Park et al. и Ilagan et al. изучали роль секретируемого сигнального белка fibroblast growth factor 8 (FGF8) во время развития сердца у эмбрионов мыши и получили важную информацию о молекулярных механизмах, который контролируют кардиогенез.
Мыши, несущие гипоморфные аллели Fgf8, как известно, обладают кардиальными дефектами, хотя лежащие в основе механизмы неясны. Сердце возникает из двух популяций клеток: primary heart field (PHF) дает левый желудочек, в то время как anterior heart field (AHF) вносит вклад в правый желудочек и тракт оттока. Используя репортерные трансгены, Park et al. и Ilagan et al. обнаружили экспрессию Fgf8 в AHF; Park с сотрудниками также сообщили о низкой экспрессии Fgf8 в субнаборе PHF клеток.
Используя Cre-обусловленную рекомбинацию две группы затем изучали фенотипы, вызываемые делецией Fgf8 в субнаборах кардиальных клеток предшественников. Хотя они наблюдали слегка различные результаты, что может быть объяснено разными экспреиментальными подходами и Cre драйверами, которые были использованы, обе группы пришли к сходному заключению: Fgf8 делеция в AHF ведет к тяжелым укорочениям правого желудочка и тракта оттока.
Дальнейший трнсгенный анализ и экспреименты по иммуноокрашиванию показали, что аутокринная передача сигналов FGF8 необходима в AHF джля обеспечения пролиферации и жизнеспособности клеток. Ilagan et al. показали, что Ets транскрипционный фактор Pea3, известная мишень для FGF8, подавляется в отсутствие FGF8, возможно из-за редукции передачи сигналов MAPK. Park et al. показали, что потеря FGF8 приводит к снижению экспрессии FGF8 гена мишени Erm и идентифицировали транскрипционные факторы Isl1 и Mef2c как возможные эффекторы передачи сигналов FGF8 в AHF. Следовательно,
возможно, что FGF8 способствует кардиогенезу путем активации транскрипционных сетей, которые необходимы для деления и жизнеспособности клеток.
У позвоночных сердце является первым органом, который формируется и выполняет жизненно важную роль по распределению питательных веществ и кислорода у эмбрионов. Первоначально оно функционирует как кардиальная трубка и принципиально состоит из контрактильного MYOCARDIUM, который существенен для её действия как центрального насоса. Затем происходит регионализация этой структуры и у взрослых птиц и млекопитающих это ведет к образованию четрых-камерного сердца. Недавние исследования создали фундаментально измененное мнение относительно кардиогенеза: вместо, как это до сих пор предполагалось, одного источника клеток миокардиальных предшественников, было показано, что имеются два самостоятельных источника этих клеток. Здесь будут рассмотрены клеточные процессы, которые происходят во время раннего кардиогенеза прежде чем обсуждать эксперименты, которые привели к идентификации второго источника миокардиальных клеток. Затем будет произведена переоценка классических моделей развития сердца в этом контексте и обсуждено значение этого для интерпретации мутантных фенотипов в миокардиальных регуляторных генах.
Cellular aspects of early cardiogenesis
Миокардиальные клетки являются производными MESODERM, которая возникает из PRIMITIVE STREAK во время GASTRULATION. Клетки кардиальных предшественников были картированы в передней области первичной полоски у эмбрионов кур и мышей1,2; на этой стадии их предопределение к кардиальной судьбе остается пластичным. Позднее, они покидают полоску и мигрируют в передне-латеральном направлении в позиции под головные складки, формируя две группы клеток на каждой из сторон от срединной линии2,3 (FIG. 1). Миокардиальные маркеры впервые выявляются на этой стадии. Количество клеток затем увеличивается и они пересекают срединную линию, формируя серпо-образной формы эпителий, кардиальный полумесяц, который сливается по срединной линии и образует раннюю сердечную трубку. Эта трубка формирует правостороннюю петлю с её задней частью перемещающейся кпереди. Сердце меняет свою форму в результате процесса петлеобразования и в результате экспансии миокарда, что приводит к образованию распознаваемых кардиальных камер.
Классическая точка зрения на то, как устанавливаются региональные качественные особенности в кардиальной трубке базируется на экспериментах на эмбрионах кур. Эти эксперименты показали, что клетки в этой первичной полоске pre-patterned, в терминах их вклада в кардиальную трубку, вдоль артериально-венозной оси, с предшественниками тракта оттока для артериального полюса, позиционируемыми наиболее кпереди1,4. Такое формирование передне-заднего пре-паттерна сохраняется в кардиальном полумесяце и развивающейся кардиальной трубке5-8, так что каждая область сердца представляет собой самостоятельную клеточную единицу.
Эти наблюдения привели к сегментной модели кардиогенеза (FIG. 2).
Однако, более недавние эксперименты демонстрируют незначительную регионализацию вплоть до стадии кардиального полумесяца у эмбрионов кур9-12. Эти отличающиеся мнения, по-видимому, частично отражают технические ограничения более ранних экспериментов, а имеющиеся сегодня доказательства показывают, что формирование пре-паттерна в первичной полоске лучше всего описывать как тенденции клеток вносить вклад в специфические регионы сердца1. Исследования на мышах также показывают отсутствие ранней сегментной регионализации13; клонально родственные миокардиальные клетки диспергируют вдоль длины кардиальной трубки, так как она начинает формировать петлю.
По мере роста кардиальной трубки начинают формироваться камеры за счет экспансии миокарда (FIG. 1d). При этом используется дифференциальный клеточный рост по наружному изгибу (curvature) кардиальной трубки14,15, в то же время ориентированный клеточный рост, по-видимому, важен для формообразования камер16.
Identification of novel heart fields
В дополнение к росту миокардиальных клеток внутри кардиальной трубки (и возможно редких недифференцированных клеток17), исследования на эмбрионах кур6,8 и мышей18,19 показали, что дальнейшее привлечение сердечных клеток предшественников происходит на полюсах трубки. Были охарактеризованы источники таких клеток предшественников. Это связано с концепцией поля сердца, которое определяется как дискретная эмбриональная область, в которой локализованы клетки, которые обладают миокардиальным потенциалом.
Heart fields in the chick embryo. Добавление миокарда сзади к венозному полюсу, который дает область притока (inflow) (FIG. 1), как полагают, обеспечивается предшественниками билатерально разделенных концов кардиального полумесяца4,11. Недавно была идентифицирована самостоятельная область PHARYNGEAL MESODERM двумя группами, как источник миокарда для тракта оттока у эмбрионов кур20,21. Удаление кардиального полумесяца не полностью устраняет формирование кардиальной трубки, а эксплантационные эксперименты по CHICK.QUAIL GRAFTS и картированию судеб показали, что второй источник миокардиальных клеток находится в фарингеальной мезодерме.
Вообще-то из-за различий в экспериментальных подходах заключения о точной локализации этого второго источника предшественников оказалась различной в двух группах (FIG. 3a). Одна группа описала его как 'secondary heart field', которое располагается непосредственно по соседству и позади области тракта оттока позади сердечной трубки21, в то время как др. идентифицировала 'anterior heart field', которое включает более краниальную фарингеальную мезодерму, которая расширяется в PHARYNGEAL ARCHES20.
Heart fields in the mouse embryo. Исследования на мышах также привели к идентификации переднего поля сердца как источника миокарда тракта оттока22. Это было установлено благодря использованию lacZ трансгена под контролем регуляторных элементов гена Fgf10 (fibroblast
growth factor 10), это приводило в результате к транскрипции lacZ в части фарингеальной мезодермы. Клетки, которые экспрессировали трансген, как было показано, вносят вклад в миокард артериального полюса сердца. Это было подтверждено DI.I LABELLING. Вклад этого переднего поля сердца в миокард правого желудочка и тракт оттока sk продемонстрирован недавно с помощью трансплантационных экспериментов и дальнейших исследований с мечением Di-I23. Эти исследования также показали, что ранняя кардиальная трубка у эмбрионов мышей обладает существенными качественными особенностями левого желудочка23.
Переднее поле сердца мышей располагается впереди, а также дорсальнее кардиальной трубки (FIG. 3b). На стадии кардиального полумесяца клетки, которые маркируются с помощью Fgf10-lacZ трансгена располагаются медиальнее полумесяца на каждой из сторон от срединной линии, затем эти меченные клетки оказываются в дорсальном мезокардии, позади сливающейся сердечной трубки. Они находятся в контакте с дорсальной поверхностью трубки, которая начинает становиться внутренним изгибом (curvature) во время образования сердечной петли. Некоторые меченные клетки оказываются также расположенными более кпереди. Видимая локализация этих клеток переднего поля сердца в мезодермальной сердцевине фарингеальных дуг22,24, по-видимому, результат более ранних мофогенетических движений во время образования фарингеальных дуг. Клетки, которые расположены дорсальнее и кпереди по отношению к ранней кардиальной трубке безусловно присваивают качественные особенности правого желудочка, тогда как более передние клетки вносят вклад, чуть позднее, в миокард тракта оттока23.
Расширение вклада этой популяции миокардиальных предшественников выявлено в исследованиях экспрессии Isl1 (insulin gene enhancer protein,
LIM гомеодоменового транскрипционного фактора) в клетках, которые присутствуют в переднем поле сердца мышей, а также тех, что распространяются больше кзади25. Отслеживание клонов показало, что эти клетки вносят вклад как в венозный, так и артериальный полюс кардиальной трубки. Это демонстрирует, что область притока также формируется клетками из нового поля сердца, которое включает переднее поле сердца, которое маркируется с помощью трансгена Fgf10-lacZ. Оно обозначено как второе поле сердца, чтобы отличать его от классического первого поля сердца (FIG. 3b). Первое поле сердца, которое дает дифференцирующиеся миокардиальные клетки кардиального полумесяца и ранней кардиальной трубки, трудно точно локализовать из-за отсутствия маркеров (оно представлено на FIG. 3b в области серпа). С пространственной точки зрения кардиальный полумесяц может рассматриваться как дифференцирующийся передне-латеральный край одиночного поля клеток предшественников, которое расширяется более медиально. Т.к. наружные края этого поля движутся вместе, чтобы сформировать инициальную кардиальную трубку, которая в основном представляют будущую область левогот желудочка у мышей, то клетки предшественники, которые располагаются дорсальнее, кзади и кпереди продолжают интегрироваться в сердце. Однако, мы полагаем, что более удобно делать различия между первым и вторым полями сердца, т.к. клетки предшественники последнего отличаются экспрессией специфических маркеров.
First and second myocardial cell lineages
Различия между двумя полями сердца подкреплены находками при изучении клонов клеток у мышей, которое базировалось на мечении β-galactosidase в RETROSPECTIVE CLONAL ANALYSIS26. Концепция центров миокардиальных клонов на историю клеток и их производных и характеристика их клонального вклада в сердце. Пространственное распределение клонально родственных β-galactosidase позитивных клеток на эмбриональный день E8.5 выявило две категории клонов с самостоятельными паттернами регионализации кардиальной трубки (FIG. 3c).
Один клон вносит вклад в желудочки, атриовентрикулярный канал и оба предсердия; другой вносит вклад в тракт оттока и во все остальные области сердца, за исключением левого желудочка. Этот второй клон соответствует вкладу второго поля сердца, как это установлено с помощью ISL1-меченных клеток25. Некоторые меченные клетки второго клона обнаруживаются также в дорсальном мезокардии и чаще всего на внутренней курватуре трубки, как и следовало ожидать, если происходит рекрутирование из подлежащей мезодермы. Оба клона присутствуют в правом желудочке, атриовентрикулярном канале и предсердиях, где они существенно перекрываются, хотя в некоторых областях (особенно в правом предсердии на ст. E8.5) клональные домены первого и второго клонов, по-видимому, комплементарны.
Приобретение региональных качественных особенностей может быть приравнено к клональному ограничению одиночного компартмента. Количество меченных клеток в таком клоне дает указание на время регионализации, исходя из предположения, что пролиферация гомогенна до E8.5. Атриальная область становится клонально самостоятельной раньше, чем правый желудочек и тракт оттока, что согласуется с экспериментами на эмбрионах кур, которые показали, что качественные особенности атриальной области приобретаются на ст. кардиального полумесяца27. Вклад двух клонов в основные части сердца и тот факт, что большинство регионов не становятся клонально самостоятельными вплоть до поздних стадий, ставит под вопрос сегментную модель развития сердца.
Ретроспективный клональный анализ показал, что первый и второй клоны сегрегируют от общего предшественника до стадии кардиального полумесяца, возможно в начале гаструляции. Это показано, благодаря присутствию крупных клонов, которые имеют меченные клетки в компартментах обоих клонов трубки и происходят из ранних общих предшественников. Первый клон, называемый так из-за того, что он первым сегрегирует от общего предшественника для обоих клонов. Это временное разделение клонов, по-видимому, сопровождается до некоторой степени пространственной сортировкой и прогрессивным ограничением клеточной дисперсии скорее, чем формированием пре-паттерна соседними областями кардиальной трубки (сегментная модель), что д. давать в результате их строгое клональное расхождение. В согласии с этим и то, что большинство компартментов получает вклад от обоих клонов. Тенденция
в направлении регионализации в первичной полоске, которая была описана для эмбрионов кур, показывает, что клетки предшественники тракта оттока приходят из определенного местоположения. Неясно однако, колонизирует ли второй клон, который делает вклад в тракт оттока у кур, также и др. части сердечной трубки птиц. У млекопитающих второй клон может приобретать более обширную роль в кардиогенезе. Исходя из клонального анализа миокардиальных клеток на ст. E8.5 у мышей, было предположено, что второй клон позволяет объяснить треть миокардиальных предшественников26, хотя производные этих клеток могут представлять большую часть взрослого миокарда.
В заключение, миокардиальный вклад первого и второго клонов, которые отличаются своим участием в левом желудочке в противоположность тракту оттока на ст. E8.5, имеет непосредственное отношение к вкладу первого и второго полей сердца. Раннее расхождение двух клонов подтверждает идею, что два поля сердца с клетками предшественниками вносят самостоятельные региональные вклады в сердце. Самостоятельный миокардиальный потенциал клеток второго поля сердца подтвержден недавними молекулярными данными.
Molecular aspects of early cardiogenesis
Самые ранние молекулярные маркеры для кардиальных предшественников, транскрипционные факторы MESP1 (mesoderm posterior 1) and MESP2 (mesoderm posterior 2)28, экспрессируются временно во вновь сформированной мезодерме на стадии первичной полоски. Это необходимо для перемещения клеток в направлении передней области эмбриона. Производные этих клеток колонизируют весь миокард28, так что экспрессия
MESP1 и MESP2, по-видимому, маркирует оба миокардиальных клеточных клона.
Миокардиальные транскрипционные факторы впервые выявляются в кардиальном полумесяце, где инициируется миокардиальная дифференцировка. Активация ключевых миокардиальных регуляторных генов, таких как NKX2-5 (NK2 transcription factor related, locus 5) и GATA4 (GATA-binding protein 4), зависит от позитивной передачи сигналов с помощью BMPs (bone morphogenetic proteins) и FGFs (fibroblast growth factors),
в то время как WNTs (wingless-related MMTV integration sites) оказывает репрессивный эффект29. Медиальное расположение второго поля сердца на ст. кардиального полумесяца указывает на то, что оно ближе к негативному влиянию WNTs, которое исходит из NEURAL TUBE. BMPs25 и FGFs22,25 также экспрессируются во втором поле сердца, где они приводят к более поздней активации генов, таких как Nkx2-530. Два поля сердца, следовательно, регулируются, по-видимому, с помощью сходных кардиогенных сигналов. Это, по-видимому, имеет место и в отношении сигналов, которые необходимы для формирования передне-заднего и лево-правостороннего паттерна; эти процессы обеспечиваются соотв., ретиноевой кислотой и её рецепторами27,31, и с помощью PITX2 (paired-like homeodomain transcription factor 2)32,33, который представляет собой транскрипционное считывающее устройство (read-out) пути передачи сигналов Nodal.
Мутации Gata434,35 и Foxp4 (forkhead
box P4)36 приводят к CARDIAC BIFIDA, благодаря неспособности двух половин кардиального серпа конвергировать по срединной линии. У мутантов Foxp4 два не слитых сердца созревают далее и вклад второго поля сердца, по-видимому, имеет место с клетками предшественниками, остающимися билатеральными. Это снова указывает на то, что поля сердца подвергаются действию сходных фаттерн формирующих сигналов.
Когда фенотипы нулевых мутаций в генах, которые кодируют миокардиальные транскрипционные факторы, впервые были описаны, то стало ясно, что не существует одиночного фактора, существенного для дифференцировки кардиомиоцитов. В некоторых случаях, таких как с Mef2c (myocyte enhancer factor 2c; известен также как RSRF, related to serum response factor), функция может быть заменена др. членами семейства генов37. Однако, в большинстве случаев, таких как с Nkx2-538, компенсация, по-видимому, оперирует между разными семействами транскрипционных факторов, которые функционируют в комбинации, чтобы регулировать нижестоящие мышечные гены39,40. Фенотипы таких мутантов обнаруживают строгие эффекты на морфогенез сердечной трубки, которая часто характеризуется специфической потерей примитивных камер и арестом развития сердца на ст. петлеобразования. Эти результаты оказались неожиданными, т.к. большинство генов экспрессируется по всему раннему миокарду, который во время экспериментов считался происходящим из единственного источника. теперь они могут быть переосмыслены в терминах вклада в миокард двух полей сердца. TABLE 1 представляет суммарную экспрессию и мутантный фенотипы избранных генов, которые регулируют кардиогенез в том контексте, который будет обсужден ниже.
Mutations affecting 1st heart field derivatives
Т.к. первый клон специфически вносит вклад в клетки предшественники левого желудочка, то пертурбации в этом клоне, скорее всего, затрагивают формирование этой структуры. В др. регионах сердца рекрутирование клеток из второго поля сердца может компенсировать ранние дефекты вклада первого поля сердца.
Nkx2-5 and Hand1. Мутантный Nkx2-5 фенотип41,42, хотя открыт и для др. интерпретаций, по-видимому, отражает всё-таки дефект первого клона. Это демонстрируется с помощью потери ткани желудочков и отсутствия экспресии Hand1 (heart and neural crest derivatives expressed transcript 1) на ст. кардиального полумесяца и позднее в кардиальной трубке43, где он д. обычно метить левый желудочек (FIG. 4b). Hand2, который позднее маркирует правый желудочек44, всё ещё экспрессируется45.
Hand1 мутанты погибают из-за вне-эмбриональных дефектов46,47, но проверка химер из клеток мутантного и дикого типа показала. что клетки, лишенные HAND1 не способны вносить вклад в левый желудочек46,48. Более того, условные мутации Hand1, которые, по-видимому, активируются в на стадии трубчатого сердца приводят к HYPOPLASIA левого желудочка49. Клетки, которые экспрессируют Hand1 на ранних стадиях не теряются, так как др. маркеры экспрессируются нормально в кардиальном полумесяце и не выявляется клеточной гибели у Nkx2-5 мутантов43. Вместо этого может наблюдаться дефект пролиферации первого клона. Эффекты от вклада второго клона также м. иметь место, на что указывает укорочение тракта оттока у этих мутантов. Однако, это может быть вторичным следствием аномального кардиогенеза, который затрагивает более позднее привлечение клеток на артериальный полюс.
Tbx5. Tbx5 (T-box 5) мутантные мыши50 обнаруживают тяжелые дефекты в предсердиях--области притока сердца м гипоплазию левого желудочка, хотя маркеры левого желудочка, такие как HAND1 всё ещё обнаружимы. Несмотря на свою аномальную морфологию тракт оттока и правый желудочек продолжают расти. Это указывает на эффект на пролиферацию первого клона. Эктопическая экспрессия Tbx5 в миокарде трансгенных мышей нарушает развитие правого желудочка и ведет к редукции общего размера сердца. Hand1 усиливает свою активность, а экспрессия Hand2 отсутствует51. Это указывает на роль TBX5 в спецификации левого желудочка, в принципе благодаря негативным эффектам на экспансию др. регионов сердца.
Отсутствуют молекулярные маркеры для первого поля сердца, которые предопределяют популяцию клеток предшественников и отличают их от дифференцирующихся кардиомиоцитов в полумесяце. Это делает затруднительным разделение поздних эффектов мутаций на регионализованный миокард камер в сердечной трубке от специфических эффектов на клетки первого миокардиального клона. Напротив, увеличивается количество маркеров для второго поля сердца.
Mutations affecting 2nd heart field derivatives
Т.к. одни клетки второго миокардиального клона вносят вклад в клетки предшественников для тракта оттока, то нарушения этого клона д., скорее всего, специфически влиять на образование этого компартмента. Где-то в др. месте сердца первый клон может компенсировать ранние дефекты вклада второго поля сердца.
Fgf8 and Fgf10. Как было описано ранее, первым указанием на второе поле сердца у мышей были получены при изучении экспрессии трансгена Fgf10-lacZ. Fgf8 (fibroblast growth factor 8) обладает сходным паттерном экспрессии с Fgf10 во втором поле сердца22, хотя скорее всего Fgf10 экспрессируется в эктодерме и энтодерме фарингеальных дуг, но не в мезодерме21. Fgf10 мутантные мыши не имеют признаков раннего кардиального фенотипа52,53 и тракт оттока, по-видимому, нормален (F. Bajolle, S.Z., R. Kelly and M.B., unpublished observations). Fgf8-нулевые мутанты погибают во время гаструляции, но Fgf8 гипоморфы54,55 погибают позднее из-за сердечной недостаточности, обусловленной нарушениями области тракта оттока. Передача сигналов FGF может быть необходимой для пролиферации клеток во втором поле сердца, как показано на эмбрионах кур21.
Уродства аорты и pulmonary ствола (FIG. 1f), которые также возникают у этих мутантов54, по-видимому, отражают эффект на NEURAL CREST CELLS, которые необходимы для разделения и нормального развития этих структур. Fgf8 не экспрессируется в нервном гребне, но клетки нервного гребня мигрируют из мезенхимы фарингеальных дуг в область оттока, где они, по-видимому, нарушаются при аномальной передаче сигналов FGF у мутантов. Передняя часть второго поля сердца находится в тесном контакте с нервным гребнем, а вмешательство в миграцию клеток нервного гребня м. влиять на это поле. Это было показано с помощью экспериментов по удалению нервного гребня у эмбрионов кур, которое приводило к уменьшению количесва миокардиальных клеток, рекрутируемых на передний полюс сердца56.
Условные мутации, нацеленные на второе поле сердца, необходимы для выявления специфической роли FGF8 в миокардиальных предшественниках.
Tbx1. Кардиальный фенотип Tbx1 (T-box 1) мутантных мышей57-60 сходен с таковым у Fgf8 гипоморфов54,55.
днако, дефект нервного гребня у мутантов Tbx1 более тяжелый, что отражает его экспрессию в энтодерме и стержневой мезодерме фарингеальных дуг. Анализ этих мутантов вместе с экспериментам по избыточной функции показал, что Fgf861.63 и Fgf1064,65 могут быть мишенями для Tbx1. Это было подтверждено для Fgf8 путем идентификации TBX1-зависимой регуляторной последовательности61. Эксперименты по отслеживанию клонов с использованием CRE.LOXP SYSTEM подтвердили роль TBX1 во втором поле сердца и показали экстенсивное мечение миокардиальной стенки тракта оттока, с некоторыми дополнительными позитивными клетками в правом желудочке62,63. Это указывает на то, что ранний миокардиальный вклад клеток, которые экспрессируют Fgf8, Fgf10
или Tbx1 сходен, хотя Fgf10-экспрессирующие клетки могут вносить более обширный вклад в правый желудочек23. Интересно, что эксперименты по отслеживанию Tbx1 показали, что меченные клетки левого желудочка становятся видимыми на более поздних стадиях развития, а у взрослых всё сердце обнаруживает метку62. Это указывает на то, что клетки второго клона распространяются по всему сердцу на поздних стадиях, тогда как клональный анализ показывает, что второй клон первоначально не представлен в левом желудочке26. Альтернативно, возможно, что еще не выявлена поздняя реактивация Tbx1. Функция TBX1 во втором поле сердца выявляется с помощью экспериментов отслеживания клонов на Tbx1-нулеовм фоне. Они выявили уменьшение вклада клеток второго поля сердца, которые обычно экспрессируют этот ген, в миокард тракта оттока63. Целенаправленные делеции Tbx1 во втором поле сердца обусловливают дефекты пролиферации63, которые могут объяснить подобный редуцированный вклад. Избыточная экспрессия Tbx1 в миокардиальных клетках обусловливает усиление активности Fgf8 и Fgf10, с повышением в миокарде тракта оттока61. TBX1 может , следовательно, регулировать пролиферацию во втором поле сердца путем активации этих генов. Однако остается еще определить, может ли замена TBX1-кодирующей последовательности с помощью последовательностей FGF8 и FGF10 нормализовать мутантны Tbx1 фенотип.
Транскрипционные факторы FOXC1 и FOXC2 (forkhead
box C1 и C2) являются потенциальными вышестоящими активаторами Tbx1, a Foxc1 Foxc2 двойные мутанты обнаруживают дефекты переднего поля сердца (REF. 66; T. Kume, personal communication). Tbx1 является также мишенью для FOXA2 (forkhead box A2), который сам регулируется с помощью TBX1 в фарингеальной мезодерме61,67.
Isl1. У Isl1 мутантных эмбрионов (FIG. 4b), сердечная трубка содержит только две камеры. Генетические маркеры продемонстрировали присутствие атриального и вентрикулярного миокарда, а мечение с помощью Hand1 и Tbx5 зондов выявило качественные особенности левого желудочка переднего компартмента. Тракт оттока отсутствует, a маркеры правого желудочка не экспрессируются, в то же время задний атриальный миокард, по-видимому, редуцирован. Это согласуется с экспрессией Isl1 в клетках из второго поля сердца, которые вносят вклад в венозный полюс сердца, а также в артериальный полюс (FIG. 3c). ISL1 может выполнять несколько ролей во втором поле сердца. В его отсутствие миграция в кардиальную трубку не обнаруживается, пролиферация нарушена и клетки подвергаются апоптозу25. В дополнение к потере экспрессии, которая обусловлена клеточной гибелью, BMP4, BMP7 и FGF10 специфически подавляются. Потенциальный эффект на спецификацию миокардиальных клеток проявляется за счет ISL1-обусловленной регуляции энхансера Nkx2-5, который активен во втором поле сердца68.
Отслеживание клеток клонов. которые экспрессируют Isl1, используя
Cre-loxP стратегию, показало, что помимо колонизации тракта оттока, правого желудочка и части предсердия25, меченные клетки присутствуют также на внутреннем изгибе левого желудочка. Вклад этих клеток второго поля сердца во все части сердца подтвержден дальнейшими экспериментами по отслеживанию клонов с использованием более эффективного Isl1-Cre; в этом случае не меченные клетки обнаруживались только на наружном изгибе левого желудочка и в части правого предсердия в образовавшей петлю сердечной трубке (S. Evans, personal communication). Это контрастирует с ретроспективным клональным анализом, который показал, что второй клон не вносит вклада в примитивный левый желудочек26. Минорный вклад клеток второго клона в левый желудочек, возможно по всему внутреннему изгибу, может быть упущен при ретроспективном клональном анализе. Однако, т.к. конечная точка этого анализа приходилась на ранние стадии развития сердца, то второй клон мог впоследствии распространяться на др. области сердца, ка это обсуждалось в контексте клонального изучения экспрессии Tbx162,63. Важным предупреждением этого подхода является то, что клетки, которые экспрессируют Isl1 (или Tbx1) могут присутствовать в миокарде, это может мешать интерпретации. В случае Isl1, такие клетки были недавно выявлены во взрослом сердце17. Они редки и обладают свойствами кардиальных клеток предшественников. До некоторой степени их распределение соответствует распределению вклада второго поля сердца, как показывает клональное исследование25, т.к. количества этих ISL1-позитивных клеток наинизшие в левом желудочке и наивысшие в тракте оттока. Это открывает возможность того, что они происходят из второго поля сердца и было бы интересно определить, экспрессируют ли они также Tbx1. Хотя такие клетки редки, если они само-обновляются, то они могут вносить существенный вклад в миокардиальный рост во время развития сердца, на что указывает экстенсивное мечение взрослых сердец в экспериментах по отслеживанию клонов Tbx162.
Foxh1. У Foxh1 (forkhead box H1) мутантов69, маркеры правого желудочка и тракта оттока не выявляются, хотя укороченная область оттока присутствует. Это указывает на то, что FOXH1 важен для образования правого желудочка, но лишь частично необходим для образования тракта оттока. Венозный полюс у них, по-видимому, нормален, и присутствует левый желудочек, на что указывает экспрессия генов, таких как Hand1 и
Tbx5. Маркеры, которые ассоциированы с созреванием левого желудочка, такие как Nppa (natriuretic peptide precursor
type A), не экспрессируются, что согласуется с арестом развития этого региона. Foxh1 экспрессируется в передней части второго поля сердца70,71. В его отсутствие происходит подавление экспрессии Fgf8 и более позднего эффекта на Fgf10, в то время как экспрессия Isl1 не изменена. FOXH1 трансдуцирует сигнады TGFβ (transforming growth factor-β)69 и действует совместно с SMADs70; он может , следовательно, влиять на второе поле сердца посредством этих сигнальных путей.
Mef2c. Экспрессия MEF2C73 была первоначально описана в сердечном полумесяце72. Однако, анализ lacZ трансгена74 под контролем обширной регуляторной области Mef2c показал, что ранняя экспрессия находится медиальнее кардиального полумесяца и постепенно продолжается во второе поле сердца. Mef2c мутанты37 имеют фенотип нарушения второго поля: как и у мутантов Foxh1 , тракт оттока обнаружим, но редуцирован, в то время как правый желудочек не развивается. Отсутствует sinus venosus, это указывает на то, что MEF2C необходим второму полю сердца для осуществления вклада в венозный полюс, а также в артериальный полюс.
Mef2, по-видимому, является мишенью для ISL1, на что указывает энхансерный элемент в гене Mef2c, который регулируется с помощью ISL1 и GATA474. Этот энхансер управляет экспрессией трансгена во втором поле сердца, где он частично перекрывается с экспрессией Isl1, и в тракте оттока и правом желудочке. Эта миокардиальная экспрессия может быть обусловлена perduration β-galactosidase, как и в случае трансгена Fgf10-lacZ22, маркируя вклад клеток второго поля сердца, в которых трансген транскрибируется, в эти части сердца. MEF2C участвует в регуляции клеточного цикла в др. тканях, так что дисрегуляция Mef2cможет вносить вклад в пролиферативный дефект у мутантов Isl1 25.
Mef2c может быть также мишенью для FOXH1, который в содружестве с NKX2-5, действует на др. регуляторный элемент Mef2c69. MEF2C сам активирует ген Bop (известный также как Smyd1, SET and MYND domain containing 1), который кодирует предположительно HISTONE METHYL TRANSFERASE и экспрессируется во втором поле сердца и миокарде75, с мутантным фенотипом, который сходен с таковым для Mef2c76.
Hand2. Hand2 является потенциальной мишенью для BOP76. Мутантны Hand2 обнаруживают гипоплазию правого желудочка77,78, в то время как двойные мутанты Hand1 Hand243,49 обнаруживают более выраженный фенотип. У них формируется только одна камера сердца. которая экспрессирует атриальные маркеры; вентрикулярный миокард действительно отсутствует. Это согласуется с потерей клеток первого клона в левом желудочке в отсутствие HAND1. Тяжелый фенотип правого желудочка у двойных мутантов, по-видимому, отражает потерю вкладов из первого и второго поля сердца в эту камеру.
У двойных мутантов Hand1 Hand2 выявляются небольшие количества вентрикулярных клеток на наружном изгибе (curvature) сердечной трубки, где обнаруживается и апоптоз. Они могут соответствовать клеткам, которые происходят из второго поля сердца, которые погибают в отсутствие HAND2.
Анти-апоптическое действие HAND2 доказано в мезенхиме фарингеальных дуг, где он также экспрессируется и где наблюдается экстенсивная клеточная гибель в его отсутствие79. Это приводит к дефектам нервного гребня, что затрагивает формирование аорты и пульмонального ствола78. Как обсуждалось выше, такие пертурбации, по-видимому, также затрагивают второе поле сердца. И снова условные мутации, которые специфически затрагивают это поле, д. выявлять прямой эффект этих клеток.
Tbx20. Недавние работы описали сложный фенотип мутантов Tbx20 (T-box 20)80-82. Затрагиваются, по-видимому, вклады от обоих полей сердца и аномальна экспансия миокардиальных клеток внутри сердечной трубки. Этот последний дефект, по-видимому, обусловлен продолжающейся экспрессией Tbx2, которая обычно репрессируется с помощью TBX20 во время роста миокардиальных камер15,83,84. Отсутствие экспрессии Hand1 у мутантов Tbx20 указывает на то, что вклад первого клона в левый желудочек нарушен, что, по-видимому, отражает прямое влияние TBX20 на поддержание экспрессии Nkx2-5. Tbx20 мутанты обнаруживают также гипоплазию будущего правого желудочка и отсутствие морфологически отличимого тракта оттока, это указывает на эффекты на миокардиальный вклад из второго поля сердца, где обнаруживается экспрессия Tbx2068. TBX20 действует синергично с ISL1 и GATA4, чтобы активировать Mef2c энхансер74, и сходная синергичность обнаруживается in vitro для Nkx2-5 энхансера. Более того, TBX20 может функционировать как Isl1 репрессор. У Tbx20 мутантов экспрессия Isl1 не изменена во втором поле сердца, но наблюдается по всей кардиальной трубке, указывая тем самым на ее сохранение в клетках, которые произошли от этого поля, и на активацию в клетках первого клона в отсутствие TBX20.
Conclusions
The classical view of cardiogenesis has been modified
by the demonstration that there are two myocardial cell
lineages and by the identification of a second heart field,
which is characterized by specific regulatory networks
(FIG. 5). We have concentrated here on genes for which
mutant phenotypes have been described. However, an
increasing number of second heart-field markers are
emerging. Re-examination of the mutant phenotypes of
other genes that are expressed in the developing heart
may reveal their roles in the second lineage.
The identification of the second heart field is likely
to have an important effect on the classification and
interpretation of human congenital heart defects.
Until now these malformations have been considered
mainly in the context of the segmental model of heart
development85,86. Malformations of the outflow region,
which are observed in 0.3% of live births, can now be
examined by a candidate-gene approach that is based
on what is known about the regulation of the second
heart field. Null mutations in the main cardiac-regulatory
genes are likely to be lethal, as in the mouse.
However, some congenital heart defects have already
been linked to haploinsufficiency of these genes, as in
the case of Holt–Oram syndrome for Tbx5 (REF. 50) and
DiGeorge syndrome for Tbx1 (REFS 58.60). In the future,
other genes that are expressed in the second heart field
may prove to be linked to malformations of the human
heart, highlighting the importance of understanding its
role in cardiac development.
Сайт создан в системе
uCoz 
Sigolene Meilhac and Stephane Zaffran
