Биогенез зрелых microRNAs (miRNAs) связан с расщеплением первичных miRNAs с помощью Drosha и расщепления возникающего в результате предшественника (pre-miRNAs с помощью Dicer. Предыдущие исследования лаб. Narry Kim's показали, что фактор плюрипотентности LIN28 может индуцировать терминальную uridylation pre-let-7 miRNA в embryonic stem (ES) клетках, чтобы блокировать расщепление с помощью Dicer и созревание let-7. Это имеет важные последствия, т.к. зрелая let-7 способствует дифференцировке ES клеток и развитию. Поскольку LIN28 не обладает uridylyl transferase активностью, то как она участвует в индукции pre-let-7 uridylation, неизвестно. В трех исследованиях было установлено, что терминальная uridylyl transferase (TUTase)млекопитающих zinc finger CCHC domain-containing protein 11 (ZCCHC11; также известен как TUT4), и его Caenorhabditis elegans ортолог poly(U) polymerase 2 (PUP-2), является TUTase, которая регулирует LIN28-обеспеиваемое pre-let-7 uridylation.

Исследования Heo et al. b Hagan et al. bltynbabwbhjdfkb ZCCHC11 как только одну из 7 TUTases млекопитающих, которые могут уридилировать pre-let-7 в ES клетках мышей. Heo et al. показали, что small interfering RNA-обусловленный нокдаун ZCCHC11 или LIN28 редуцирует уровень маркеров плюрипотентности в ES клетках мышей, это согласуется с ролью зрелой let-7 в обеспечении дифференцировки ES клеток. Они также представили данные, указывающие на то, что LIN28 рекрутирует ZCCHC11 на pre-let-7 благодаря распознаванию GGAG мотива в терминальной петле этой pre-miRNA. Некоторые дополнительные miRNAs, которые содержат GGAG мотив, включая и др. члены семейства let-7 и miR-107, miR-143 и miR-200c, также подвергаются uridylation LIN28-зависимым способом. Это указывает на то, что способность LIN28 и ZCCHC11 репрессировать процессинг pre-miRNA, вызывая uridylation может быть неспецифичной для let-7. Hagan et al. показали, что нокдаун ZCCHC11 или LIN28, с использованием small interfering RNA, останавливает ингибирование процессинга let-7, приводя к накоплению зрелых let-7 miRNA и вызывая репрессию репортерных генов, которые ингибируются зрелыми let-7.

Наконец, Lehrbach et al. исследовали пост-транскрипционную регуляцию let-7 у C. elegans. Они установили. что LIN-28 также связывает pre-let-7 и предупреждает её процессинг с помощью Dicer, и что это зависит от ZCCHC11 ортолога, PUP-2. Более того, LIN-28 стимулирует uridylation pre-let-7 за счет PUP-2 in vitro.

Итак, эти исследования показали, что вновь выявленный путь let-7-LIN28-TUTase эволюционно законсервирован, чтобы контролировать процессинг let-7. Однако, т.к. терминальная петля pre-let-7 не законсервирована у C. elegans, то точные механистические детали могут отличаться у этих организмов.

Рис.1.

 |  The RISC 'slicer' protein AGO2 generates an additional microRNA (miRNA) processing intermediate, a nicked hairpin designated ac-pre-miRNA. Mature miRNA is indicated in red and precursor miRNA is in blue. Original figure provided by S. Diederichs, Harvard Medical School, Charlestown, Massachusetts, USA.

Члены семейства Argonaute участвуют в РНК интерференции, заставляя молчать мРНК мишени. В новом исследовании выявлена дополнительная роль белков Argonaute в пост-транскрипционной позитивной регуляции экспрессии microRNA (miRNA). В этом исследовании акже установлено, что endonuclease-competent Argonaute-2 (AGO2) расщепляет предшественников miRNAs (pre-miRNAs), чтобы создать новые промежуточные образования во время процессинга.

Используя подход in vivo для изучения процессинга miRNA, Diederichs and Haber проверяли эффект ко-трансфекции одного из нескольких первичных транскриптов miRNA с конструкциями, кодирующими белки Argonaute, в клетки человека. Каждый эктопически экспрессируемый белок Argonaute приводил к существенному увеличению уровней зрелых miRNAs после процессинга - указывая тем самым, что белки Argonaute пост-транскрипционно усиливают продукцию и стабильность зрелых miRNAs.

Для проверки эффекта экспрессии эндогенных Argonaute, авт. использовали клетки от AGO2 нокаутных мышей (нокаутные модели др. белков Argonaute пока не существуют) для процессинга miRNA и установили, что экспрессия всех тестируемых зрелых miRNAs сильно снижена. Этот эффект частично может быть скорректирован с помощью восстановления посредством AGO2, но не др. белков Argonaute, это указывает на специфическую роль AGO2 в процессинге и/или стабильности miRNA.

Тщательный анализ продуктов процессинга miRNA in vivo выявил дополнительные промежуточные образования miRNA в клетках с эндогенными AGO2 и повышенные уровни в клетках с эктопической экспрессией AGO2. Новые шпильки выявленые с помощью northern blotting и клонированные, были приблизительно на 11-12 нуклеотидов короче с 3' конца, чем pre-miRNAs. Они явились продуктами эндонуклеолитического расщепления pre-miRNA, которое и продуцирует укороченные шпильки, которые гибридизируются с фрагментами в 11-12 нуклеотидов. Итак, это формы урезанных предшественников, которые были обозначены AGO2-cleaved pre-miRNAs (ac-pre-miRNAs).

Восстановление синтеза ac-pre-miRNA с использованием AGO2 мутантов показало, что дефектные по расщеплению AGO2 мутанты неспособны генерировать ac-pre-miRNAs. Напротив, увеличение экспрессии зрелых miRNAs оказалось неизменным. Это указывает на то, что две функции белков Argonaute в биогенезе miRNA независимы: AGO2-зависимая генерация ac-pre-miRNAs оказалась endonuclease зависимой, тогда как Argonaute-зависимое увеличение экспрессии зрелой miRNA не зависит от endonuclease. Напротив, используя AGO2 мутантов, которые были дефицитны по связыванию малых РНК, было установлено, что повышенная экспрессия зрелых miRNAs зависит от взаимодействия miRNA и белка Argonaute.

Каково биологическое значение ac-pre-miRNA промежуточных образований? Авт. продемонстрировали, что ac-pre-miRNAs являются функциональным субстратом для Dicer и они подвергаются превращению в зрелые miRNAs. Эффективность процессинга была сходной с таковой для pre-miRNA субстрата, тогда каковы же преимущества субстрата ac-pre-miRNA? Авт. полагают, что отрезание с 3' конца шпильки может вносить вклад в выбор нити или же отрезание от 3' плеча может облегчать удаление нити пассажира и расплетания дуплекса miRNA.

Недавно белки Argonaute у Caenorhabditis elegans , как было установлено, участвуют в процессинге small interfering RNAs (siRNAs), хотя механизмы осуществления Argonaute-обеспечиваемого процессинга miRNA и siRNA, по-видимому, различны. Благодаря участию в процессинге miRNA или siRNA и в RNA interference, белки Argonaute могут координировать регуляцию экспрессии и функции small RNAs.

Точный контроль уровней малых РНК является важным для поддержания нормальных клеточных функций. Два исследования в Cell выявили arsenate resistance protein 2 (ARS2) в качестве нового компонента ядерного РНК cap-binding complex (CBC), который стимулирует процессинг microRNA (miRNA) и является критическим для клеточной пролиферации у млекопитающих и для антивирусной резистенции у мух. Эти исследования предоставили важную новую информацию о связи между RNA silencing machinery и общим метаболизмом мРНК.

Gruber et al. вызывали нокдаун ARS2 с помощью RNAi в клетках млекопитающих и наблюдали дефекты пролиферации. Более того, нокаут Ars2 в гематопоэтической ткани взрослых мышей (которая высоко пролиферативна) вызывает дефекты костного мозга, тогда как печень и почки (которые представлены в основном непролиферативными клетками) не затрагиваются. Авт. идентифицировали nuclear cap-binding protein 1 (NCBP1; также известный как CBP80), который собирается на 7mG-capped РНК, при скрининге на ARS2-взаимодействующие белки и установили, что ARS2 также взаимодействует с NCBP2 (также известным как CBP20) и 7mG-capped РНК in vitro.

Генетические исследования на растениях ранее показали, что SERRATE (гомолог ARS2) участвует в биогенезе miRNA, а растения, дефицитные по SERRATE, имеют дефекты, сходные с теми, что наблюдаются у CBC мутантов. В соотв. с этими наблюдениями, Gruber et al. показали, что нокдаун ARS2 или CBP80 в пролиферирующих клетках млекопитающих редуцирует уровни субнабора miRNAs, которые участвуют в клеточной трансформации (напр., let-7) и нарушает let-7 miRNA-обусловленную репрессию репортерных транскриптов. Более того, ARS2 соединяется с и стимулирует активность и правильность Drosha, компонента Microprocessor комплекса, который расщепляет первичные транскрипты miRNA (pri-miRNAs) я в ядре, чтобы генерировать pre-miRNAs. Напротив, ARS2 не соединяется с Dicer, который преобразует pre-miRNAs в зрелые miRNAs в цитоплазме. Следовательно, ARS2 избирательно экспрессируется в пролиферирующих клетках, это указывает на то, что процессинг субнабора pri-miRNAs коррелирует с пролиферацией.

Sabin et al. идентифицировали ARS2 при скрининге факторов, которые обеспечивают резистентность к вирусам у Drosophila melanogaster. Насекомые сражаются с вирусной инфекцией путем доставки и деградации вирусных РНК с использованием small interfering RNAs (siRNAs), поэтому авт. предположили, что ARS2 может участвовать в этом процессе. В самом деле ARS2 взаимодействует с и модулирует активность Dicer 2, который преобразует предшественники siRNA в зрелые siRNAs в цитоплазме, а потеря ARS2 в клетках и у vs[ увеличивает их чувствительность к РНК вирусам.

Нокдаун ARS2 у D. melanogaster также нарушает miRNA-обеспечиваемое молчание и снижает уровни pri-miRNAs. Более того, ARS2 взаимодействует с Microprocessor комплексом мух, как и у млекопитающих. Эти результаты подтверждают консервативную роль ARS2 в биогенезе miRNA. Ясно. что взаимодействие между ARS2 и CBC законсервировано у D. melanogaster, а клетки, истощенные по CBP80 или CBP20 имеют дефекты путей замалчивания с помощью малых РНК. Более того, CBC также выполняет важную роль в ограничении вирусной инфекции. Участвуют ли др. факторы общего метаболизма мРНК в регуляции РНК молчания предстоит определить.