Ataxia-telangiectasia: from a rare disorder to a paradigm for cell signalling and cancer
Martin F. Lavin Nature Reviews Molecular Cell Biology 9, 759-769 (October 2008) | doi:10.1038/nrm2514
First described over 80 years ago, ataxia-telangiectasia (A-T) was defined as a clinical entity 50 years ago. Although not encountered by most clinicians, it is a paradigm for cancer predisposition and neurodegenerative disorders and has a central role in our understanding of the DNA-damage response, signal transduction and cell-cycle control. The discovery of the protein A-T mutated (ATM) that is deficient in A-T paved the way for rapid progress on understanding how ATM functions with a host of other proteins to protect against genome instability and reduce the risk of cancer and other pathologies.
Elena Boder, пионер в области исследований ataxia-telangiectasia (A-T), описала A-T как "mysterious from the start - an entity easily diagnosed on purely clinical grounds, often by inspection - but elusive for a long time" (Ref. 1). A-T впервые была описана Syllaba и Henner2 и окончательно описана, с использованием атописии, как самостоятельное заболевание Boder and Sedgwick3. A-T является аутосомно рецессивным заболеванием, которое характеризуется ранним началом прогрессирующей мозжечковой атаксии, oculocutaneous телеангиэктазиями, чувствительностью к бронхопульмональным заболеваниям и лимфоидными опухолями1. И некоторые др. аномалии также ассоциируют с этим заболеванием, включая отсутствие или рудиментарный тимус, иммуннонедостаточность, прогрессирующая apraxia движений глаз, резистентный к инсулину диабет, клиническая и клеточная радиочувствительность, дефекты клеточного цикла и хромосомная нестабильность4.
Гены, которые дефектны при A-T, A-T mutated (), локализуются в хромосоме 11q22-23 (Ref. 5) и клонированы с помощью позиционного клонирования6. ATM является Ser/Thr протеин киназой и является членом семейства phosphoinositide 3-kinase (PI3K)-related protein kinase (PIKK), которое включает ATM и Rad3-related protein (), каталитическую субъединицу DNA-dependent protein kinase (DNA-PKcs) и SMG1, протеин киназу, которая участвует в реакции на повреждения ДНК7 , но также необходима для nonsense-обусловленного распада мРНК, которые содержат кодны преждевременного окончания8. Киназный домен локализован вблизи С конца во всех этих белках, за исключением SMG1, в которой киназный домен расположен центральнее. Этот домен обладает протеин киназной активностью и p53 является первым идентифицированным субстратом для ATM in vitro и in vivo9-11. Это не является неожиданностью, т.к. стабилизация и активация p53 дефектна в A-T клетках и эти клетки также характеризуются дефектным G1-S checkpoint, в котором p53 играет центральную роль12,13. ATM имеет множество субстратов - недавний протеомный анализ phosphoproteins, индуцируемых с помощью повреждений ДНК, показал, что ATM и ATR сеть может состоять из более чем 700 субстратов14,15. ATM содержит также ряд др. доменов, включая FAT домен - который является общим для ATM, mammalian target of rapamycin (mTOR) и для transformation/transcription domain-associated protein (TRRAP)16 - и крайний С-терминальный FATC домен, который обнаруживается в комбинации с FAT в этом подсемействе белков (Box 1). Остальными доменами являются N-терминальный субстрат-связывающий домен, Leu zipper, Pro-rich область, которая способна связываться с ABL киназой17 и peroxisomal targeting signal sequence (PTSI).
ATM ассоциирует с -- (MRN) комплексом как часть процесса его активации и этот комплекс затем действует как для ATM-зависимого фосфорилирования, по крайней мере, некоторых из нижестоящих субстратов. Описаны также нарушения для гипоморфных мутантов двух членов этого комплекса: Nijmegen breakage syndrome (NBS1 мутанты) и A-T-like disorder (MRE11 мутанты)18-21. Хотя все три синдрома являются самостоятельными, они обладают некоторыми клиническими симптомами и клеточными характеристиками A-T-like disorder (ATLD), имеющих очень близкий фенотип к A-T (Box 2).
В начале 1980s, большинство исследований A-T концентрировалось на характеристике A-T клеток и на предварительных доказательствах дефектов контроля клеточного цикла. Снижение ингибирования синтеза ДНК или было описано в A-T клетках в лаб. Lavin и Painter22,23, чьи методы были приняты в качестве стандарта для измерения intra-S-phase checkpoint. Он всё ещё используется для этих целей. Продло более 10 лет, чем оказались распознанными др. дефекты checkpoints клеточного цикла в A-Tклетках. Наиболее впечатляющей оказалась неспособность активировать G1-S checkpoint, это было связано с дефектной реакцией p53 на радиацию в A-T клетках12,13. Впоследствии было показано, что дефекты клеточного цикла распространяются и на G2-M checkpoint24. В ретроспективе, аномальное прохождение клетками через клеточный цикл было задокументировано для A-T клеток значительно раньше, но это поведение не было связано с checkpoints клеточного цикла per se25.
Прогресс в направлении идентификации дефектного гена при A-T затруднялся описанием пяти в этих клеточных исследованиях26. Это было установлено с помощью слияния между нормальными и A-T клетками и с помощью метода для коррекции радиорезистентного синтеза ДНК и индуцированных радиацией хромосомных аберраций. Gatti с коллегами локализовали A-T ген(ы) в хромосомной области 11q22-23 , используя анализ генетического сцепления в 31 A-T семье5. Это стало предвестником многочисленных работ по позиционному клонированию в нескольких лаб., которые первоначально были медленными из-за очевидной гетерогенности A-T и нехватки генетических маркеров в этой области хромосомы 11. Исчерпывающее клонирование и физическое картирование и генерация карт высокой плотности сузило область A-T гена(ов) до менее, чем 500 kilobases (kb)27. Было идентифицировано несколько генов кандидатов и один из них, ATM, как было установлено мутантен во всех комплементационных группах6,28. Идентификация одиночного гена отменило предположение о существование нескольких комплементационных групп, но не дало объяснения их обнаружения в ранних исследованиях. Ген ATM , как было показано, занимает 160 kb геномной ДНК, кодируя транскрипт в 13 kb из 66 экзонов, при этом отсутствуют доказательства разных сплайс-форм29. 432 уникальные мутации были описаны для ATM, которые захватывают всю длину гена (see the Leiden Open Variation Database; further information). Большинство мутаций у A-T пациентов являются укорочениями или мутациями сплайс-сайтов, которые дают короткие, нестабильные ATM белки. Большинство ATM мутаций являются уникальными для отдельный семей, компаундные гетерозиготы и эффект основателя наблюдался во многих популяциях, включая Moroccan Jews, Costa Ricans, Norwegians, Turkish, Russians and Polish30.
ATM and DNA DSB repair
Гиперчувствительность к ионизирующей радиации (рентгеновские, гамма лучи) описана у A-T пациентов после радиотерапии рака31 и в культуре A-T клеток32,33. ATM активируется с помощью ДНК DSBs и сигнализирует checkpoint клеточного цикла, чтобы тот замедлил прохождение клеток через клеточный цикл, для облегчения репарации ДНК4. Вполне возможно, что ATM также передает сигналы аппарату репарации ДНК, участвуя таким образом в репарации двойных разрывов ДНК. Хотя и не обнаруживается существенных дефектов в репарации DSBs ДНК в A-T клетка, но гель электрофорез в пульсирующем поле и потеря γH2AX фокусов указывают на дефекты репарации небольших фракций разрывов34,35. Эти фокусы показывают накопление белков в ответ на повреждения ДНК в сайтах повреждений ДНК. Клетки. дефицитные по репарации могут репарировать DSBs ДНК медленно в течение нескольких дней, но в A-T клетках небольшая пропорция разрывов персистирует даже после длительного периода времени36. Свыше 90% DSBs репарируется с помощью NHEJ в G1 фазе клеточного цикла с помощью ATM-независимого механизма.
Однако субнабор разрывов ДНК нуждается в процессинге с помощью нуклеазы Artemis, ступень процессинга, которая зависит от ATM, который фосфорилирует Artemis в ответ на повреждение ДНК34. Первоначально было предположено, что этот субнабор разрывов является тем, что возникает в результате более сложных повреждений ДНК и не поддается ДНК репарации34. Однако недавние результаты показали, что сложность может быть связанной скорее хроматиновым окружением, чем с природой повреждений37. Эти результаты указывают на то, что в отсутствие ATM, сохраняющиеся DSBs ДНК локализуются в гетерохроматине. Т.о., ATM , по-видимому, облегчает проникновение аппарата репарации ДНК в за счет фосфорилирования корепрессора транскрипции Kruppel-associated box (KRAB)-associated protein-1 (KAP1) (Ref. 37). Полное отсутствие ATM , как ожидается, д. приводить к появлению фракции не репарированных DSBs ДНК. Персистенция DSBs ДНК, которая индуцируется эукариотической самонаводящейся эндонуклеазой I-PpoI в ATM-нулевых клетках и после истощения ATM, также подтверждает дефект репарации при A-T38. Редуцированная способность репарировать эти резидуальные разрывы может быть объяснена повышенной радиочувствительностью, которая наблюдается при A-T36. Компоненты ATM-сигнального пути(ей) , которые вносят вклад в защиту клеток от DSBs ДНК, неизвестны. Yazdi et al.39 показали, что избыточная экспрессия сайта фосфорилирования мутантов SMC1 (structural maintenance of chromosomes protein-1; субстрата для ATM) сенсибилизирует эти клетки к радиации, подтверждая, что передача сигналов посредством SMC1 играет важную роль в защите клеток против повреждений ДНК. Это в дальнейшем было подтверждено наблюдениями, что фибробласты от SMC1-Ser957Ala/Ser966Ala-мутантных мышей обнаруживают повышенную радиочувствительность и пониженную скорость исчезновения хромосомных разрывов после облучения40.
Lymphocyte development. ATM отвечает также на физиологические разрывы в ДНК во время развития и дифференцировки B и T клеток41. Bredmeyer et al.42 показали, что ATM действует для устранения DSBs ДНК, которые генерируются во время . Согласуется с этим и роль ATM в поддержании эффективного Vα-Jα-кодируемого соединения концов, как было показано на double-позитивных тимоцитах43. Кроме того, повышенное накопление не репарированных кодирующих концов во время разных ступеней сборки гена ангиогенного рецептора как для immunoglobulin , так и для локусов Т-клеточных рецепторов, было описано в ATM-дефицитных B и T лимфоцитах42. в
Лимфоциты тимуса, которые возникают у ATM-мутантных мышей, не обладают транслокациями, которые используют Т-клеточный рецептор и поэтому скорее всего ATM контролирует др. процессы в этих клетках. Конституитивная активация JUN N-терминальной киназы в макрофагах от ATM-дефицитных мышей вместе с др. возможными аномалиями, может вносить вклад в наблюдаемые дефекты. ATM локализуется на V(D)J-рекомбинацией индуцированных DSBs ДНК44 и играет ключевую роль в поддержании экспрессии T-cell receptor-α (TCRα) во время рекомбинации45. Нарушение экспрессии TCRα и дефекты созревания double-позитивных Т клеток редуцирует количество зрелых тимоцитов у ATM-мутантных мышей. Дефицит ATM нарушает также class-switch рекомбинацию иммуноглобиновых генов41, а T- и B-клеточные предшественники у Atm-/- мышей обнаруживают снижение обычных кодирующих соединений (coding joins) и высокую частоту аномальных гибридных соединений между сигнальными концами и кодирующими концами во время инверсионных перестроек42. Эти данные предоставляют дальнейшие доказательства увеличения полу-жизни разрывов ДНК в таких локусах незрелых Т и В клеток. Эти данные дают также механистическое объяснение увеличивающегося количества хромосомных аномалий в Т и В клетках A-T пациентов и склонности к возникновению лимфоидных новообразований43. Свыше 30% пациентов с A-T имеют лимфоидные опухоли.
Играет ли ATM роль вне ядра? Хотя ATMпо преимуществую ядерный белок, который реагирует на DSBs ДНК и передает сигналы checkpoints клеточного цикла и путм репарации ДНК, однако имеются также доказательства существования цитоплазматической формы, которая ассоциирует с и 46, 47 (Box 3). Растет число подтверждений более общей сигнальной роли ATM, которая не участвует непосредственно в повреждениях ДНК. Серия аномалий ATM-дефицитных клеток предоставляет косвенные указания роли ATM вне ядра48. Эти аномалии включают снижение интернализации phytohaemagglutinin (PHA), дефектную мобилизацию Ca2+, деполяризацию в ответ на внеклеточные K+, снижение продолжительности действия Ca2+ и Na+, более высокую потребность в ростовых факторах и дефектную передачу сигналов через рецепторы epidermal growth factor (EGF). Более прямые доказательства демонстрируют способность инсулина активировать ATM, как было показано с помощью фосфорилирования 4EBP1 и последующей диссоциации eukaryotic translation-initiation factor (eIF)4E от 4EBP1, делая тем самым его доступным для инициации трансляции мРНК49. Диссоциация этого комплекса дефектна в A-T клетках.
Insulin resistance and metabolic syndrome. Согласующимся с этими результатами является наблюдение, что некоторые A-T пациенты приобретают резистентный к инсулину диабет50,51. Эта аномалия наблюдается также при метаболическом синдроме. Потеря одного или обоих аллелей Atm усиливает признаки метаболического синдрома у ApoE-/- мышей на диете с высоким содержанием жира52. Воздействие Chloroquine снижает атеросклероз и кровяное давление и улучшает толерантность к глюкозе ATM-зависимым способом у таких мутантных мышей. Эти результаты указывают на то, что chloroquine усиливает активность ATM, чтобы защитить от метаболического синдрома и резистентности к глюкозе. В самом деле chloroquine и др. агенты, которые изменяют структуру хроматина, могут вызывать частичную активацию ATM в отсутствие DSBs ДНК53. Хотя эти данные подчеркивают роль цитоплазматической ATM в этом процессе, они не исключают перемещения ATM из ядра. в
Neurodegeneration. Прогрессивная нейродегенерация, обусловленная потерей обнаруживает довольно заметный эффект на A-T пациентов1. Обусловлен ли этот нейрональный эффект дефектной реакцией на DSBs ДНК трудно проанализировать, т.к. ранние наблюдения показали, что ATM преимуществено цитоплазматический в нервных клетках54.Недавно Biton et al.55 показали, что ATM является преимущественно ядерным в нейрон-подобных клетках людей и что ATM-обеспечиваемая реакция является настолько выраженной, как и в пролиферирующих клетках55. Нокдаун ATM устраняет эту реакцию, Сходные результаты получены на нейронах мозжечка мышей, в которых ATM в основном ядерная и активация ATM, измеренная по и сравнима с таковой в др. клеточных линиях56. Это подтверждается генетическими доказательствами, показывающими, что MRE11 облегчает активацию ATM на DSBs ДНК, и что пациенты, которые являются гипоморфными по мутации в MRE11 (пациенты с ATLD) имеют нейрональный фенотип, который сходен с таковым при A-T57.
Activation of ATM
Быстрое рекрутирование белков распознавания и репарации повреждений ДНК на определенные фокусы наблюдается в ответ на агенты. которые повреждают ДНК или вызывают арест или коллапс вилки репликации ДНК58,59. Хотя это рекрутирование быстрое, порядок, в котором эти белки локализуются в местах повреждений ДНК, все-таки был установлен. DSBs ДНК ведут к накоплению комплексов MRN, сохранение которых на хроматине зависит от mediator of DNA-damage checkpoint protein-1 (MDC1) адапторного белка (Fig. 1). Это сохранение с помощью MDC1 увеличивает локальную концентрацию MRN комплекса на местах DSBs ДНК. ATM также добирается рано на места повреждений, первоначально ассоциируя в регионами ДНК, которые по флангам разрыва, до ассоциации с MRN комплексом в месте разрыва посредством C конца NBS1 (Refs 38, 60).
Взаимодействие MDC1 посредством своего с ATM регулирует накопление ATM на месте повреждения. MDC1 обеспечивает также взаимодействие между ATM и γH2AX, которое прежде всего вносит вклад в дальнодействующее фосфорилирование H2AX и в поддержание реакции59.Учитывая ключевую роль ATM в обеспечении передачи сигналов от DSBs ДНК, не удивительно, что его активация тонко контролируется. Скорее всего, что ATM, по крайней мере, частично активируется соседними к DSBs ДНК38, возможно благодаря инициальной реляксации структуры хроматина при разрыве. Активация ATM с помощью chloroquine, histone deacetylase ингибиторов или гипотонического буфера подтверждает эту гипотезу53. Однако ATM, который активируется с помощью этих факторов не локализуется в ядерных фокусах и неспособен фосфорилировать H2AX, но он способен фосфорилировать p53, это указывает на то. что ATM д. быть локализован на разрыве, для полной активации. Полная активация и локализация ATM на DSBs ДНК облегчается MRN комплексом38.
The role of the MRN complex. Комплекс MRE11-RAD50 соединяется с ДНК как гетеротетрамер, закрепляя разованные концы DSB61. Это связывание достигается благодаря двум ДНК-связывающим мотивам MRE11, которые располагаются в виде глобулярного домена с RAD50 Walker A и Walker B нуклеотид-связывающими мотивами ()62. Образование мостиков между молекулами ДНК достигается посредством Cys-X-X-Cys последовательностей в области крюка RAD50 (Fig. 2). Последовательности Cys-X-X-Cys располагаются на концах двуспиральных (coiled-coil) областей и, как полагают, димеризуются посредством координации Zn2+ иона63. Динамическая архитектура MRN комплекса изменяется при связывании ДНК, чтобы создать параллельную ориентацию coiled-coils RAD50, препятствуя тем самым взаимодействию внутри комплекса и способствуя ассоциации между комплексами64. Ассоциация с RAD50 стимулирует как , так и активности MRE11 (Ref. 65), а NBS1 стимулирует его эндонуклеазную активность66. Однако др. нуклеазы, такие как Artemis, также, , по-видимому, играют роль в процессинге DSB, по крайней мере, в подгруппе разрывов с поврежденными окончаниями34. в
Комплекс MRN функционирует как сенсор DSBs ДНК ине нуждается в ATM для MRN ассоциации с местами повреждений ДНК67. Доказательства роли MRN выше ATM получены в исследованиях NBS и ATLD клеток (которые являются гипоморфными для членов комплекса) и клеток, в которых комплекс MRN истощался за счет вирусной инфекции, а также из исследований in vitro с использованием рекомбинантных белков и из экстрактов Xenopus laevis , которые были реконструированы для передачи сигналов от разрывов ДНК. Активация ATM задерживается в NBS и ATLD клетках в ответ на DSBs ДНК68. На NBS1 конструкции, NbFR5, который сохраняет MRE11-связывающий сайт, стимулирует активацию ATM69. Наиболее распространенная мутация NBS (657Delta5, 5-base-pair делеция, которая дает гипоморфный аллель) генерирует два фрагмента из NBS1 белка70, N-концевой фрагмент, содержащий MRE11-связывающий сайт и С-терминальный фрагмент, содержащий законсервированный домен, который ответственен за рекрутирование ATM71. NBS клетки, которые экспрессируют NbFR5DeltaATM, который лишен ATM-связывающего сайта, обнаруживают драматически пониженные уровни активации ATM72.
Post-translational modifications. Как было показано выше, ATM подвергается аутофосфорилированию, по крайней мере, по трем сайтам (Ser367, Ser1893, Ser1981), один из которых, по-видимому, служит орудием мономеризации и активации ATM53,73. Активация ATM с помощью okadaic кислоты указывает на то, что phosphatase активность важна для поддержания ATM в базовом состоянии74. ATM ко-иммунопреципитируется с protein phosphatase-2A (PP2A) в неповрежденных клетках, но это взаимодействие устраняется в ответ на DSBs ДНК, это и делает возможным затем аутофосфорилирование ATM. Вторая фосфатаза, WIP1,может дефосфорилировать ATM in vitro как по Ser367, так и по Ser1981 сайтам, а дефицит этого энзима вызывает позитивную регуляцию ATM75. Третья phosphatase, PP5, ко-иммунопреципитируется с ATM в клетках с поврежденной ДНК, доминантно-interfering форма PP5 ингибирует и активацию ATM и фосфорилирование ATM нижестоящего субстрата76.
Фосфорилирование является не только пост-трансляционной модификацией, которая изменяет активность ATM. Sun et al.77 показали, что DSBs ДНК индуцируют ацетилирование ATM параллельно с аутофосфорилированием Ser1981. Избыточная экспрессия доминантно-негативной формы TIP60 acetyltransferase снижает уровни как ацетилирования, так и аутофосфорилирования ATM, снижая ATM-киназную активность, сенсибилизируя клетки к радиации. Одиночный сайт ацетилирования идентифицирован как Lys3016, внутри С-терминального домена FATC и рядом с киназным доменом ATM78. Мутация Lys3016 предупреждает позитивную регуляцию активности ATM с помощью повреждения ДНК, ингибируя мономеризацию неактивного ATM димера и предупреждая ATM-зависимое фосфорилирование p53 и checkpoint kinase-2 (CHK2).
Какова же роль аутофосфорилирования ATM? Существуют доказательства, что аутофосфорилирование является скорее следствием. чем причиной активации ATM в клетках мышей79. Эта группа использовала систему восстановления bacterial artificial chromosome (BAC) , чтобы генерировать ATM-Ser1987Ala (мышиный эквивалент Ser1981Ala) мутантов, экспрессирующихся на Atm-/- фоне. Клетки таких мышей обнаруживали нормальные уровни индуцируемого повреждениями ДНК фосфорилирования некоторых ATM-зависимых субстратов, включая SMC1, CHK2 и p53. Они также показали, что эти клетки не были гиперчувствительными к радиации и что активация как intra S phase, так и G2-M-phase checkpoints была нормальной. Pellegrini et al.79 также установили, что усиление сохранения ATM-Ser1987Ala происходит в местах повреждений ДНК. Это , по-видимому, не согласуется с соединением с I-PpoI-индуцированными DSBs ДНК, с которыми не способны связываться ни ATM kinase-dead, ни ATM-Ser1981Ala38. В др. сообщении было показано, что активация ATM безразлична для рекрутирования на разрывы ДНК60. Это исследование постулирует, что хотя дикого типа и мутантный ATM может рекрутироваться вдоль поврежденного хроматина, но ATM мутанты, которые не могут быть активированы, постепенно диссоциируют с хроматина60. в
Тем не менее разные наблюдения рекрутирования ATM, выявили существенные различия между значением аутофосфорилирования ATM и нижестоящей передачей сигналов по детерминации состояния радиочувствительности контроля клеточного цикла у людей и мышей. Было предположено, что увеличенные размеры пула ATM в области разрыва достаточны для активации ATM без необходимости в аутофосфорилировании79. Эти данные подтвердили, что или существуют фундаментальные различия в механизме активации ATM у двух видов или ATM-мутантные мыши, которые были получены путем восстановления BAC, отличаются от тех, что получаются с помощью обычной методологии. Более того, как и в случае DNA-PKcs, уровень белка ATM достоверно ниже у мышей (M. Kastan, personal communication). Однако имеются примеры на клетках человека, в которых ATM может быть активирован без фосфорилирования Ser1981 (Refs 80, 81). Это, по-видимому, обусловлено природой используемого стимула.
The ATM-dependent signalling cascade
Assembly of DNA-damage-response proteins. Активация ATM ведет к быстрому фосфорилированию множественных белков, которые участвуют в репарации ДНК, активации checkpoint клеточного цикла и транскрипции82,83. Серия крупномасштабных протеомных исследований идентифицировала обширную сеть phosphoprotein, которые были чувствительны к повреждениям ДНК14,15,84. В этих исследованиях, было идентифицировано 900 индуцированных фосфорилирований консенсусных сайтов ATM и ATR у более, чем 700 белков. Эти белки были обнаружены организованными во взаимодействующие модули, которые участвуют в репарации, репликации ДНК и контроле клеточного цикла14. Вряд ли вероятно, что все эти фосфорилиования являются непосредственными субстратами для ATM и могут зависеть и от др. PIKKs. Мы сконцентрировались на ATM субстратах, которые участвуют в репарации ДНК и активации checkpoint
Хотя серии событий, которые появляются после активации ATM быстры. оказалось возможным подразделить субстраты фосфорилирований по их положению в каскаде, по их роли в умножении сигнала и по их необходимости для MRN. Как было упомянуто выше, очевидно, что ATM ассоциирует с ДНК/хроматином вблизи DSB, где он, по крайней мере, частично активируется38,60. В этом случае, ATM не нуждается в рекрутировании на MRN комплекс на разрыве. При низких дозах радиации (1-3 Gy), ATM аутофосфорилирование и фосфорилирование Ser15 p53 являются максимальными, это указывает на отсутствие корреляции с дозой46. Агенты, которые изменяют структуру хроматина, активируют ATM и вызывают фосфорилирование p53, но неспособны вызывать фосфорилирование SMC1, NBS1 и др. субстратов. Диффузное ядерное окрашивание фосфорилированного Ser15 p53 согласуется с этими данными40,53. Кроме того, в клетках от NBS пациентов, ATM-зависимое фосфорилирование CHK2 и др. субстратов дефектно, но диффузное ядерное окрашивание по фосфорилированию p53
Хотя p53 и ATM сами по себе являются лишь определенными субстратами для ATM во время независимой от разрывов активации ATM, вполне возможно, что существуют и др. субстраты. Некоторые из них могут выполнять роль по предупреждению метаболического синдрома. Применение chloroquine к Atm+/- мышам на APOE-нулевом фоне понижет кровяное давление, усиливает толерантность к глюкозе, супрессирует активность JNK и снижает индуцированный диетой атеросклероз52. Т.к. ATM гаплонедостаточность обусловливает APOE фенотип, то вполне возможно, что активация ATM ответственна за ослабление этих симптомов. Т.о., белки. которые подвергаются ATM-зависимому фосфорилированию в этих условиях являются субстратами, которые способны фосфорилироваться после минимальной
Последовательность сборки белков. реагирующих на повреждения ДНК на DSBs ДНК и структурные потребности в их взаимодействии, облегчаются при использовании микролазеров и треков заряженных частиц, чтобы генерировать DSBs85,86 (Fig. 3). ATM-зависимое фосфорилирование гистонового варианта H2AX, чтобы продуцировать γH2AX, по-видимому. является инициальным сигналом для последующего накопления белков. реагирующих на повреждения ДНК87,88. Второй субстрат для ATM, MDC1, соединяется с γH2AX посредством breast cancer susceptibility protein-1 (BRCA1) C-терминального (BRCT) домена и играет ключевую роль в качестве 'master regulator' распознавания и репарации DSBs ДНК89. NBS1, как часть MRN, достигает разрыва с той же самой кинетикой, что и MDC1, и он также фосфорилируется с помощью ATM85. Однако его сохранение на хроматине не зависит от фосфорилирования ATM, а скорее от фосфорилирования с помощью casein kinase-2 Ser-Asp-Thr (SDT) повторов на N конце MDC1 (Refs 90, 91). RING-finger убиквитин лигаза, RNF8, также собиирается на DSB благодаря взаимодействию его FHA доменов с фосфорилированным MDC1 (консенсусный сайт для ATM фосфорилирования)92-94. RNF8 таким образомH2AX т облегчает накопление p53-binding protein-1 и BRCA1 на месте повреждения. Интересно, что оба эти белка являются также субстратами для ATM в ответ на DSBs ДНК79,80. Т.о., ATM играет ключевую роль в фосфорилировании различных белков, которые составляют стержневые компоненты аппарата распознавания повреждений ДНК и тех, которые ответственны за амплификацию сигнала (Fig. 4).
MRN as an adaptor in downstream signalling. Комплекс MRN не только вовлекается в активацию ATM, но и является также мишенью для ATM киназы при передаче нижестоящих сигналов к аппарату репарации ДНК и checkpoints клеточного цикла95. Иметь интактный комплекс важно для нижестоящей передачи сигналов и имеются также доказательства, что ATM-зависимое фосфорилирование NBS1 играет роль в качестве адаптора для нижестоящей передачи сигналов96-98. Сегодня хорошо известно, что NBS1 быстро рекрутируется на DSB, с которыми он остается стабильно связанным38,99,100. Напротив, ATM субстраты, такие как CHK2 быстро перемещаются по ядру после повреждения ДНК101. Кроме того, SMC1, который выполняет важную роль в реакции на повреждения ДНК, не может быть локализован в местах повреждений, за исключением того, когда клетки подвергаются воздействию высоких доз радиации102. в
В установлении нижестоящей роли MRN в передаче сигналов ATM, д. быть созданы условия, которые делают возможной нормальную активацию ATM. В клетках от NBS пациентов, активированный ATM не появляется в фокусах, индуцированных повреждениями ДНК, но присутствует в диффузной форме по всему ядру, а фосфорилирование нижестоящих субстратов дефектно40. Наблюдение, что ATM активируется нормально в NBS1-дефицитных клетках в ответ на дозы радиации больше 1 Gy (и еще дефектно фосфорилирование SMC1) подтверждает роль белка NBS1 в нижестоящих событиях. Появление фосфорилированного по Ser957 SMC1 в ATM и NBS1 фокусах в клетках, которые содержатся дикого типа NBS1, но не в NBS1-дефицитных клетках, согласуется с адаптороной ролью NBS1 в передаче сигналов40. Стабильное связывание MRN с местом разрыва и его ко-локализация с ATM делает его идеальным кандидатом роль облегчения фосфорилирования нижестоящего субстрата38. Индуцированное радиацией фосфорилирование CHK2 нарушено в NBS1-дефицитных клетках спустя 30 мин после облучения. Этот дефект также выявляется на уровне активации CHK2. ATM-зависимое фосфорилирование белка Fanconi anaemia protein FANCD2 также обнаруживает зависимость от NBS1 и MRE11 (Ref. 97). Индуцированное радиацией фосфорилирование CHK1(Ref. 98) и SMC1(Ref. 39, 40) также нуждается в NBS1. Все эти наблюдения сравнимы с адапторной ролью комплекса MRN в детерминации фосфорилирования ATM субстратов. Возможно, что значительно больше ATM субстратов также зависит от присутствия MRN.
Имеются также доказательства того, что статус фосфорилирования NBS1 может влиять на нижестоящее фосфорилирование ATM субстратов. В ответ на повреждения радиацией NBS1 фосфорилируется по двум сайтам (Ser278 и Ser343); эти события фосфорилирования зависят от ATM103-106. Функциональное значение этих фосфориляций для нижестоящих событий в чем-то противоречиво. Существует общее согласие, что NBS1-фосфорилированный Ser343 необходим для активации S-phase checkpoint39,40, 103-106. SMC1 был идентифицирован как нижестоящий эффектор для ATM/NBS1-контролируемого S-phase checkpoint, а ATM-зависимое фосфорилирование SMC1 по Ser957 и Ser966 необходимо для активации checkpoint, клеточной жизнеспособности и поддержания целостности генома39,40. Более того, фосфорилирование NBS1 необходимо для фосфорилирования SMC1. Это ведет к предположению об отдельной ветви S-фазного пути, который содержит ATM, NBS1 и SMC1 (Ref. 39). Важно фосфорилирование SMC1 не только для этого S-phase checkpoint, но и также для защиты от индуцируемой радиацией клеточной гибели, это указывает на то, что ATM-зависимое фосфорилирование NBS1 также важно для выживания клеток после облучения. Это подтверждается несколькими сообщениями103-105. в
NBS1 является ключевым членом MRN комплекса, который влияет на связывание ДНК, разворачивание и нуклеазную активность MR комплекса107. Путем связывания посредством своего C конца с N концом MRE11, он гарантирует, что MR будет локализован в ядре69. MR неспособен активировать димерный ATM, это подтверждает ключевую роль NBS1 при разрывах. Как отмечалось выше, NBS1 и ATM-зависимая фосфорилированная форма этого белка выполняет адапторную роль в фосфорилировании нижестоящих субстратов. Однако сегодня доказано, что MRE11 и RAD50 также фосфорилируются в ответ на DSBs ДНК. Несколько недавних протеомных исследований идентифицировали RAD50 в качестве ATM-зависимого субстрата14, 15, 84. Кроме того, MRE11 фосфорилируется с помощью агентов, которые вызывают разрывы ДНК108, 109. Сегодня неясно каковы функциональные последствия фосфорилирования MRE11 и RAD50, но предполагается, что они могут также играть важную роль в качестве адапторных белков в регуляции фосфорилирования множественных субстратов, описанных для ATM. Исходя из этого, можно ожидать влияния на репарацию ДНК и контроль клеточного цикла.
Conclusions and future perspectives
Much progress has been made on how ATM responds to DNA DSBs. It is evident that recruitment to chromatin is an important part of the ATM activation mechanism and its interaction with the MRN complex, the sensor of DNA DSBs, enhances the process of activation. Although there is growing agreement that the initial stimulus for ATM activation is a relaxation of chromatin structure, the series of events leading to the translocation of ATM to the MRN complex at the break site and the subsequent repair of the DSB await further elucidation. It is also becoming increasingly obvious that the retention of ATM and other DNA-damage response proteins on chromatin is a crucial part of the overall response. Stable binding of individual components of the DNA-damage-response machinery is sufficient to induce the DNA-damage response in the absence of DNA DSBs110. Immobilization of NBS1, MRE11 or MDC1 leads to the phosphorylation of H2AX, NBS1 and ATM, which is indicative of an activated DNA-damage response. Although the system used is somewhat artificial, it does reflect what is seen in the process initiated by DNA DSBs. When H2AX is phosphorylated by ATM in response to DNA damage, MDC1 binds to it and then acts as a scaffold for the binding of other proteins and therefore also the amplification of the response.
Autophosphorylation is an inherent part of ATM activation. It occurs at several sites and is responsible for the dissociation of the inactive dimeric ATM to an active monomeric form53, 73. It is also likely that autophosphorylation of ATM alters the interaction with other proteins that alter the DNA-damage response. This is certainly the case in human cells, although evidence in some mouse studies suggests that ATM autophosphorylation and phosphorylation of downstream substrates is a consequence of ATM activation, rather than contributing to it. It is suggested that increased concentration of ATM in the region of the break is sufficient for activation. Clearly these differences between human and mouse is an area for further investigation.
Agents that damage DNA are mutagenic and in many cases also carcinogenic. The response to DNA DSBs is complex and is designed to minimize genome instability that arises from unrepaired breaks. The presence of unrepaired breaks in DNA increases the risk of genome rearrangements or translocations, and consequently the risk of inappropriate regulation of expression of specific genes, including oncogenes, is also increased. DNA breaks per se can also be beneficial in that they activate a DNA-damage response in pre-cancerous cells, thereby establishing a barrier to tumour progression111. However, that barrier can be readily circumvented by mutation in genes that impair the DNA-damage response and allow the development of cancer. Not unexpectedly, syndromes such as A-T and NBS that are characterized by a defective response to DNA DSBs are prone to chromosomal instability and cancer predisposition. Unrepaired breaks can also contribute to other pathologies such as neurodegeneratioin, immune-system defects, infertility and endocrine dysfunction. These abnormalities might arise as a direct consequence of the presence of unrepaired breaks, leading to cell death, or indirectly owing to the build-up of oxidative stress as a consequence of the persistence of breaks in DNA.
