Как было установлено на мышах, ZP1 является чисто структурной, димеры которой создают мостики между филаментами, состоящими из последовательностей из ZP2 и ZP3 молекул. ZP2 и ZP3, как было установлено, взаимодействуют непосредственно с рецепторами на мембране спермиев после или перед AR, соотв. [4]. Демонстрация, что многие виды. включая и человека, содержат четвертый zona protein, ZP4, который отсутствует у мышей, стаивт вопрос о степени, с которой мышиная модель приложима к др. ZP4-содержащим видам. Наше исследование характеризует биоактивность человеческой ZP до и после оплодотворения. Мы собирали неоплодотворенные и оплодотворенные ооциты людей и физиологически оценивали этот материал.
По практическим и этическим причинам только неоплодотворенные и оплодотворенные ооциты, которые обычно выбрасываются в программе IVF, мбю.
использованы для экспериментов. Поэтому ооциты и зиготы культивировали в течение 48 ч прежде, чем принять решение об использовании их для экспериментов. Могут ли такие условия отвечать за неопределенные или сомнительные физиологические значения измерения биоактивности ZP? Ранее было показано, что неоплодотворенные ооциты, собранные после неудачи при IVF, могут быть использованы для изучения спермий-ZP взаимодействий [17]. В нашем исследовании неоплодотворенные ооциты были зрелыми, но не наблюдалось пронуклеуса спустя 18 ч после осеменения и не обнаруживалось дроблений в течение 48 ч. Более того, мы контролировали, что возникает ZP2 протеолиза в неоплодотворенных ооцитах. Напротив оплодотворенные ооциты определялись по присутствию, по крайней мере, 3 PN спустя 18 ч после оплодотворения или по присутствию 2 PN, но аномальному дроблению после 48 ч, при этом ZP2 расщеплялся на две полосы 70 и 30 kDa, что означает ограниченный протеолиз, скорее всего обусловленный экзоцитозом кортикальных гранул [18]. Следовательно, мы были уверены, что используемый материал соответствовал неоплодотворенным ооцитам или оплодотворенным зиготам.
Fertilised human ZP may bind spermatozoa and induce acrosome reactions but are not penetrated by sperm
У мышей сперматозоиды не соединяются с оплодотворенными ооцитами, а ZP3 белок, очищенный из двухклеточных эмбрионов, не может индуцировать AR в мышиных сперматозоидах [4]. Неожиданно мы обнаружили, что zona pellucida оплодотворенных ооцитов человека сохраняет способность связывать сперматозоиды, хотя примерно с вдвое меньшей эффективностью, чем zona неоплодотворенных ооцитов и была способна индуцировать приток кальция внутрь спермиев с той же самой амплитудой, что и hZP из неоплодотворенных ооцитов. Сперматозоиды, соединяющиеся с оплодотворенными ооцитами были найдены, как с реактивированными, так и интактными акросомами. Известно, что сперматозоиды с реактивированными акросомами обладают сильно пониженной или нулевой способностью непосредственно соединяться с ZP [19]. Следовательно, можно предположить, что сперматозоиды с реактивированными акросомами. наблюдаемые на оплодотворенной ZP имели интактные акросомы перед присоединением к ZP, и подверглись AR после контакта с hZP. Полученные данные указывают на то, что (1) hZP оплодотворенных ооцитов способна связывать спермии и индуцировать AR (подтверждено также тестом с использованием растворенной ZP от оплодотворенных ооцитов) и (2) сперматозоиды с реактивированными акросомами остаются прикрепленными к оплодотворенной ZP несмотря на расщепление ZP2. Т.о., человеческие гликопротеины, участвующие в связывании спермиев и индукции AR - преимущественно ZP4 (ZPB) и ZP3 (ZPC) [12,13] - по-видимому, сохраняют функциональность после оплодотворения. Это оригинальное мнение нашего исследования противоречит наблюдениям на мышах, показавших, что оплодотворение модифицирует ZP, предупреждая связывание спермиев и индукцию AR. ZP мышиных эмбрионов безусловно неспособна индуцировать AR в сперматозоидах мышей, в экспериментах с использованием очищенных ZP3 от эмбрионов в качестве индукторов [3] не выявлено непосредственно модификаций после оплодотворения мышиного ZP3. Т.о., взаимодействие мышиных гамет, по-видимому, не моделирует ситуацию у людей соотв. образом. Может ли дополнительный гликопротеин, ZP4, присутствующий в ооцитах человека объяснить подобные различия? Действует ли ZP4 индивидуально или в виде гетерокомплекса с ZP3, как это описано у боровов [10]?
В нашем исследовании биохимический анализ hZP, собранных после оплодотворения подтвердил, что ZP2 расщепляется, показывая, что связывание спермиев и AR могут возникать независимо от того, расщеплен или нет ZP2. Используя модельные химерные мышь-человек ооциты, полученные с помощью трансгенеза, Rankin et al. [20] предположили, что связывание спермиев является функцией супрамолекулярной структуры ZP, модулируемой с помощью статуса расщепления ZP2, при этом связывание спермиев происходит, когда ZP2 не расщеплен, но не тогда, когда ZP2 расщеплен. Наши наблюдения связывания спермиев с zona pellucida, когда оплодотворенные ооциты человека с расщепленным ZP2 были повторно осеменены, указывают на то, что модель Rankin's, хотя и соответствует ооцитам с тремя zona гликопротеинами, но не пригодна для видов с 4 зональными белками, как у людей.
Интактные hZP от оплодотворенных и неоплодотворенных ооцитов человека одинаково эффективны по индукции AR, со сходным уровнем, характерным для неоплодотворенных ооцитов [21]. Напротив, величина растворенной ZP-индуцированная AR, измеренная в данной работе, была вдвое выше (ΔAR = 40%)? чем описанная ранее (ΔAR = 20%) [22,23]. Это различие может возникать из-за разных экспериментальных условий (время capacitation, инкубационная среда...) или из-за зондов, использованных для выявления AR. Мы использовали анти-CD46 антитела в купе с проточной цитометрией для измерения растворенной hZP-индуцированной AR, а не PSA lectin мечение, широко используемое в др. исследованиях. Т.к. PSA lectin не очень удобный зонд для измерения AR с помощью проточной цитометрии [24], поэтому мы выбрали анти-CD46 антитела, которые дают для клеток с реактивированными акросомами высокий пик флюоресценции, отличимый от пиков интактных клеток [25]. Тогда как флюоресцентные пики с интактными и реактивированными акросомами более или менее перекрываются при использовании PSA lectin окрашивания [26,27].
Наши эксперименты с более чем 80% оплодотворенных ооцитов, ко-инкубированных с capacitated сперматозоидами, не имели спермиев в своих ZP. Это указывает на то, что оплодотворенные ооциты человека не пенетрируются спермиями и это согласуется с мышиной моделью [4,28]. Это ингибирование пенетрации спермиев может быть пл времени скоррелировано с протеолитическим расщеплением ZP2, выявляемым после оплодотворения у мышей [29] и людей [our study].
Итак, события с помощью ZP связывания спермиев и индукции AR и проникновения через zona могут быть разделены у людей. Основной ступенью блокирования полиспермии д.б. ингибирование пенетрации спермиев с реактивированными акросомами через зону после оплодотворения. Некоторые архитектурные изменения после оплодотворения могут провоцировать затвердение zona, что делает её устойчивой к лизису акросомальными энзимами.
ZP-induced calcium influx in human capacitated spermatozoa is biphasic and involves voltage-dependent channels
Среди разных функций ZP, проанализированных в данной работе, мы уделили особое внимание индуцированному ZP притоку кальция в сперматозоиды. Эта функция не была изучена для ZP человека. за исключением рекомбинантного ZP3 в качестве индуктора [5,6]. Получена детальная информация об увеличении в спермиях кальция, индуцированном растворенной hZP. После дизагрегации с помощью кислоты она сохраняет способность индуцировать внутриклеточное увеличение концентрации кальция, как сообщалось и ранее относительно индукции AR [30-32].
Приток кальция, индуцируемый растворенной hZP, обнаруживает количественные и качественные аспекты, сходные с теми, что описаны для др. видов. Используя спектрофлюорометрию, мы установили, что кальций отвечает на hZP бифазно или монофазно в зависимости от выборки. Предыдущие исследования с использованием спектрофлюорометрии и сходных зондов показали, что реакция Ca2+ на растворенную мышиную ZP [33] или рекомбинантный hZP3 [5,6] бифазная с первым преходящим пиком и второй устойчивой фазой. Однако, в 9 из 21 случая, проанализированных в данной работе, реакция кальция выглядела монофазной лишь с единственным устойчивым увеличением концентрации кальция. Или временный пик кальция не происходит или он развивается настолько быстро, что не фиксируется в наших условиях. Если инициальный пик длится 200 ms как у мышей [16], то развитие пика д. быть слишком быстрым, чтобы быть зафиксированным и это могло бы объяснить предыдущие сообщения о монофазном увеличиении концентрации кальция в ответ на ZP у крупного рогатого скота [34] и у мышей [14,35]. Однако, Shirakawa and Miyazaki [36] не выявили преходящего пика кальция с записью, сделанной с 0.3-second интервалами в головках спермиев хомячков после добавления растворенной ZP. Эти результаты и наши указывают на то, что устойчивый приток кальция, удерживающий высокий [Ca2+]i в течение достаточно длительного периода, может быть достаточным для запуска AR. Значение устойчивой фазы в индукции AR иллюстрируется также с помощью сходных уровней AR, индуцируемых hZP в выборках спермиев с монофазными и двухфазными реакциями calcium.
Реакция кальция на растворенную человеческую ZP чувствительна к pimozide (подавление более 80%), подтверждает, что VOCC участвует в этих ионных событиях. T-type VOCC активность с использованием Cay3.2 каналов, в частности, ассоциирует с AR у людей [37,38] и было показано, что ZP-индуцируемое поступление кальция и AR зависят от T-type VOCC у мышей
[39].
Conclusion
One of the major findings of this study is that human ZP retains its ability to bind spermatozoa, and to induce intraspermatic calcium influx and AR after fertilisation even if sperm penetration through fertilised ZP is strongly inhibited. The ZP-induced influx of calcium into human spermatozoa follows similar kinetics and has a similar sensitivity to VOCC inhibitors to that observed in response to solubilised ZP or purified ZP3 in mouse spermatozoa. The ZP bioactivity is not abolished by fertilisation, despite modification of the biochemical status of ZP2, from an uncleaved to a cleaved form. Compared to the mice model, this difference of ZP bioactivity could be linked to the presence of ZP4, which is not produced in mice. Thus, the place of ZP4 in the hZP matrix, its relation to other hZP glycoproteins, its function in the primary steps of gamete interaction (e.g. sperm binding/AR induction), and its modification after fertilisation require further study in humans.
Nomenclature used
We adopted the nomenclature recently proposed by Conner et al. [40], which follows the proposals of the NCBI committee. The four ZP genes are named ZP1, ZP2, ZP3 and ZP4, and encode proteins ZP1 to ZP4, respectively. The ZP2, ZP3 and ZP4 genes correspond to the ZPA, ZPC and ZPB genes, respectively, in Harris' nomenclature [41].
Сайт создан в системе
uCoz