации могут меняться в зависимости от изменений экспрессии²⁵, хотя подобные временные изменения, по-видимому, ограничены генами в AT-богатых областях. Гены в GC-богатых областях не меняют временных параметров своей репликации во время дифференцировки, несмотря на изменения в генной экспрессии. Эти результаты показывают, что геномный контекст и организация важны в предопределении времени репликации скорее, чем индивидуальное состояние генной активности (Box 2).

Хотя содержание GC, плотность генов, положение в ядре и транскрипционная активность все строго ко-коррелируют с временными параметрами репликации, причина этих взаимоотношений всё ещё предмет дискуссий и исследований. Основное внимание сконцентрировано на возможности, что временные параметры дифференциальной репликации д. специфицировать судьбы альтернативных сборок хроматина и тем самым играть роль в контроле генной экспрессии. Напр., рано реплицирующиеся последовательности д. использовать путь сборки хроматина, дающего в результате структуру, которая делает возможной экспрессию генов, тогда как поздно реплицирующиеся последовательности д. использовать кухню, которая д. давать в результате репрессивную или гетерохроматиновую сборку. Имеются доказательства, что репрессивные гистон-модифицирующие активности и хроматин-ремоделирующие комплексы связаны с сайтами поздней репликации^26-29, это подтверждает возможную модель, объясняющую поддержание состояния репрессивного хроматина. Комплементарные доказательства для рано реплицирующихся сайтов в основном отсутствуют.

Fisher and Mechali установили, что индукция ретиноевой кислотой экспрессии HoxB (гомеобоксного кластера В) в P19 клетках происходит во время и необходима для осуществления S фазы³⁰. Это привело к предположению, что S фаза или репликация ДНК могут обеспечивать окно благоприятных возможностей для изменения паттернов генной экспрессиии. Однако из-за того, что HoxB кластер реплицируется рано в стимулированных и не стимулированных клетках P19, то нечто иное, чем ранняя репликация также необходимо для индукции.

Временные параметры репликации возможно предопределяются с помощью эпигенетической информации и структуры хроматина скорее, чем с помощью экспрессии индивидуальных генов per se. Это согласуется со многими наблюдаемыми корреляциями между временем репликации, геномным контекстом и генной активностью^3,22,31,32. Интересно, что программа времени репликации в клетках млекопитающих устанавливается рано в G1 фазе, конкурентно с пост-митотическим ре-позиционированием хроматиновых доменов, это указывает на тесную связь между расположением ядра и временными параметрами репликации³³. Это происходит до и независимо от спецификации REPLICATION ORIGINS^33-36. Мало вероятно, что каждый ген имеет свой собственный источник репликации - гены в областях с плотным расположением генов ко-реплицируются вместе со своими соседями независимо от своего индивидуального состояния экспрессии.

Ткане-специфические α-globin и β-globin кластеры человека представляют собой два противоположных примера расхождения между временем репликации и генной экспрессией. Гены α-globin включены в состав большого кластера из широко экспрессирующихся генов на хромосоме 16. Они находятся в чувствительной к нуклеаза конформации и реплицируются рано во всех типах клеток^37-39, хотя экспрессируются они только в эритроидных клетках. С др. стороны, β-globin гены на хромосоме 11 включены в состав большого кластера из генов обонятельных рецепторов, которые экспрессируются только в носовом эпителии. β-локус находится в закрытой хроматиновой конформации и реплицируется поздно почти во всех типах клеток за исключением эритроидных, в которых он реплицируется рано в связи с открытием хроматина⁴⁰. Соседние гены на флангах кластера генов обонятельных рецепторов также переключаются на раннюю репликацию в эритроидных клетках, даже если они не экспрессируются⁴¹. Очевидно, что ранняя репликация сама по себе не специфицирует экспрессию генов, но репликация всё ещё может играть роль в изменении состояния генной экспрессии за счёт временных изменений хроматина.

Недавние исследования показали, что транскрипция также является высоко повреждающей для хроматина. Старая идея, что хроматин является репрессивным для транскрипции, возникла в результате исследований in vitro очищенных компонентов, показавших, что голая ДНК транскрибируется намного эффективнее, чем нуклеосомные матрицы⁴². In vivo транскрипция происходит исключительно на хроматиновых матрицах. Сравнительно недавно идентифицированы и охарактеризованы различные компоненты и комплексы, которые способствуют прохождению транскрипционной кухни ⁴³. Известно, что транскрипция разрушает (disrupts) хроматин в результате частичной разборки подлежащих нуклеосом, которая сопровождается быстрой повторной сборкой в разбуженной транскрипционной кухне (machinery)^44,45.

Сходно с репликацией ДНК временная разборка хроматина во время транскрипции может представлять благоприятную возможность для изменения. Polycomb response elements, которые связывают репрессивные POLYCOMB GROUP (PcG) комплексы, обеспечивают наследование состяний молчащего хроматина. Однако, транскрипция в Polycomb response element дает в результате перестройку этой эпигенетической памяти и способствует образованию структур активного хроматина^46-51. Более того, недавние исследования показали, что транскрипция запускает обмен гистонов и отложение варианта H3.3 гистона в транскрибируемых областях^50,52,53. H3.3 сильно обогащен в модификациях, которые ассоциируют с активных хроматином⁵⁴, это согласуется с его ролью в запуске и поддержании активного эпигенетического состояния.

Принято рассматривать транскрипцию как эксклюзивную для генов, но сегодня это не очевидно, т.к. транскрибируемые последовательности в геноме высших эукариот располагаются и вре областей, которые распознаются как гены⁶ (Box 3).

Было предположено, что эти non-coding RNA (ncRNA) транскрипты являются результатом 'leaky' транскрипции. Однако, широко масштабные исследования получили доказательства тщательной её регуляции^55,56. Можно высказать несколько предположений о функции этих транскриптов, включая и предположение, что они участвуют в регуляции экспрессии специфических генов^57,58. Недавние доказательства четко показали, что процесс транскрипции сам по себе может выполнять регуляторную роль^50,51,59-61 путем изменения конформации хроматина или ассоциации регуляторных факторов с нижестоящими регуляторными элементами. Тот факт, что большинство ядерных транскриптов никогда не проникает в цитоплазму⁶ указывает на возможность того, что, в некоторых случаях, ncRNAs, которые продуцируются, могут быть случайным образом преобразованными побочными продуктами. Для некоторых локусов эти т.наз. межгенные транскрипты, по-видимому, соответствуют доменам модифицированного хроматина, который окружает активные гены и их удаленные регуляторные элементы⁷. Межгенные транскрипты могут быть смысловыми и антисмысловыми⁶⁶, а последовательности, которые кодируют их, часто перекрываются с соседними генами мишенями^68-71; их экспрессия предшествует или ко-регулируется с таковой соседних генов. Детальная характеристика некоторых локусов выяви ла экстенсивную межгенную транскрипцию, а список локусов, для которых это наблюдается, быстро растет, хотя точная роль межгенных транскриптов всё ещё неясна. Растущий репертуар ремоделирования хроматина и гистон-модифициарующих факторов, которые ассоциированы с удлиняющей формой RNA polymerase II (PolII), указыват на роль в поддержании доменов модифицированного хроматина, а растущие доказательства подтверждают это^43,72-76.

Транскрипция высоко компартментализована в ядрах млекопитающих^77-81. Классическим примером является сегрегация комплексов RNA polymerase I в ядрышки, где транскрибируются rRNA гены. Сходным образом, текущая транскрипция, осуществляемая с помощью PolII, распределена негомогенно по нуклеоплазме, а появляется в фокусах, сильно обогащенных PolII, известных как фактории транскрипции, которые содержат большую часть гиперфосфорилированной удлиненной формы PolII (Refs 82-84) (Рис. 2). Имеется меньше факторий транскрипции, чем активных генов и др. транскрипционных единиц в ядре, это ведет к предположению, что больше одного активного гена транскрибируется в каждой фактории^78,82. Недавние исследования показали, что активно транскрибируемые гены, которые разделены более, чем 40 Mb хромосомных последовательностей часто ко-локализуются в одной и той же транскрипционной фактории⁸⁵. Интересно, что RNA fluorescence in situ hybridization (FISH) анализ некоторых генов на уровне одиночного гена показал, что большинство 'активных' генов транскрибируются не непрерывно, в виде транскрипционных циклов, проводя большую часть времени в выключенном состоянии, чем во включенном⁸⁵. Это подтверждает более ранние исследования^86-88 и указывает на то, что родственные типы клеток могут экспрессировать идентичные наборы генов на уровне мРНК, и две клетки будут иметь идентичные наборы активно транскрибируемых генов в каждый данный момент времени. So turning on a gene seems to be unlike a switch that gets turned on and stays on until switched off. Транскрипция генов происходит пульсами с определенной частотой, это может служить для регуляции, частично, на уровне экспрессии определенных генов в популяции клеток. Модуляция экспрессии может осуществляться путем изменения частоты или продолжительности 'on time' относительно 'off time'.

Osborne et al.⁸⁵ показали, что активно транскрибируемые гены ко-локализуются в транскрипционных факториях, тогда как идентичные, временно не транскрибируемые аллели, которые часто может быть в той же самой клетке, нет. Следовательно, включенное состояние коррелирует с оккупацией факторий и выключенное состояние с перемещением прочь из факторий. Это указывает на то, что динамика ассоциаций с факториями базируется на бинарных осцилляциях в транскрипционной активности генов , следовательно, открывается возможность регуляции генов путем контроля мобильности хроматина⁸⁹. Специфическое ядерное перемещение генов коррелирует с временными параметрами транскрипционной активации, молчания и репликации^90-92. Два недавних исследования пролили свет на степень и точность ядерного перемещения активных генов^93,94. Chambeyron and Bickmore сравнивали позиции двух тесно сцепленных гомеобоксных (Hox) генов - одного активного и др. неактивного - относительно из хромосомных территорий⁹³. Они наболюдали ре-позиционирование активного гена до 1μm от неактивного гена и их хромосомной территории, указывая тем самым, что деконденсация хроматина и повышенная мобильность появляются с экспрессией. Во втором исследовании Zink et al.⁹⁴, изучали ядерную организацию регуляторного гена cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) в связи с фланкирующими генами. Они показали, что CFTR занимает наиболее внутреннее положение, когда экспрессируется, хотя неактивные фланкирующие гены остаются прикрепленными к гетерохроматину на периферии ядра. Их эксперименты показали, что положение в ядре контролируется на уровне индивидуальных генвов и зависит от транскрипционной активности.

Связь между структурами хроматина высшего порядка и транскрипцией недавно прояснилась. Мышиные гены гемоглобинового β-цепочного комплекса (Hbb) и их дистальные регуляторные элементы - locus control region (LCR), расположенная более чем на50 kb от - задействованы в специфических высшего порядка 'loop' структурах во время транскрипции^95,96. Петлевые структуры были также обнаружены в импринтированных^97,98 и цитокиновых⁹⁹ кластерах и между элементами границ хроматина¹⁰⁰. Очевидно, что только один из девяти дистальных регуляторных элементов, которые видны в кластере вокруг активного гена Hbb, известен как 'classical' энхансер. Остальные элементы последовательности обладают insulator-подобными свойствами¹⁰¹, межгенной промоторной активностью^102-104 или имеют неизвестные функции. Они сливаются в нечто, что называется активным хроматиновым центром (hub) ^105,106 (Рис. 3). Хотя дально-действующие петли без сомнения образуются, некоторые вопросы всё-таки остаются. Напр., какова специфичность контролируемого контакта между очевидно разнородными регуляторными элементами и предназначенными для них генами мишенями, которые могут быть отделены на расстояние megabase или более^107-109? Коэффициенты диффузии, подсчитанные для хроматина находятся в пределах, которые делают возможными дально-действующие взаимодействия⁸⁹, такие как ассоциации между генами и регуляторными элементами. В теории две области, расположенные внутри 1 μm др. от др., д. иметь высокую вероятность контакта в течение секунд, но эти подсчеты не принимают во внимание тот факт, что могут быть сотни др. подходящих генов по соседству. Имеются ли механизмы за пределами простой диффузии, которые могут способствовать специфической сборке дистальных элементов на больших расстояниях? Наконец, организованы ли кластеры регуляторных элементов достаточно, чтобы создавать транскрипционные сайты, или позволяют ли эти комплексы вступать в или стабилизировать ассоциации с уже собранными факториями.

Тот факт, что разные гены часто совместно оккупируют одну и ту же факторию, строго указывает на то, что гены не не собирают свои собственные сайты транскрипции de novo, когда они становятся активными, а вместо этого мигрируют в уже собранные сайты транскрипции⁸⁵. Имеющиеся данные показывают, что транскрипционные фактории являются метастабильными ассоциациями, которые могут собираться на подлежащем каркасе или ядерном матриксе^110-112. Стабильные фактории указывают на то, что гены или транскрипционные единицы д. в основном выкарабкиваться посредством факторий¹¹³ скорее, чем полимераз, перемещающихся вдоль хроматиновых волокон, как это принято думать (Рис. 4). Было показано, что РНК полимераза прокариот являются мощным моторным белком, который может генерировать силы, которые намного превосходят др. известные ATPases^114,115. Тянущие силы возникают в результате эффективной конверсии свободной энергии, продуцируемой как результат гидролиза нуклеотидов, во время удлиннения межгенных транскриптов, которая м. служить для притяжения дистальных регуляторных элементов и их генов мишеней в общие фактории, облегчая тем самым образование дально-действующих cis взаимодействий скорее, чем trans ассоциации¹¹⁶. В этой модели большие расстояния между дально-действующими энхансерами и их генами мишенями не являются непреодолимой проблемой. Даже 50 kb кажутся неразумно большими расстояниями для дально-действующего энхансера, чтобы создавать комплекс со своим геном мишенью в результате специфического регуляторного взаимодействия^95,96. Сегодня такие взаимодействия д. рассматриваться как взаимодействия в средних пределах, т.к. имеются доказательства ассоциаций на расстояние в несколько megabases^85,117. Как только образуется петля, то комплекс энхансер-ген может помочь стабилизировать продуктивную ассоциацию с факторией, обеспечивая в результате улучшение генной транскрипции (re-initiation) или более эффективную элонгацию¹¹⁸, или обе (Рис. 5). Находка, что приблизительно 15% генома транскрибируется⁶ - хотя возможно не все одновременно - указывает на то, что чрезвычайно большая доля генома происходит через относительно ограниченное количество транскрипционных факторий в клеточном ядре⁸⁵. Это д. оказывать выраженное влияние на ядерную организацию генома.

Последовательности ДНК, которые используются в качестве матрицы для репликации временно дезинтегрируются с помощью RNA polymerases и приостанавливают транскрипцию¹¹⁹, хотя глобальная ядерная транскрипция не прерывается в течение всей S фазы. Для этого необходима точная координация между транскрипцией и репликацией на уровне индивидуальных последовательностей, особенно во время ранней S фазы, когда большинство активных генов реплицируется. Как это осуществляется? Возможно последовательности, которые участвуют в транскрипции и которые д.б. реплицированы, д. в первую очередь быть отозваны из транскрипционной фактории и помещены в соседнюю репликационную факторию. Имеются доказательства незначительного или отсутствия перекрывания между репликационными и транскрипционными сайтами^120-122. Как только репликация заканчивается, очевидно возникает нужда в эпигенетических модификациях, чтобы восстановить дочерние нити. Осуществляется ли это в сайте репликации? Или потенциально активные области д. отправляться назад в транскрипционные фактории с помощью межгенной транскрипции? Интересно, что в некоторых случаях β-globin генов, пульсовая межгенная транскрипция происходит сразу после репликации в ранней S фазе⁶³.

Какова же связь между транскрипцией и ранней репликацией? Мы полагаем, что сайты ранней репликации, которые присутствуют в начале S фазы, формируются в наиболее доступных источниках репликации. Это д.б. источники репликации, которые находятся вблизи активных генов, которые собраны в кластеры вокруг транскрипционных сайтов в ядре. Рассыпаны между этими активными генами д.б. некоторые тесно сцепленные неактивные гены, которые д. реплицироваться рано как наблюдатели. Реплицируются ли эти гены рано в соседних активных доменах или используют локальные источники. которые становятся активными благодаря повышенной локальной концентрации репликационной кухни (machinery) в фактории предстоит еще определить. Структура хроматинового домена не всегда уважает границы доменов генной экспрессии, т.к. неактивные гены могут быть деконденсированы как результат открытия хроматина соседних генов¹⁰⁹. Это может объяснить как связь между активными генами и ранней репликацией так и характерным ядерным распределением репликационной вилки в любое данное время в S фазе, что в основном отражает компартментализацию активного и неактивного хроматина в ядре.

Транскрипция и репликация не единственное, что происходит в геноме. Они предоставляют благоприятные возможности для изменения программ генной экспрессии; вставки вариантов гистонов или модификации существующих; поощрения структур высшего порядка; и организации генома в активные зоны в ядре. Какое влияние это может оказывать на расположение генов в подлежащих последовательностях ДНК?

Эта функциональная ядерная организация, как ожидается, д. оказывать селективное давление на организацию генов и регуляторных элементов на уровне первичных последовательностей. В отличие от белок-кодирующих областей, где селекция действует на уровне кодонов, давление на организацию генома, по-видимому, осуществляется на уровен хроматина высшего порядка и хромосомных структур, а также функциональной организации ядра. Образование кластеров генов вокруг функциональных сайтов в ядре может быть селективным давлением, которое ответственно за наблюдаемое образование кластеров высоко экспрессируемых генов в геноме. Каждый потенциированный ген в локальном кластере высоко экспрессируемых генов д. иметь более значительные шансы динамически взаимодействовать с транскрипционной факторией, благодаря тому факту, что вся область может оставаться привязанной к фактории посредством вовлечения одного или более локальных транскрипционных единиц в само-организацию¹²³ транскрипционных 'frenzy'. Напротив, открытие, что слабо экспрессируемые гены и гены, которые участвуют в контроле развития и дифференцировки, стремятся располагаться в регионах генома, относительно бедных генами, может отражать их нужду в тонко контролируе5мой экспрессии. Такие гены д. находиться подальше от транскрипционных сумятиц (hubbubs), это д. давать в результате несоответственно высокие уровни экспрессии. Эти типы генов, как может ожидать, обладают независимым контролем своего хроматинового окружения и можно, следовательно, ожидать изменений времени их репликации в ассоциации с экспрессией ¹²⁴.

The links between structure and function in the nuclear landscape of the genome grow ever stronger. For example, histones, which were once considered to be mere structural units of chromatin, are now generally recognized as principal reservoirs of epigenetic information that affect function^53,125. At the same time, replication and transcription, which are traditionally associated with function, seem to be able to affect structure from the level of the individual nucleosome to specific higher-order structures and the overall three-dimensional landscape of the nucleus. Understanding the interdependent ecosystems of this landscape will undoubtedly provide clues to how the genome evolved, and should ultimately allow us to decode it.