Сердце является первым функциональным органом, формируемым во время органогенеза, а клетки, которые предназначены сформировать кардиальную мезодерму индуцируются до и во время гаструляции. Клетки кардиальной мезодермы инвагинируют через первичную полоску и мигрируют вместе с краниальной мезодермой. Билатерально симметричные кардиальные предшественники постепенно мигрируют и конвергируют по срединной линии эмбриона, чтобы сформировать кардиальный серп, который затем формирует линейную одиночную сердечную трубку. Сердечная трубка, формируемая наружным миокардом и внутренним эндокардом, подвергается петлеобразованию в правую сторону, между этими слоями образуется бесклеточный матрикс (кардиальный гель). Изогнутая сердечная трубка затем подвергается разделению, чтобы дать зрелое четырехкамерное сердце у млекопитающих.
Сердце состоит из 3-х главных типов кардиальных клеток:(1) эндокарда, часть которого формирует ткань подушек, путем трансформации эпителиальных клеток в мезензимные; (2) миокард; и (3) эпикард (rev. Moorman and Christoffels, [2003]). Основные компоненты сердца, такие как эндокард и миокард, являются мезодермального происхождения, (т.e., кардиогенной мезодермой), но вклад др. клеточных клонов описан и у кур и мышей. Картирование судеб птичьего кардиального нервного гребня осуществлялось с помощью экспериментов по получению химер перепел-курица показало, что два типа мезенхимы, производная кардиального нервного гребня и не происходящая из нервного гребня, участвуют в разделении и ремоделировании тракта оттока (Kirby et al., [1983]; Waldo et al., [1998]). Недавно, с помощью использования Cre-loxP системы у мышей, было показано, что кардиальные подушки outflow tract (OT) частично формируются и клетками кардиального нервного гребня (Yamauchi et al., [1999]; Jiang et al., [2000]). Кроме того, клональный анализ с использованием Tie2-cre у мышей подтвердил, что подушки OT являются смешанного происхождения, содержат клетки нервного гребня и эндокарда, тогда как atrioventricular (AV) подушки в основном происходят из клеток, возникающих в эндокарде (Kisanuki et al., [2001]).
Специализированная cardiac conduction system (CCS) включает sinoatrial (SA) узел, который генерирует задающие ритм импульсы; AV узел, который задерживает электрические импульсы и делает последовательные сокращения атриальных и вентрикулярных камер сердца; и вентрикулярная CCS, из atrioventricular bundle (AVB), веточек пучка и их ответвлений, которые облегчают быструю и скоординированную передачу импульсов к желудочкам и по всем желудочкам. Клетки в CCS характеризуются своими крупными размерами, уменьшенным количеством миофибрилл, значительным накоплениям гликогена (Mikawa, [1999]). Было предположено, что CCS может быть подразделена на 2 части на базе ее происхождения (Moorman et al., [1998], [2003]). Одна является SA и AV узлами, которые могут быть производными медленно проводящего миокарда из тракта притока и AV канала. Др. является вентрикулярной CCS, которая возможно развивается из трабекулярного вентрикулярного компонента. У кур были получены строгие доказательства, что вентрикулярные компоненты проводящей системы происходят из кардиомиогенных клеток (Gourdie et al., [1995]; Cheng et al., [1999]). Кроме того, было подтверждено, что дифференцировка субнабора волокон Пуркинье, соседствующих с артериальным ложем, может регулироваться локальными сигналами от коронарных артерий (Gourdie et al., [1995]). Впоследствии было показано, что endothelin-1, паракринный фактор, секретируемый эндотелиальными клетками, способен индуцировать превращение эмбриональных миоцитов кур в клетки CCS.
В противоположность CCS птиц, вентрикулярная CCS у большинства млекопитающих морфологически и топологически отличается от таковой у кур, т.к. она в основном субэндокардиальная. Следовательно, онтогенетическая роль коронарных артерий в дифференцировке CCS млекопитающих оказывается неопределенной. В сердце мышей экспрессия некоторых маркеров, включая специфические connexins и lacZ, транскрипция которого регулируется или minK или HF-1b локусами, вычленяет веточки пучка и проксимальные части волокон Пуркинье, но ни один не маркирует всю проводящую сеть вдоль вентрикулярных свободных стенок (Delorme et al., [1995]; Coppen et al., [1998], [1999]; Kupershmidt et al., [1999]; Nguyen-Tran et al., [2000]). Напротив, вся CCS мышей, включая дистальную сеть волокон Пуркинье, в сердцах эмбрионов и новорожденных, была недавно визуализирована с помощью активности β-galactosidase (β-gal) репортера (Rentschler et al., [2001]) в линии мышей CCS-lacZ. Недавно β-gal-позитивные клетки в области interventricular septum (IVS) CCS-lacZ взрослых мышей были описаны, как соответствующие Cx40-позитивным клеткам (Myers and Fishman, [2004]). Однако, сравнение было осуществлено с использованием серии срезов; поэтому дальнейшее выяснение необходимо, чтобы определить, действительно ли те же самые клетки экспрессируют оба маркера или нет. Тем не менее это рассматривается как то, что β-gal-позитивные клетки у CCS-lacZ эмбрионов скорее всего указывают на принадлежность к CCS клеткам у эмбрионов мышей, по сравнению с др. маркерами. Хотя клоны клеток мышиной CCS не полностью охарактеризованы, недавние исследования демонстрируют, что экзогенная обработка эмбрионов 8.5-10.5 days postcoitum (dpc) с помощью neuregulin-1, происходящего из эндокарда фактора роста и дифференцировки, существенного для трабекуляции желудочков, может индуцировать CCS-подобный фенотип в эмбриональных кардиомиоцитах (Rentschler et al., [2002]). В тоже время использование in vitro культуральных систем также продемонстрировало, что обработка эмбриональных стволовых клеток endothelin-1, но не neuregulin-1 увеличивает процент pacemaker-подобных клеток, указывая тем самым, что роль endothelin-1 в развитии CCS может быть законсервирована, даже у мышей (Gassanov et al., [2004]).
Mesp1 и Mesp2 являются транскрипционными факторами, которые содержат пчти идентичные basic helix-loop-helix (bHLH) мотивы и кодируются генами, которые локализованы на хромосоме 7 (Saga et al., [1996], [1997]). Разрушение гена
Mesp1 приводит к
cardia bifida (Saga, [1998]). Нами также ранее было показано при использовании двойных нокаутных эмбрионов мышей и с помощью анализа химер, что Mesp1 и Mesp2 существенны для развития кардиальной мезодермы (Kitajima et al., [2000]). Экспрессия
Mesp1 ограничена нарождающимися мезодермальными клетками и его экспрессия временна и подавляется до образования сердечной трубки (Saga et al., [1999]). Однако, линей2ный анализ с использованием Mesp1-cre показал, что Mesp1-экспрессирующие клетки инкорпорируются почти во все клетки предшественники сердечно-сосудистой системы (т.e., endothelium, endocardium, myocardium, and epicardium), как в эмбриональных, так и внеэмбриональных областях на ст. 9.5 dpc, и что экспрессия Mesp1 является самым ранним выявляемым маркером в клетках предшественниках сердца (Saga et al., [1999], [2000]). В данном исследовании мы описали детальный клональный анализ сердца мыши с использованием Mesp1-cre мышей. Мы показали, что клетки, не экспрессирующие Mesp1, вносят вклад в области, производные нервного гребня, а также в субнабор клеток в вентрикулярной CCS.
RESULTS
Lineage Analysis of Mesp1-Expressing Mesodermal Cells in the Developing Heart
Рис.1. | Transverse sections of -galactosidase (-gal) -stained Mesp1-cre:R26R or CAG-cre:R26R embryos at 13.5 days post coitum (dpc). A-B: The -gal-negative areas were observed in the region of outflow tract cushions (OTC; A; boxed area in A-1) and along the interventricular septum (IVS) in a pattern reminiscent of the ventricular cardiac conduction system (CCS; B; boxed areas, B-1 and B-2). C: atrioventricular cushions (AVC; boxed area in C-1) showed -gal activity. Original magnification, Ч100. Magnified images of OT cushion cells, the interventricular regions, and AV cushions are shown in A-1, B-1 and -2, and C-1, respectively. D: Transverse sections of -gal-stained CAG-cre:R26R embryos show no -gal-negative regions, suggesting that R26R expression was not shut down as Mesp1-nonexpressing cells differentiate. A magnified image in the interventricular regions is shown in D-1. E: Sectioning planes are illustrated and were counterstained with eosin. LV, left ventricle; RA, right atrium; RV, right ventricle. Scale bar = 100 m.
Mesp1-Nonexpressing Cells Along the Ventricular Septum Are Not Derived From the Neural Crest
Рис.2. | β-galactosidase (β-gal) staining in sections of the P0-cre:CAG-CAT-Z and the CCS-lacZ embryos at 13.5 days post coitum (dpc). A-C: In the P0-cre:CAG-CAT-Z embryo, high -gal activity is observed in the region of the outflow tract cushion (OTC; A, boxed area), but little activity is evident in the region of the atrioventricular cushion (AVC; C, boxed area). Original magnification, Ч40. Note that the -gal activity was not observed within the ventricle and the interventricular septum (IVS; B). D-F: The images in the boxed area are magnified. In the CCS-lacZ embryo, -gal activity is observed strongly in part of the atria (indicated by arrowheads) and along the IVS in a pattern reminiscent of the ventricular cardiac conduction system (CCS; boxed area). In contrast, -gal activity in either the OTC or AVC regions was barely detectable (D,F). The images in the boxed area are magnified. Sectioning planes of images A-C and D-F are the same as those illustrated in Figure 1E: A-C, respectively. All sections were counterstained with eosin. RA, right atrium; RV, right ventricle. Scale bar = 200 m.
Mesp1-Nonexpressing Cells Contribute to the CCS
Рис.3. | Comparison of -gal staining patterns between Mesp1-cre:R26R:CCS-lacZ triple hetero-embryos and Mesp1-cre:R26R embryos. A,B: Sections of the heart of the Mesp1-cre:R26R:CCS-lacZ embryo at 13.5 days post coitum (dpc). C,D: Compared with the Mesp1-cre:R26R embryo (boxes in C-2 and D-1), Mesp1-nonexpressing cells along the interventricular (IVS) were barely observed in the Mesp1-cre:R26R:CCS-lacZ triple hetero-embryos (A,B; boxes in A-2 and B-1). However, Mesp1-nonexpressing cells in outflow tract (OT) cushion regions were also detected, even in the triple hetero-embryos (box A-1). Original magnification, Ч100. The images in the boxed area are magnified. Sectioning planes of A, B, and C, D are the same as those illustrated in Figure 1E: B and C, respectively. Sections were counterstained with eosin. AVC, atrioventricular cushion; IVS, interventricular septum; RA, right atrium; RV, right ventricle; Scale bar = 100 m.
Рис.4. | Mesp1-nonexpressing cells contribute to a subset of the ventricular cardiac conduction system (CCS). Triple immunostaining for Mesp1-expressing cells (green fluorescent protein [GFP] -positive cells; green), cells of the ventricular CCS (LacZ-positive cells; red), and nuclei (4,6-diamidino-2-phenylindole [DAPI] staining; blue) in a Mesp1-cre:CAG-CAT-EGFP:CCS-lacZ embryo. All images shown are merged views, and double immunostaining of GFP and LacZ (a) and a triple immunostaining image with additional DAPI staining (b) are shown in some cases. A-D: A merged view of the interventricular (IVS) region at 13.5 days post coitum (dpc). The boxed area of the ventricular CCS in A was magnified as shown in B. Other sections derived from additional embryos are shown in C and D. The presence of red cells suggests that Mesp1-nonexpressing cells actually belong to the ventricular CCS, whereas some Mesp1-expressing cells also colocalize here (yellow). Typical images of mixed cell populations are shown in B and C, whereas a red cell-dominant section is shown in D. Original magnification, Ч400, except for A, which is Ч100. E,F: Merged view in the IVS region in an embryo at 17.5 dpc (E) or in a neonate (F). Original magnification, Ч400. Red cells (i.e., the Mesp1-nonexpressing cells belonging to the CCS) were observed even at later stages beyond 13.5 dpc. G: The region of the venous valves, which are proposed remnants of the embryonic sinoatrial (SA) ring, at 13.5 dpc. Almost all of the cells in this region were stained yellow, suggesting that the cells belonging to the venous valves are Mesp1-expressing. Original magnification, Ч200. Sectioning planes are those between B and C, illustrated in Figure 1E. AVC, atrioventricular cushion; LV, left ventricle; OTC, outflow tract cushion; RA, right atrium; RV, right ventricle.
Origin of Mesp1-Nonexpressing Cells
Рис.5. | Comparison of transverse sections of -gal stained Mesp1-cre:R26R embryos with CCS-lacZ embryos at an earlier stage. A: At 7.75 days post coitum (dpc) in Mesp1-cre:R26R embryos, we observed a few Mesp1-nonexpressing cells within the primitive heart tube (arrow head). Original magnification, Ч400. B: At 8.5 dpc, the regions of the Mesp1-nonexpressing cells in Mesp1-cre:R26R embryos, were observed more clearly (arrowheads). C: The -gal-positive regions (i.e., the cells belonging to the CCS) were observed mainly in the subendocardial myocardium of 8.5 dpc CCS-lacZ mouse (arrows). Original magnification, Ч200. D: Sectioning planes are illustrated. Sections were counterstained with eosin. EC, endocardium; RPH, right primitive heart tube; VC, ventricular chamber. Scale bars = 100 m.
DISCUSSION
В данном исследовании мы установили, используя Cre-loxP сайт-специфическую систему рекомбинации, что источник кардиальной мезенхимы подразделяется в соответствии с присутствием экспрессии
Mesp1. Мы продемонстрировали, что области, оккупируемые клетками, не экспрессирующими Mesp1, соответствуют двум самостоятельным популяциям клеток: одна происходит из клеток нервного гребня и др., которая вносит вклад в вентрикулярную CCS.
Comparison of the Cell-Lineages of Neural Crest Cells and Mesp1-Nonexpressing cells
В наших экспериментах с Mesp1-cre:R26R эмбрионами, мы установили, что клетки, происходящие из нервного гребня, являются негативными, а мезодермальные клетки, происходящие из Mesp1-экспрессирующих клеток, являются позитивными в отношении β-gal активности. Мы также подтвердили, что клетки кардиального нервного гребня млекопитающих являются Mesp1-негативными (Figs. 1, 2) и вносят вклад в мезенхиму OT подушек сердца. Эти наблюдения получены в результате клонального анализа клеток нервного гребня с использованием P0-cre:CAG-CAT-Z линии (Fig. 2) и они согласуются с ранее полученными результатами, с использованием Wnt1-cre:R26R двойных трансгенных мышей (Jiang et al., [2000]). Происхождение клеток AV подушек, как полагают, мезодермальное, т.к. эта область оккупируется Mesp1-экспрессирующими клетками (Fig. 1C). Этот результат согласуется с предыдущим исследованием Kisanuki et al. ([2001]) с использованием Tie2-cre мышей, которые сообщили, что происходят AV подушки в основном из эндокардиального слоя клеток. Т.о., мезенхимные клетки в OT подушках происходят в основном из клеток нервного гребня, а таковые в AV подушках происходят из эндокарда.
Важно, что мы наблюдали вторую популяцию клеток, не экспрессирующих Mesp1, вдоль IVS (Fig. 1B). Т.к. в эту область не вносится вклада клеток нервного гребня (Fig. 2B), то мы исследовали возможность, что эти Mesp1-nonexpressing клетки располагаются в вентрикулярной CCS. Прежде. чем изучить эту возможность мы сначала подтвердили, что неспособность экспрессировать β-gal у Mesp1-cre:R26R эмбрионов не обусловлена артефактом, таким как подавление LacZ экспрессии во время дифференцировки или мозаицизмом экспрессии Cre recombinase. Чтобы исключить первую возможность мы исследовали CAG-cre:R26R мышей, у которых Cre recombinase экспрессируется повсеместно и все клетки д.б. LacZ-позитивными. Мы не наблюдали каких-либо LacZ-негативных клеток в сердце, это указывало на то, что не происходит подавления LacZ во время клеточной дифференцировки (Fig. 1D). Чтобы исключить возможный мозаицизм Cre recombinase, мы повторили наш анализ на более чем 20 эмбрионах и наблюдали согласующиеся результаты, хотя некоторые клональные отличия могут существовать. Кроме того, когда мы скрещивали Mesp1-cre и CCS-lacZ линии и отслеживали R26R-зависимую экспрессию репортерного гена, то мы не наблюдали участков LacZ-негативных клеток в стенке желудочков. Т.о., по-видимому, мало вероятно, что мозаицизм R26R репортера м. объяснить наши результаты.
Что касается вклада клеток нервного гребня в вентрикулярную CCS, то сообщалось. что производные нервного гребня клетки наблюдаются вблизи CCS в IVS на ст. 14.5 dpc при использовании Wnt1-cre:R26R репортерной системы (Poelmann et al., [2004]). Т.о., возможность не может быть исключена, что клетки нервного гребня вносят вклад в CCS в IVS, хотя мы не смогли определить каких-либо β-gal-позитивных клеток в IVS в нашей P0-cre:CAG-CAT-Z системе. Расхождение может быть обусловлено различиями в использованных системах клонального анализа.
Origins of the CCS
Используя Mesp1-cre:R26R эмбрионов, мы идентифицировали популяцию клеток, не экспрессирующих Mesp1, которые распределяются в стенке вдоль межжелудочковой перегородки (Fig. 1B). Результаты генетических скрещиваний с с линией CCS-lacZ подтвердили, что эти Mesp1-nonexpressing клетки вносят вклад в вентрикулярную CCS (Fig. 3B). Чтобы подтвердить эти находки, мы генерировали тройных трансгенных Mesp1-cre:CAG-CAT-EGFP: CCS-lacZ мышей. Двойное окрашивание GFP и β-gal экспрессия и/или дополнительное DAPI окрашивание у таких мышей подтвердило, что Mesp1-nonexpressing клетки вносят вклад в примерно 20% вентрикулярной CCS (Fig. 4). Более того, эти популяции клеток могут быть различены на стадии, начиная с 7.75 dpc (Fig. 5), в то время как Mesp1 первоначально, хотя и временно экспрессируется на6.5 dpc (Saga et al., [1996]).
Задавание ритма и проводящая система сердца представлены SA узлом, AV узлом, AVB, веточками пучка и волокнами Пуркинье, каждый из которых отличается морфологически, функционально и молекулярно (Moorman and Christoffels, [2003]). Происхождение узелковой ткани менее ясно, чем происхождение вентрикулярной CCS, хотя первичный миокард считается кандидатом (Moorman and Christoffels, [2003]). Недавно было предположено, что некоторая часть работающего миокарда также может дифференцироваться в узелковую ткань, даже после рождения (Pashmforoush et al., [2004]). Хотя онтогенетические взаимоотношения между венозными клапанами и узелками ещё не полностью выяснены, но наши данные показывают, что большинство клеток венозных клапанов, которые как полагают являются остатками эмбрионального SA кольца (Rentschler et al., [2001]), происходят из Mesp1-экспрессирующих клеток (Fig. 4G). Однако, необходимы дальнейшие детальные исследования для определения точного клеточного происхождения узелков и их взаимоотношений с венозными клапанами.
В данном анализе мы сфокусировались на клеточных клонах вентрикулярной CCS и показали. что они имеют гетероцеллюлярное происхождение. Возникают две возможности, связанные с происхождением вентрикулярной CCS у мышей, оккупируемой клетками, не экспрессирующими Mesp1. Во-первых, возможно, что Mesp1-nonexpressing клетки в CCS не происходят из кардиомиоцитов. Напротив, эти клетки могут быть представлены кардиомиоцитами, которые просто не экспрессируют Mesp1. Мы склоняемся в пользу последней возможности. Эксперименты по отслеживанию клонов у кур убедительно продемонстрировали, что вентрикулярная CCS, включая волокна Пуркинье, происходит из кардиомиоцитов (rev. Mikawa, [1999]; Pennisi et al., [2002]). Более того, эксперименты у мышей также показали, что эмбриональные кардиомиоциты могут превращаться в CCS-подобный фенотипы в ответ на действие neuregulin-1, по крайней мере, когда испытываются с помощью позитивной регуляции CCS-lacZ трансгена (Rentschler et al., [2002]). Несмотря на это, необходим дополнительный анализ для определения основ молекулярной гетерогенности внутри вентрикулярной CCS и для определения не ассоциирует ли это с функциональным разнообразием этой структуры.
Итак, мы установили, что клетки, не экспрессирующие Mesp1, вносят вклад в вентрикулярную CCS помимо вклада в подушки OT. Более того, мы показали возможность, что популяция клеток, которая вносит вклад в вентрикулярную CCS может быть выявлена на ранней стадии развития. К сожалению, неясно из наших экспериментов, могут ли Mesp1-nonexpressing клетки вносить также вклад в др. регионы CCS, такие как SA или AV узлы. Схема, суммирующая взаимоотношения клеточных клонов в развивающемся сердце мышей, показана на Рис. 6. Наше наблюдение, что вентрикулярная CCS включает как Mesp1-expressing, так и -nonexpressing клетки является доказательством гетерогенной природы вентрикулярной CCS.
Рис.6. | Summary of the origin and cell-fate relationships of cardiac mesenchyme cell types. Each cardiac cell type is established by three distinct origins: neural crest cells, the mesodermal cells of Mesp1-expressing cells, and Mesp1-nonexpressing cells. It is noteworthy that both the Mesp1-expressing cells and the Mesp1-nonexpressing cells contribute to the ventricular CCS. In addition, the origins of the subset of the ventricular CCS that are contributed by the Mesp1-nonexpressing cells are distinguishable from that of the myocardium by the Mesp1 expression profile. We speculate that the Mesp1-nonexpressing cardiomyocyte may be a candidate for the origin of the subset of the ventricular CCS. [Color figure can be viewed in the online issue, which is available at http://www3.interscience.wiley.com/cgi-bin/fulltext/112162901/www.interscience.wiley.com.]
Сайт создан в системе
uCoz 