BC | BMP, | CC | DC | HC | GER | IHC | KO | LER | OPC | PS

Позвоночные воспринимают звуки, давление и движения посредством вибрации пучков стереоцилий, расположенных на поверхности волосковых клеток, обращенной в просвет. В большинстве случаев волосковые клетки и ассоциированные несенсорные клетки, обозначаемые как поддерживающие клетки , расположены в виде рыхло организованных кластеров, которые содержат от минимум 10 волосковых клеток в органе боковой линии рыб или саламандр (Metcalfe et al., 1985) до более чем 200,000 в macula neglecta взрослых акул (Corwin, 1977). Напротив, сенсорный эпителий в улитке млекопитающих (кортиевом органе) содержит лишь несколько тысяч волосковых клеток, но эти клетки организованы в 4 или 5 дискретных рядов. Более того, поддерживающие клетки сходным образом ранжированы в высоко упорядоченные ряды, которые просовываются между рядами волосковых клеток, чтобы сформировать инвариантный мозаицизм (rev. Kelley, 2006). Факторы, которые регулируют развитие этой удивительной структуры в основном неизвестны. Однако, наше понимание генных и клеточных взаимодействий, которые обеспечивают её формирование, существенно повысилось за последние 10 лет.

Morphological development of the mammalian cochlear duct

У мышей, наиболее удобной модельной системы развития улитки у млекопитающих, канал улитки возникает как наружный карман из развивающегося отоциста примерно на ст. E11 (Morsli et al., 1998). На E12 хиральность растущего канала становится очевидной, т.к. он начинает закручиваться. Удлинение и закручивание улитки продолжается до приблизительно E19 или P0, к этому времени канал приобретает свою окончательную форму приблизительно в 1.75 витков. Канал сам по себе представлен псевдостратифицированными эпителиальными клетками, происходящими из отической плакоды. Даже в самый ранний момент времени после инициации кохлеарного роста, дорсальная половина канала обычно обозначается как донная, она уже представлена утолщенным эпителием, который содержит 5-6 слоёв клеток (Retzius, 1884; Kikuchi and Hilding, 1965; Sher, 1971; Anniko, 1983; Lim and Anniko, 1985). Между E11 и E13, клетки вдоль modiolar-to-strial оси канала улитки выглядят довольного гомогенными. Начиная приблизительно с E13, клетки, расположенные в домене, который тянется от приблизительно срединной линии медиолатеральной оси дна до точки посредине между срединной линией и strial краем, становятся постмитотическими (Ruben, 1967). Наиболее явными морфологическими проявлениями этих изменений является отсутствие межядерной миграции и базальная локализация ядер большинства клеток (Kelley and Bianchi, 2001). Клетки внутри этого постмитотического региона обозначаются также как zone of non-proliferation (ZNP)(Chen and Segil, 1999), как полагают, представляет просенсорный домен, который д. давать все клетки кортиевого органа (Kelley et al., 1993). Т.к. с помощью классического клонального анализа не удается подтвердить это предположение, но было показано, что большинство клеток, которые должны развиваться как волосковые и поддерживающие клетки, возникают из этой популяции постмитотических клеток (Chen and Segil, 1999; Chen et al., 2002). В дополнение к пространственному ограничению вдоль modiolar-to-strial оси, терминальные митозы происходят также в виде стереотипического градиента вдоль базально-апикальной оси, так что клетки, расположенные на верхушке канала улитки первыми становятся постмитотическими (Ruben, 1967; Lee et al., 2006). Терминальные митозы, затем прогрессируют в виде волны, которая распространяется в направлении основания улитки, где последние клетки становятся постмитотическими между E14 и E14.5. На поверхности обращенной в просвет клеточные профили внутри просенсорного домена становятся ограниченными по отношению к окружающим клеткам, это приводит к уменьшению области поверхности, обращенной в просвет (McKenzie et al., 2004)(Fig. 1).

Первые указания на клеточную дифференцировку внутри просенсорного домена обнаруживаются в mid-basal регионе улитки между E14 и E15. Развивающиеся волосковые клетки могут быть идентифицированы на основании увеличения размеров их ядер, более близким к просвету расположением их ядер и накоплением actin на их боковых границах (Fig. 1). Дифференцировка внутренних волосковых клеток затем осуществляется в виде градиента, который распространяется в направлении верхушки и основания спирали улитки (Rubel, 1978). Порядок последующей клеточной дифференцировки в органе Корти остается неизвестным. Развивающиеся наружные волосковые клетки могут обнаруживаться на ст. E15 to E16, но развивающиеся поддерживающие клетки, в частности pillar клетки становятся морфологически различимыми примерно в то же самое время, что затрудняет определение какие из клеток возникают первыми. Анализ инициальных позиций развивающихся внутренних волосковых клеток показывает, что эти клетки не возникают на месте их окончательного расположения внутри органа Корти (McKenzie et al., 2004). Скорее внутренние волосковые клетки могут возникать на расстоянии 10 - 15 microns от места их финального расположения. Это наблюдение подтверждает, что могут происходить последующие клеточные перемещения для облегчения их финального положения в виде ряда внутренних волосковых клеток. Сходные перестройки наблюдаются в развивающихся наружных волосковых клетках, подтверждающие сходные клеточные перемещения (McKenzie et al., 2004).

Fig. 1. Development of cellular pattern in the organ of Corti. (A) Cross-section through the mid-basal region of the cochlear duct at E13.5. Nuclei of cells located in the prosensory domain (PS bracket) have moved to a basal position. In contrast, internuclear migration is still ongoing in cells located in Kolliker's organ (KO bracket). (B) View of the lumenal surface of the developing organ of Corti at E13.5. Cell boundaries have been labeled with phalloidin. There are no indications of cellular organization. (C) Cross-section through the cochlear duct at E14.5. Putative developing hair cells (arrows) can be identified in the developing organ of Corti. (D) Lumenal view at E14.5. A few developing inner hair cells are present (arrows). Also, the lumenal projections of adjacent prosensory cells have become constricted. (E) Cross-section of the developing organ of Corti at E16.5. Developing inner and outer hair cell nuclei can now be identified (arrows). (F) In a lumenal view, the basic pattern of the organ of Corti is now evident

На ст. E17, волосковые и поддерживающие клетки вдоль длины канала улитки становятся организованными в характерный паттерн органа Корти (Fig. 2). Одиночный ряд внутренних волосковых клеток располагается на modiolar крае, Каждая из внутренних волосковых клеток отделена от соседней внутренней волосковой клетки с помощью одиночной внутренней phalangeal клетки и modiolar край каждой внутренней волосковой клетки обычно контактирует с одиночной краевой клеткой. Strial край каждой внутренней волосковой клетки контактирует в одиночным рядом внутренних pillar клеток, однако, перед рождением тонкие проекции от дополнительных внутренних phalangeal клеток находятся между внутренними волосковыми клетками и pillar клетками. По ходу развития головки внутренних пиллярных клеток вытягивается, чтобы покрыть проекции, обращенные к просвету strial phalangeal клеток. Наружные pillar клетки первоначально располагаются в виде одиночного ряда, расположенного со стороны strial по отношению к внутренним pillar клеткам. В ходе развития головки внутренних pillar клеток также увеличиваются, что покрыть массив наружных pillar клеток. Однако, в то же самое время наружные pillar увеличиваются в виде strial проекций к поверхности просвета, которые образуют пальцеподобные врастания между первым рядом наружных волосковых клеток. Каждая из наружных волосковых клеток отделяется от соседние наружной волосковой клетки с помощью одиночной клетки, количество наружных pillar клеток и волосковых клеток наружного ряда практически одинаково. Наружные волосковые клетки второго ряда расположены примерно со сдвигом на 1/2 цикла регистра относительно наружных волосковых клеток первого ряда и также отделены одна от др. одиночными, обращенными к просвету проекциями подлежащих клеток Deiters'. Третий рад наружных волосковых клеток сходным образом сдвинут относительно клеток второго ряда и опять же одиночные Deiters' клетки находятся между ними. Наконец, strial край третьего ряда наружных волосковых клеток связан с помощью одиночного ряда Deiters' клеток. Количество клеток в этом ряду регулируется не очень точно и может варьировать в количестве. Со Strial стороны третьего ряда Deiters' клеток находятся по одиночному ряду Hensen's и Claudius клеток. Т.к. нет строгого определения поддерживающих клеток, то не совсем ясно, могут ли Hensen's и Claudius клетки рассматриваться как таковые. Однако, они, по-видимому, возникают из клеток внутри ZNP и, по-видимому, происходят из просенсорного домена (Chen and Segil, 1999). Т.к. клеточный паттерн органа Корти практически завершается к ст. P0, то онтогенетические события, которые регулируют его формирование происходят относительно в короткий период времени между E10 и P0.

Kolliker's organ and the Greater Epithelial Ridge

Приблизительно 25% клеток внутри канала улитки становятся частью просенсорного домена. Клетки, расположенные в modiolar половине канала и наиболее strial 25%, в конечном итоге развиваются во внутреннюю и наружную борозды, соотв. У взрослых обе борозды представлены монослоем из крупных кубоидальны эпителиальных клеток, которые выглядят как ничем не примечательные. Т.к. цитологические изменения, которые происходят во время образования наружной борозды не были тщательно изучены, ремоделирование клеток внутренней борозды, как было установлено, зависит от тироидным гормоном обеспечиваемой экспрессии p75^ntr, ведущей к клеточному апоптозу (Knipper et al., 1999). Элиминация большого процента клеток внутри развивающейся внутренней борозды согласуется с наблюдением, что эта область канала улитки содержит большее количество клеток у эмбрионов. Более того, недавняя демонстрация, что клетки, расположенные внутри этой области канала улитки могут развиваться или в волосковые или поддерживающие клетки усилили интерес к этой популяции клеток (Zheng and Gao, 2000; Kawamoto et al., 2003; Woods et al., 2003).

Существуют определенные противоречия относительно точной терминологии этих клеток. Когда Zheng and Gao (2000) впервые продемонстрировали, что трансфекция Atoh1 достаточна, чтобы индуцировать образование волосковых клеток в этой области улитки, они обозначили эту популяцию клеток как Greater Epithelial Ridge (GER). Однако, последующее исследование продемонстрировало сходную способность в отношении формирования поддерживающих клеток, и обозначены эти клетки были как Kolliker's орган (Woods et al., 2004). Albert von Kolliker впервые описал клетки утолщенного эпителия, расположенные в эмбриональном канале улитки в 1863 (Kolliker, 1863). Однако, Victor Hensen обозначил эти клетки как Kolliker's organ (Hensen, 1863). Т.к. термин Kolliker's орган использовался для описания незрелой стадии органа Корти (Lim and Rueda, 1992), то проверка оригинальной монографии Kolliker подтвердила, что он обозначил утолщенный эпителий, который в конечном итоге истончается, чтобы сформировать внутреннюю борозду (Fig. 3). Большой или внутренний эпителиальный гребень означает утолщенный гребень эпителиальных клеток, который простирается от modiolar края канала улитки до характерной выемки, которая образуется в месте расположения развивающихся pillar клеток (Lim and Anniko, 1985)(Fig. 3). Следовательно, GER содержит как Kolliker's орган, так и такие аспекты органа Корти, как внутренние волосковые клетки, внутренние фаланговые клетки и краевые клетки, расположенные на modiolar стороне pillar клеток. Неясно, могут ли внутренние или наружные pillar клетки рассматриваться как часть GER . Сходным образом lesser или наружный epithelial ridge (LER) содержит остальную часть кортиева органа а также клетки, которые в конечном итоге развиваются как наружная борозда. Т.к. рабочие определения GER и LER базируются на морфологии, то в недавней работе было продемонстрировано, что общая граница между двумя частями может быть определена также молекулярно посредством экспрессии адгезивных молекул Ncad и Ecad (Simonneau et al., 2003). Ncad экспрессируется в strial половине Kolliker's органа, внутренних волосковых клетках и ассоциированных поддерживающих клетках и внутренних pillar клетках, тогда как Ecad экспрессируется в наружных pillar клетках, наружных волосковых клетках и в ассоциированных поддерживающих клетках и во всем LER. Кроме того, Fgf10 экспрессируется преимущественно в strial половине GER с острой границей между внутренними волосковыми клетками и pillar клетками (Pauley et al., 2003).

Следовательно, базируясь на историческом описании этой области, становится ясно, что наиболее подходящим определением для популяции клеток, расположенных между просенсорным доменом и modiolar краем канала улитки д. быть Kolliker's орган.

Specification of the cochlear prosensory domain

Как уже говорилось, первой ступенью развития кортиева органа является спецификация просенсорного домена (Kelley et al., 1993). Наше знание факторов, которые маркируют и специфицируют просенсорные домены внутри отоциста выросло существенно в последнее время, но необходимо обсудить некоторые важные отличия в терминах генной экспрессии между предполагаемым просенсорным доменом улитки и др. просенсорными доменами внути отоциста. Ряд маркеров, включая

Fig. 2. Schematic diagram of cellular patterning in the organ of Corti at P0. Inner hair cells (IHC) are arranged in a single row located on the modiolar side. Inner hair cells are surrounded by border cells (BC) on their modiolar side and inner phalangeal cells on both their lateral (Iph) and strial (gray) sides. On the strial side of the inner hair cells are single rows of inner (IPC) and outer (OPC) pillar cells. Outer pillar cells also form the interdigitations between first row outer hair cells (OHC1). Second and third row outer hair cells (OHC2/3white) are separated by single Deiters' cells (DC2/3). Finally, a third row of Deiters' cells (DC3) from a boundary between the outer hair cells and the adjacent Claudius and Hensen's cells (CC and HC).

Bmp4 , Lunatic Fringe ( Lfng), Jagged1/Serrate1 ( Jag1), Islet1, Prox1, Sox2 and Fgf16, как было показано, экспрессируется в виде паттернов, которые согласуются до некоторой степени с ранним развитием большинства просенсорных доменов (Wu et al., 1996; Morsli et al., 1998; Li et al., 2004; Radde-Gallwitz et al., 2004; Bermingham-McDonogh et al., 2006; Chapman et al., 2006; Pujades et al., 2006). Однако, функциональные данные о роли в просенсорной спецификации доступны только для очень маленькой группы кандидатов, которая ограничена Bmp4, Jagged1 и Sox2.

Bmp4 and prosensory specification

Был первым геном, экспрессирующимся в виде паттерна, согласующегося с формированием просенсорного домена, был Bone Morphogenetic Protein 4 (Bmp4)(Wu et al., 1996; Cole et al., 2000). У кур инициальная экспрессия bmp4 наблюдалась в виде довольно широкого и диффузного паттерна вдоль заднего вентрального края развивающегося отического бокала. Когда бокал закрывался, то экспрессия bmp4 ограничивалась одиночным задним вентральным пятном и передней вентральной полоской. Затем экспрессия bmp4 могла быть локализованной в каждом из развивающихся сенсорных участков. Перед дифференцировкой bmp4 экспрессируется во всех клетках внутри участков, но позднее оказывается ограниченным поддерживающими клетками. У мышей экспрессия Bmp4 сходным образом определяет просенсорные участки, которые д. давать три гребешка, но неожиданно не экспрессируется в просенсорных участках, которые дают utricular или saccular maculae или орган Корти (Morsli et al., 1998). Однако, Bmp4 экспрессируется в популяции клеток, расположенных по соседству со strial краем органа Корти, возможно включая клетки, которые будут развиваться как Hensen's и Claudius клетки.

Базируясь на паттерне его экспрессии и его роли в спецификации судеб в др. системах, Bmp4 безусловно является прекрасным кандидатом на роль просенсорного индуктора, по крайней мере, для субнабора просенсорных доменов. Однако, модуляция предачи сигналов Bmp4 у развивающихся эмбрионов кур посредством эктопической экспрессии Noggin, ингибитора Bmp4, вызывает сомнительные результаты в терминах непосредственной роли Bmp4 в формировании просенсорных участков (Chang et al., 1999; Gerlach et al., 2000). В то время как сенсорные участки затрагивались, будучи локализованными вблизи источника Noggin, наиболее распространенным было изменение формирования клеточных паттернов скорее, чем размер сенсорного участка. Т.к. в присутствии Noggin возникают существенные морфологические изменения в общей структуре внутреннего уха, то основы сенсорных дефектов остались неясны.

Сравнительно недавно два отдельных исследования были посвящены роли Bmp4 в формировании волосковых клеток in vitro с использование культур отоцистов кур. Неожиданно, несмотря на использование одинаковых протоколов и реагенов два исследования дали противоположные результаты, в одном пришли к выводу, что Bmp4 способствует образованию волосковых клеток (Li et al., 2006), тогда как др. указывало на ингибирующую роль Bmp4 (Pujades et al., 2006). Основы этих отличающихся результатов неясны, но они могут быть связаны с различиями в концентрациях Bmp4 и продолжительности периода культивирования в двух исследованиях. Li et al. (2006) наблюдали достоверное увеличение образования волосковых клеток в отоцистах после 7 дней в присутствии 3 - 5 ng/ml Bmp4, но также отмечали тенденцию к снижению числа волосковых клеток при концентрациях между 10 и 20 ng/ml. Напротив, Pujades et al. (2006) наблюдали снижение экспрессируемого маркера волосковых клеток cath1 (chicken Atonal ) только после 18 ч в присутствии 50 ng/ml Bmp4. Наиболее интригующим, несмотря на использование очень сходных концентраций Bmp-ингибитора Noggin (0.75 mg/ml против 1.0 mg/ml), эти два исследования получили противоположные результаты относительно эффектов ингибирования Bmp4, в одном случае нашли, что количество волосковых клеток снижается (Li et al., 2006) , тогда как в др. установили, что повышается (Pujades et al., 2006). Опять же возможно, что различия связаны с продолжительностью экспериментов.

Третий эксперимент исследовал роль передачи сигналов Bmp4 в развитии улитки млекопитающих in vitro (Puligilla et al., 2007). Однако, в противоположность экспериментам, описанным выше, модулирование передачи сигналов Bmp4 не инициировалось вплоть до E16, т.е. после спецификации просенсорного домена. Результаты этих экспериментов обнаружили индуктивный эффект на образование волосковых клеток для кусочков, смоченных Bmp4 и ингибирующий эффект на формирование волосковых клеток присутствия Noggin. Эти результаты очевидно сравнимы с таковыми Li et al. (2006), но важно учесть, что Bmp4 может действовать на двух разных стадиях в развитии сенсорного эпителия внутреннего уха. В экспериментах на курах, описанных выше, модуляция передачи сигналов Bmp инициируется на ст. отоциста, по-видимому, до или одновременно с формирование просенсорных доменов, тогда как эксперименты на мышах были задержаны вплоть до момента времени, по-видимому, соответствующему после сенсорной спецификации, подтверждая, что в этом случае предача сигналов Bmp действует на детерминацию судеб индивидуальных клеток. Одним из затруднений в дифференциации эффектов на спецификацию просенсорного домена в противоположность судеб индивидуальных клеток является отсутствие убедительных маркеров для просенсорных клеток. В то время как некоторые гены первоначально экспрессируются во всех просенсорных клетках, большинство, включая Jagged1, Sox2, Lfng и p27^kip1, сохраняются в поддерживающих клетках, затрудняя определение специфических эффектов на просенсорное формирование.

Итак, имеющиеся данные о роли пути передачи сигналов BMP в спецификации просенсорных доменов указывают на варьирующие и сложные активности. Однако, учитывая хорошо задокументированные эффекты передачи сигналов BMP в ходе всего развития позвоночных (rev. Massague et al., 2005), не является удивительным, что передача сигналов BMP возможно играет сходную роль во внутреннем ухе. Необходимы дальнейшие исследования роли этого пути, включая исследование сложных сигнальных взаимодействий между BMPs и др. путями, которые регулируют аспекты раннего формирования внутреннего уха, такие как Fgf, Hedgehog и каноническая передача Wnt (Riccomagno et al., 2002; Wright and Mansour, 2003; Riccomagno et al., 2005)

Fig. 3. Kolliker's organ, GER and LER. Cross section through the cochlear duct at E15 illustrating the morphological boundaries of Kolliker's organ (KO), the greater epithelial ridge (GER) and the lesser epithelial ridge (LER). Note the distinct notch that is formed at the GER/LER boundary, marking the position of the pillar cells between the single inner д. предоставить информацию о молекулярной регуляции просенсорной спецификации.

The Notch signalling pathway is necessary for specification of the prosensory domain

Два дополнительных гена, которые экспрессируются в виде паттернов, которые в основном согласуются с ролью спецификации просенсорных участков являются Jagged1 (Jag1, также обозначаемый как Serrate1 у кур) и Lunatic Fringe (Lfng; Adam et al., 1998; Cole et al., 2000). Jag1 и Lfng оба являются компонентами пути передачи сигналов Notch, Jag1 действует как лиганд Notch, тогда как Lfng модулирует активность некоторых notch лигандов (Bruckner et al., 2000; Moloney et al., 2000). Хотя оба первоначально экспрессируются в виде более диффузных паттернов в отическом бокале, каждый в конечном итоге оказывается в развивающихся просенсорных регионах (Wu et al., 1996, Morsli et al., 1998; Adam et al., 1998; Cole et al., 2000). Однако, как и в случае с Bmp4, экспрессия Jag1 в улитке млекопитающих обнаруживает довольно интригующий паттерн. На ст. E12, экспрессия Jag1 в канале улитки распространяется от modiolar края канала до срединной точки вдоль modiolar-to-strial оси (Morrison et al., 1999; Lanford and Kelley, 2005; Murata et al., 2006). Как обсуждалось, это по-видимому, не коррелирует с положением просенсорного домена. На ст. E15 экспрессия Jag1 локализуется в просенсорном домене, а на ст. E17, Jag1 экспрессируется исключительно в поддерживающих клетках. Этот паттерн экспрессии ставит интригующий вопрос относительно развития канала улитки и/или экспрессии Jag1. Одна из возможностей заключается в том, что индивидуальные клетки в modiolar половине канала временно экспрессируют Jag1. Напротив, Jag1 экспрессирующие клетки, располагающиеся в modiolar регионе канала д. быть перемещены в более соотв. область канала в результате или морфогенетических изменений в самом канале или за счет перемещений индивидуальных клеток. Pirvola et al. (2002) действительно подтвердили возможность точно такого типа перемещений клеток, базируясь на фенотипе Fgfr1 мутантных мышей, однако, клетки, обладающие морфологическими характеристиками, согласующимися с миграцией или перемещением, такие как цитоплазматические выпячивания, были описаны в органе Kolliker's. Необходимы дальнейшие эксперименты, в частности по клеточным клонам и картированию судеб в разных регионах канала улитки, чтобы ответить на эти вопросы.

Роль передачи сигналов Notch в регуляции индивидуальных клеток внутри индивидуальных просенсорных доменов хорошо известна и будет обсуждена ниже. Но сравнительно недавние эксперименты выясняют дополнительную, более раннюю роль передачи сигналов Notch в спецификации просенсорных доменов. В частности, анализ внутреннего уха мышей, у которых Jag1 или специфически делетирован (Kiernan et al., 2006), или сделан гипоморфным, выявляет снижение общего размера сенсорного эпителия (Kiernan et al., 2001; Tsai et al., 2001; Kiernan et al., 2006). Фактически у мышей, у которых Jag1 делетируется начиная с раннего отоциста, используя FoxG1-зависимую Cre экспрессирующую линию, большинство вестибулярных органов, за исключением saccular maculae, в основном отсутствуют, а внутри улитки редуцированные количества неправильно расположенных волосковых клеток ограничены апикальной областью канала (Kiernan et al., 2006). Сходным образом, делеция Rbp-Jk, транскрипционного репрессора, который необходим для всех notch функций (de la Pompa et al., 1997; Mizutani et al., 2001), ведет к полному отсуствию всего вестибулярного эпителия и к почти полной потере всех волосковых клеток улитки также (Yamamoto and Kelley, unpublished). Наконец, ингибирование активности secretase, компонента сигнального пути Notch, подавляет образование просенсорного домена в отоцисте кур (Daudet et al., 2007) Напротив, избыточная экспрессия активированной формы куриного notch1, cnotch1-icd (notch-intracellular domain), в несенсорных регионах отоциста кур ведет к образованию эктопических сенсорных участков (Daudet et al., 2005). Все эти результаты согласуются с ролью Jag1-зависимой активации Notch в спецификации просенсорных доменов во всем ухе, включая канал улитки.

Несмотря на способность избыточной экспрессии cnotch1-icd индуцировать эктопические сенсорные участки, кажется мало вероятным, что notch1 является эндогенным рецептором для данного эффекта. Это заключение базируется на фенотипе мышей, у которых Notch1 был специфически делетирован в ухе, также с использованием FoxG1-Cre линии. В противоположность делеции во внутреннем ухе Jag1, делеция во внутреннем ухе Notch1 приводит к избыточной продукции волосковых клеток как в вестибулярном, так и кохлеарном эпителии (Kiernan et al., 2005a). Механизм этого эффекта скорее всего связан с ролью передачи сигналов Notch в детерминации судеб индивидуальных клеток внутри просенсорных доменов. Это указывает на то, что какой-то др. из Notch генов обнаруживается как у птиц (по крайней мере 2 дополнительных notch гена) (Hayashi et al., 1996; Myat et al., 1996) так и млекопитающих (3 дополнительных Notch гена)(rev. Katoh and Katoh, 2007), по-видимому, ответственны за обеспечение Jag1-индуцированной просенсорной детерминации. Индукция эктопических участков в ответ на экспрессию cnotch1-icd д. указывать на то, что индукция просенсорных участков нуждается только в активном notch сигнале и что специфический белок Notch не нужен.

Фенотип мутантов Notch1 подтверждает, что Notch1 не участвует в детерминации просенсорных доменов. Однако, Notch1 повсеместно экспрессируется в отоцисте, начиная с преплакодной стадии и остается в течение всей клеточной дифференцировки (Lindsell et al., 1996; Adam et al., 1998; Lanford et al., 1999; Groves and Bronner-Fraser, 2000). Т.к. Jag1 способен связываться с и активировать Notch1 (Hicks et al., 2000; Yang et al.,2005), то было предположено, что активность Notch1 может быть ингибирована во время онтогенетического периода, предшествующего детерминации индивидуальных типов клеток. Механизм подобного ингибирования неизвестен, но может быть обусловлен за счет экспрессии генов Fringe. Молекулы Fringe, как известно, регулируют активность Notch1 посредством гликозилирования рецептора, приводя к супрессии передачи сигналов Notch1, индуцируемых с помощью Jag1 (Hicks et al., 2000; Yang et al., 2005). Однако, способность молекул fringe супрессировать активацию notch варьирует между разными notch и fringe молекулами.

Следовательно, т.к. Lunatic Fringe не может ингибировать Jag1-зависимую активацию передачи сигналов Notch1, то Jag1 всё ещё может быть способен активировать передачу сигналов notch посредством др. рецептора Notch. Делеция Lfng не оказывает очевидного эффекта на развитие внутреннего уха (Zhang et al., 2000), указывая тем самым на потенциальное функциональное или компенсаторное перекрывание с помощью Radical или Manic Fringe. Фактически Manic Fringe, как сообщалось, экспрессируется в отоцисте как у рыбок данио, так и млекопитающих (Johnston et al., 1997; Qiu et al., 2004), но функциональное перекрывание не было изучено. В противоположность мутантам Lfng обнаруживается интригующий фенотип у животных с компаундной делецией Lfng и Jagged2 (Jag2). Делеция Jag2 ведет к избыточной продукции волосковых клеток, но делеция обоих Jag2 и Lfng ведет к частичной нормализации фенотипа Jag2 (Zhang et al., 2000). База этого эффекта не была установлена, но возможно одно из объяснений, что потеря Lfng приводит к эктопической активации Notch1 путем связывания Jag1 во время раннего развития отоциста. Т.к. Notch1, по-видимому, обеспечивает ингибирующий путь, то эктопическая активация этого пути может приводить к редукции размера просенсорного домена. Хотя это объяснение может объяснить фенотип, который возникает у Jag2/Lfng двойных мутантов, необходимы дальнейшие эксперименты для подтверждения.

Sox2 is necessary for formation of the prosensory domain

Активация сигнального пути notch, по-видимому, необходима для индукции образования просенсорных доменов. Учитывая, что специфические Notch молекулы, участвующие в просенсорной спецификации, не установлены, не является неожиданностью, что нижестоящие эффекторы этого пути неизвестны. Однако, недавние исследования показали, что HMG-box транскрипционный фактор Sox2 скорее всего является мишенью в этом пути. HMG-box транскрипционные факторы, как известно, играют важную роль в развитии нейрональных клонов у всех metazoans (Graham et al., 2003), а экспрессия Sox2 во внутреннем ухе млекопитающих первоначально коррелирует с образованием просенсорных доменов прежде, чем стать в конце концов ограниченной поддерживающими клетками (Uchikawa et al., 1999; Kiernan et al., 2005; Neves et al., 2007). Более того, просенсорное развитие или отсутствует или тяжело нарушено в двух Sox2 мутантных линиях (Kiernan et al., 2005). Lcc мыши обнаруживают полную потерю экспрессии Sox2 в ухе и полное отсутствие просенсорных доменов, тогда как Ysb мыши имеют достоверное снижение экспрессии Sox2 в ухе и соответственное уменьшение размеров просенсорных доменов. Однако, т.к. не обнаруживается экспрессии Sox2 у мышей Lcc на ст. E9.5, но мутация, которая ведет к потере Sox2 исключительно во внутреннем ухе, в этой линии не охарактеризована. Следовательно, возможно, что ограниченное количество экспрессии Sox2 может иметь место в очень ранний промежуток времени формирования уха. Экспрессия Sox2 отсутствует у условных мутантовJag1 (Kiernan et al., 2006), указывая тем самым, что передача сигналов Jag1-notch действует выше Sox2. Специфическая роль Sox2 в просенсорной спецификации неясна. Sox2, как было показано, необходим для перехода от пролиферирующих нейробластов к постмитотическим предшественникам в развивающейся ЦНС (Bylund et al., 2003; Graham et al., 2003), а потеря Sox2 во внутреннем ухе приводит к прекращению экспрессии, по крайней мере, одного регулятора клеточного цикла, p27^kip1, который. как известно, играет роль в просенсорных терминальных митозах (Kiernan et al., 2005). Но пока нет метода, позволяющего определить, может ли потеря Sox2 приводить к усилению клеточной пролиферации внутри просенсорного домена.

Интригующим для понимания роли Sox2 в ухе является наблюдение, что экспрессия Sox2 не ограничивается просенсорными доменами, а распространяется также на предшественники развивающегося cochlear и vestibular ганглиев (Neves et al., 2007). Это наблюдение указывает на возможность, что Sox2 не является инструктивным для формирования просенсорных областей, но вместо этого может генерировать уровень компетентности, который делает клетки способными отвечать на др. индуктивные сигналы. Согласуются с этим предположением предварительные результаты нашей лаб., что экспрессия Sox2 недостаточна для индукции просенсорных и волосковых клеток судеб в Kolliker's органе.

Tbx1 influences formation of prosensory domains

Финальный фактор, который играет роль в формировании просенсорных доменов это Brachyury родственный транскрипционный фактор, Tbx1. Tbx1 первоначально экспрессируется в задней-вентральной области отоциста, что коррелирует с положением первой экспрессии Bmp4 (Raft et al., 2004). Однако, экспрессия Tbx1 существенно снижается к E12.5 и пока неясно, экспрессируется ли Tbx1 в удлиняющемся канале улитки. Делеция Tbx1 ведет к существенным дефектам развития сенсорного эпителия внутреннего уха и к снижению экспрессии Bmp4. Сходным образом мутации в TBX1 человека ведут к синдрому DiGeorge, при котором потеря слуха превалирует (Vantrappen et al., 1998). Отсутствие сенсорного эпителия у Tbx1 мутантов вместе с ранним паттерном экспрессии согласуется с ролью в просенсорной спецификации. Однако, неясно, играет ли Tbx1 непосредственную роль в просенсорной спецификации или действует косвенно посредством регуляции формирования передне-заднего паттерна внутри отоциста (Raft et al., 2004). Фактически, некоторые маркеры передне-задних характеристик изменены у мутантов Tbx1 (Raft et al., 2004), подтверждая роль в формировании осевого паттерна отоциста. Маркеры осевого паттерна также изменены у мышей из BAC трансгенной линии 316.23, в которой TBX1 широко экспрессируется по всему отоцисту, а размер сенсорных областей увеличивается. Эти результаты подтверждают, что изменения в размере сенсорного эпителия могут быть связаны с аксиальной ре-спецификацией. Следовательно, необходим непосредственный тест способности Tbx1 индуцировать просенсорный домен путем форсированной экспрессии Tbx1 в органе Kolliker's.

Fgf signalling in prosensory development

Финальный сигнальный путь, который д.б. рассмотрен, как возможно играющий роль в просенсорном образовании, это путь fibroblast growth factor. Fgfs представляют собой семейство из 22 лигандов, но только 4 рецепторов (rev. Itoh and Ornitz, 2004). Т.к. сигнальный путь Fgf играет ключевую роль в ряде различных систем во время раннего эмбриогенеза, включая раннюю индукцию отоциста, ушей или целых эмбрионов, у многих Fgf мутантных мышей он нарушен ещё до образования улитки (rev. Wright and Mansour, 2003). Однако, роль Fgfr1 в развитии внутреннего уха была изучена у Fgfr1 гипоморфов и при условных делециях Fgfr1 с использованием FoxG1-Cre (Pirvola et al., 2002). В каждом случае наблюдалось дозово-зависимое снижение размера органа Корти и экспрессии Atoh1. Напротив вестибулярная система была нормальной. Эти результаты указывают на роль Fgfr1 в развитии улитки, но из-за отсутствия соотв. маркеров во время этого исследования затруднило определение специфической роли Fgfr1. Однако, необходимо отметить, что p75^ntr, который первоначально экспрессируется в субнаборе клеток внутри просенсорного домена улитки всё ещё экспрессируется у Fgfr1^flox/flox ;FoxG1^cre/+ мутантов, указывая на то, что Fgfr1 может действовать иерархически ниже образования просенсорных доменов. Недавно Millimaki et al. (2007) продемонстрировали, что Fgf3 и Fgf8 необходимы для экспрессии Atoh1 в отоцистах рыбок данио, подтверждая роль пути Fgf в детерминации волосковых клеток.

Regulation of cell number within the cochlear prosensory domain

После спецификации просенсорного домена следующей важной ступенью является регуляция количества клеток внутри этого домена. Во многих развивающихся системах нейронов, таких как спинной мозг, количество предшественников, которые обычно возникают превосходит финальное число зрелых нейронов и глиальных клеток. Как результат, ненужные предшественники элиминируются посредством апоптической гибели клеток (rev. Martin, 2001). Однако, уровень апоптической гибели клеток, наблюдаемый внутри просенсорного домена улитки удивительно мал (Chen et al., 2002), демонстрируя, что элиминации ненужных предшественников не происходит. Следовательно, инициальное количество клеток внутри просенсорного пула играет ключевую роль в его развитии. Как обсуждалось выше положение границ просенсорного домена детерминируется рядом всё ещё плохо изученных молекулярных путей передачи сигналов. Кроме того, т.к. формирование просенсорного домена происходит до завнршения терминальных митозов, то начало экспрессии регуляторов клеточного цикла используется как вторичный регуляторный механизм. В частности, cyclin kinase ингибитор p27^kip1 первоначально экспрессируется в канале улитки начиная со ст. E12.5 в виде паттерна, который предзнаменует апикально-базальный градиент терминальных митозов (Chen and Segil, 1999; Lee et al., 2006). Первоначально, p27^kip1 экспрессируется во всех просенсорных клетках, но в более поздний эмбриональный период экспрессия ограничивается развивающимися поддерживающими клетками. В соответствии с ролью в выходе из клеточного цикла, делеция p27^kip1 ведет к временному увеличению клеточной пролиферации и генерации добавочных волосковых и поддерживающих клеток (Chen and Segil, 1999; Lowenheim et al.,1999). Присутствие лишних клеток внутри улитки у мутантов p27^kip1 подтверждает гипотезу, что апоптическая гибель клеток не играет существенной роли в формировании паттерна клеток внутри кортиева органа.

Второй ингибитор клеточного цикла, pocket белок pRb, также регулирует терминальные митозы в канале улитки. Однако, экспрессия pRb , по-видимому, задержана относительно p27^kip1, с началом действия около E15.5 (Mantela et al., 2005). Более того, экспрессия pRb происходит в виде базально-апикального градиента, который направлен против апикально-базального градиента экспрессии p27^kip1 и терминальных митозов (Mantela et al., 2005). Наконец, клеточное распределение pRb не установлено. И Mantela et al. (2005)и Sage et al. (2005) описывают слабую экспрессию pRb белка в большей части клеток внутри улитки на ст. E12.5, в более поздние моменты времени Sage et al. описывают экспрессию pRb как в волосковых, так и поддерживающих клетках, тогда как Mantela et al. наблюдали экспрессию pRb только в волосковых клетоках. Однако, важность pRb была продемонстрирована в исследованиях, которые использовали или cre-lox ( pRb^flox/flox ;Col1A1^Cre/+) или гипоморфную (mgRb:Rb^-/- )стратегии восстановления, чтобы генерировать pRb мутантных мышей, которые доживали до рождения (Sage et al., 2005; Mantela et al., 2005). Интересно, что оба исследования описывают дефекты пролиферации, которые согласуются с их наблюдаемыми паттернами экспрессии. Sage et al. описывают начало пролиферации как волосковых, так и поддерживающих клеток внутри улитки, тогда как Mantela et al. наблюдали пролиферацию только волосковых клеток. Однако, в обоих исследованиях наблюдалась большая избыточная продукция как волосковых, так и поддерживающих клеток. Повышенные количества поддерживающих клеток подтверждают заключение Sage et al. (2005), однако, также возможно, что дополнительные поддерживающие клетки возникают как результат рекрутирования из окружающих избыточных волосковых клеток. Необходимы дополнительные исследования для разрешения этих противоречивых выводов. Помимо избыточной продукции волосковых клеток antela et al. (2005) описали также заметное увеличение апоптической гибели волосковых клеток у mgRb:Rb^-/- мышей между E17.5 и E18.5. Основы этой клеточной гибели неясны. Инактивация pRb, как было установлено, непосредственно индуцирует апоптоз посредством E2f1/p53/Apaf1 пути (Morgenbesser et al., 1994; MacLeod et al., 1996; Tsai et al., 1998), но делеция или E2f1 или Apaf1 на фоне mgRb:Rb^-/- не устраняла апоптоза, указывая тем самым, что др. аспекты делеции pRb ответственны за индукцию клеточной гибели. Sage et al. (2005) отмечают отсутствие увеличения апоптической гибели клеток в улитке в своем инициальном исследовании, но наблюдали апоптоз в последующем исследовании с использованием альтернативного Cre-driver (Sage et al., 2006).

Наконец два дополнительных CKIs, p21^cip1 и p19^ink4d, также экспрессруются в просенсорном домене, начиная между E14.5 и E16.5 (Chen et al., 2003; Laine et al., 2007). Неожиданно делеция обоих генов не затрагивала инициального паттерна терминальных митозов или клеточную дифференцировку (Laine et al., 2007). Однако, хотя делеция p21^cip1 и не имела видимого эффекта на поддержание митотического молчания (Laine et al., 2007), потеря p19^ink4d вызывала усиление скорости спонтанных митозов волосковых клеток, начиная с постнатального периода (Chen et al., 2003). Делеция и p19^ink4d и p21^cip1 вызывала прекращение инициации митозов в волосковых клеток, начиная с P3 (Laine et al., 2007). У p19^ink4d и у двойных мутантов p19^ink4d; p21^cip1 повторное вступление в клеточный цикл сопровождалось клеточной гибелью, подтверждая, что активация пролиферации не совместима с функцией волосковых клеток (Chen et al., 2003; Laine et al., 2007). В целом результаты этих исследований продемонстрировали, по крайней мере, две важные роли контроля клеточных циклов в развитии улитки. Во-первых, время терминальных митозов действует как регуляторный механизм, чтобы контролировать общее количество клеток внутри просенсорного домена. Т.к. естественное возникновение апоптической гибели клеток является редким в просенсорном домене, поэтому регуляция количества клеток является ключевым механизмом детерминации просенсорного размера. Во-вторых, поддержание постмитотического состояния, по-видимому, необходимо для жизнеспособности и функции волосковых клеток, и множественные ингибиторы клеточного цикла экспрессируются в волосковых клетках, чтобы гарантировать митотическое молчание.

Наконец, уникальные апикально-базальные паттерны экспрессии p27^kip1 и терминальных митозов подчеркивают один из наиболее интригующих аспектов развития улитки. Начало клеточной дифференцировки в улитке также происходит в виде градиента, распространяющегося вдоль улитки, но в данном случае это базально-апикальный градиент, который возникает примерно на ст. E14.5 и не завершается вплоть до E16.5. Как результат просенсорные клетки, расположенные в верхушке улитки становятся постмитотическими на ст. E12.5, но не начинают дифференцироваться в течение последующих 4-х дней. В наиболее разработанных системах существуют очень тесные взаимоотношения между выходом из клеточного цикла и началом дифференцировки (rev. Gotz and Huttner, 2005; Nguyen et al., 2006). Фактически, гены bHLH как было показано, конкурентно противодействуют клеточной пролиферации и индуцируют детерминацию и дифференцировку клеток (Farah et al., 2000; Le et al., 2006; Battiste et al., 2007). Следовательно, присутствие недетерминированных постмитотических просенсорных клеток представляет собой сохранение довольно редкого клеточного состояния. Факторы, которые обеспечивают этот статус, и что более важно, биологическую основу их существования, еще предстоит определить.

Specification of individual phenotypes within the co- chlear prosensory domain

Atoh1 is a commitment factor for the hair cell fate Вследствие спецификации просенсорного домена, индивидуальные просенсорные клетки д. детерминироваться к развитию всех уникальных клеточных типов внутри органа Корти. Первой ступенью в этом процессе является начало экспрессии basic helix-loop-helix транскрипционного фактора, Atoh1 (первоначально Math1), который первоначально экспрессируется в относительно широкой и диффузной полосе клеток, начиная с основания улитки приблизительно на ст. E12.5 и быстро распространяется в направлении верхушки (Lanford et al., 2000; Woods et al., 2004). Внутри этой полосы Atoh1 слабо экспрессируется в клетках, локализованных по всей толщине эпителия между базальной мембраной и поверхностью, обращенной в просвет. По ходу развития индивидуальные клетки, с повышенными уровнями экспрессии Atoh1, могут быть идентифицированы внутри первоначально диффузной полосы (Woods et al., 2004). На ст. E16, клетки, которые строго экспрессируют Atoh1, могут быть идентифицированы как развивающиеся волосковые клетки, тогда как находящиеся между ними Atoh1-негативные клетки развиваются в поддерживающие. Базируясь на этом паттерне экспрессии, Atoh1 является самым ранним экспрессирующимся геном, который в конечном итоге ограничивается волосковыми клетками. Необходимо отметить, что существуют некоторые противоречия относительно времени и паттерна экспрессии Atoh1. Паттерн, описанный выше, базируется на исследованиях, использовавших Atoh1 knock-in репортерных мышей или гибридизацию in situ. Однако, трансгенные Atoh1 репортерные мыши и иммуногистохимия указывают на то, что экспрессия Atoh1 не начинается вплоть до ст. E14 и ограничена развивающимися волосковыми клетками (Chen et al., 2002; Fritzsch et al., 2005). Наконец, PCR амплификация была использована, чтобы продемонстрировать, что транскрипты для Atoh1 присутствуют в отоцисте на ст. E11.5 (Matei et al., 2005). Однако, т.к. вестибулярный сенсорный эпителий также присутствует в этих выборках, то невозможно сделать вывод относительно экспрессии Atoh1 в улитке в этот момент времени. Причина наблюдаемых различий времени и паттерна экспрессии Atoh1 не вполне ясна. Задержка между промоторной активностью и мРНК в противовес белку может быть результатом задержки трансляции или ограниченной чувствительности к антителам. Если антитела обладают ограниченным уровнем чувствительности, то он может быть обнаружен только в клетках с высокми уровнем экспрессии Atoh1. Для трансгенного Atoh1 репортера задержка, по-видимому, возникает в результате того, что трансгенная конструкция не включает всех элементов промотора Atoh1 в частности отсутствуют регеионы промотора, которые регулируют инициальную экспрессию Atoh1 (Lumpkin et al., 2003). Однако, возможно также, что результаты анализа промоторной активности и мРНК могут включать или неспецифическую экспрессию β-galactosidase в случае репортерной линии мышей или трудностей в дискриминации между низкими уровнями мРНК Atoh1 и фоновыми уровнями щелочной фосфатазной активности в случае гибридизации in situ. Ясно, что необходимо отслеживание клонов с использованием Atoh1-Cre knock-in мышей для решения вопроса об инициальной экспрессии Atoh1. Сходные эксперименты проведены с использованием Atoh1-Cre трансгенных линий (Matei et al., 2005), но т.к. эта конструкция также не содержала полного набора промоторных элементов Atoh1, то результаты имели те же самые ограничения. Даже если так, то результаты этих клональных экспериментов демонстрируют экспрессию Atoh1 в некоторых типах поддерживающих клеток, что согласуется идеей, что инициальный паттерн экспрессии Atoh1 не ограничен волосковыми клетками. Контрастирующие данные относительно паттерна и времени экспрессии Atoh1привели к множественным гипотезам относительно специфической роли Atoh1. Было предположено, что Atoh1 действует как просенсорный ген, который специфицирует популяцию просенсорных клеток. Напротив, более ограниченный паттерн экспрессии, наблюдаемый с помощью меченных антител ведет к гипотезе, что Atoh1 действует исключительно как фактор дифференцировки волосковых клеток (Chen et al., 2003). Фенотип мышей с целенаправленной делецией Atoh1, которая вызывает полное отсутствие волосковых и поддерживающих клеток внутри улитки (хотя некоторые поддерживающие клетки или клетки, подобные поддерживающим, присутствуют в вестибулярном эпителии) более согласуется с просенсорной ролью, но этот фенотип может быть также объяснен ролью волосковых клеток в формировании поддерживающих клеток (Woods et al., 2004). Напротив, паттерны экспрессии Sox2 и p27^kip1, оба из которых экспрессируются по всему просенсорному домену, не затронуты у Atoh1 мутантов, указывая тем самым, что Atoh1 не играет роли в просенсорном формировании.

Чтобы понять роль Atoh1 в некоторых лаб. форсировали клетки внутри Kolliker's органа, чтобы экспрессировать Atoh1. Zheng et al. (2000) продемонстрировали, что непрерывная экспрессия Atoh1 ведет к формированию эктопических волосковых клеток в Kolliker's органе культур эксплантов улитки от новорожденных крыс. Woods et al. (2004) временно экспрессировали Atoh1 в культурах клеток внутри Kolliker's органа, чтобы протестировать гипотезу, что временная активация достаточна, чтобы индуцировать просенсорные характеристики. Хотя временная активация Atoh1 оказалась достаточной для индукции кластеров клеток, которые включали и волосковые клетки, последующие эксперименты продемонстрировали, что присутствие волосковых клеток достаточно, чтобы индуцировать соседние клетки внутри Kolliker's органа, которые развивались как поддерживающие клетки. Экспрессия Atoh1 не нужна в этих соседних клетках, это указывает на то, что хотя Atoh1 может экспрессироваться в клетках, которые в конечном итоге станут поддерживающими клетками, эта экспрессия не нужна этим клеткам, чтобы приобрести судьбу поддерживающих клеток. Woods et al. (2004) полагают, что Atoh1 действует как фактор спецификации волосковых клеток после экспрессии во внутреннем ухе, запуская молекулярную программу, которая если не ослабевает, то д. в конечном итоге заставить просенсорные клетки развиваться по пути волосковых.

Демонстрация, что клетки внутри Kolliker's органа могут быть индуцированы к развитию или как волосковые клетки, благодаря экспрессии Atoh1 или как поддерживающие клетки, благодаря непосредственной близости к волосковым клеткам, подтверждает, что концепция просенсорного домена, как уникального, компетентного к развитию волосковых и поддерживающих клеток, может быть не корректной. Вместо этого просенсорные домены могут представлять собой регионы внутри внутреннего уха, которые являются пермиссивными по или обладают более высокой вероятностью развития в качестве сенсорного эпителия. Альтернативно, регионы внутреннего уха, которые не развиваются как сенсорные, могут испытывать влияние с помощью ингибирующих сигналов, которые обычно предупреждают клетки в этих регионах от приобретения судеб или просенсорных. Наконец, возможно также, что Kolliker's представляет собой уникальную клеточную популяцию, которая сохраняет повышенную способность развиваться как просенсорные клетки. Основы такой способности неясны, но она может быть связана с эволюционной историей этой области канала улитки.

Результаты, представленные выше подчеркивают критическую роль Atoh1 в формировании волосковых клеток и органа Корти. Если Atoh1 первоначально экспрессируется слабо по всему просенсорному домену, то эта экспрессия, по-видимому, ведет к инициальной детерминации во всех этих клетках судьбы волосковых клеток и, следовательно, к необходимости последующих межклеточных взаимодействий, чтобы ограничить количества просенсорных клеток, которые в конечном итоге будут давать волосковые клетки. Однако, недавнее исследование вносит сомнение относительно веры. что Atoh1 является абсолютно необходимым для образования волосковых клеток. Du et al. (2007) получили химерных мышей их клеток дикого типа (WT) и Atoh1^-/-. Как и ожидалось, волосковые клетки, происходящие из WT клеток, обнаруживались во внутреннем ухе этих животных. Но неожиданно Atoh1^-/- также давали волосковые клетки. Этот результат указывает на то, что хотя Atoh1 и необходим для образования волосковых клеток, потребность в нем может быть меньшей в присутствии уже существующих волосковых клеток. Объяснение того, как такое восстановление судеб волосковых клеток происходит не очевидно, но существует одна возможность, что существующие волосковые клетки способны индуцировать др клетки, чтобы активировать программы детерминации и дифференцировки волосковых клеток, стоящие ниже Atoh1.

Id and notch signaling act to limit Atoh1 expression and hair cell formation

Atoh1 является членом родоначального семейства bHLH транскрипционных факторов (Jones, 2004; Rebeiz et al., 2005). Множественные исследования на др. системах, в частности на нервной системе Drosophila, выявляют специфические ингибирующие взаимодействия между bHLH молекулами и некоторыми др. сигнальными путями. Среди них notch и id пути, регулирующие экспрессию Atoh1 во внутреннем ухе. Ids (Inhibitors of differentiation and DNA binding) являются HLH молекулами, которые тесно родственны bHLHs по структуре, но лишены basic домена (rev. Norton, 2000; Perk et al., 2005). Чтобы регулировать транскрипцию, bHLH молекулы д. прежде всего сформировать гетеродимеры с повсеместно экспрессируемыми bHLHs, обозначаемыми E-proteins (E2-2, HEP, E12 и E47), посредством своих HLH доменов. После гетеродимеризации basic домены соединяются со специфическими сайтами распознавания ДНК. Ids, лишенные basic домена и поэтому неспособны связывать ДНК, поэтому они действуют как антагонисты bHLHs благодаря конкуренции за и секвестрации E-proteins. Во время эмбриогенеза экспрессия Id обычно снижается приблизительно во время, когда клетки предшественники выходят из клеточного цикла и начинают дифференцироваться, паттерн, который согласуется с ролью в регуляции времени дифференцировки (Jen et al., 1996; 1997).

Внутри улитки 3 из 4-х Id генов, Ids1,2 и 3 широко экспрессируются между E12 и E14 (Jen et al., 1996; Jones et al., 2006). Однако, на ст. E16 экспрессия всех трех Id генов подавляется в развивающихся волосковых клетках (Jones et al., 2006). Подавление экспрессии Id коррелирует с увеличением экспрессии Atoh1 в тех же самых клетках и указывает на то, что потеря экспрессии Id может приводить к усилению экспрессии Atoh1, что и наблюдается в развивающихся волосковых клетках приблизительно в то же самое время. В соответствии с этой гипотезой больше 90% просенсорных клеток, которые форсированы для поддержания экспрессии Id3 после момента времени негативной регуляции, формируются как поддерживающие клетки (Jones et al., 2006). Напротив, только 50% просенсорных клеток, которых заставляли экспрессировать контрольный вектор, развивались как поддерживающие клетки.

Путь передачи сигналов notch обсуждался в разделе просенсорной детерминации как позитивный регулятор просенсорной судьбы. Однако, классическая передача сигналов notch обычно ассоциирует с ингибирующими взаимодействиями, при которых активация notch предупреждает клетки предшественники от принятия предпочтительной или "primary" клеточной судьбы (rev. Ehebauer et al., 2006). Т.к. и notch лиганды и рецепторы связаны с мембранами, то эти сигнальные взаимодействия часто ассоциируют с образованием клеточного мозаицизма. Исходя из этих результатов, не является неожиданным, что передача сигналов notch играет критическую роль в формировании мозаицизма в улитке. Было продемонстрировано, что Notch1, широко экспрессируется в канале улитки, включая просенсорный домен (Lanford et al., 1999). Как только клетки начинают развиваться как волосковые, в этих клетках усиливается экспрессия двух notch лигандов, Jagged2 (Jag2) и Delta-like 1 (Dll1) , первые признаки экспрессии появляются приблизительно на ст. E14 в базальном регионе улитки и затем она распространяется в направлении верхушки (Lanford et al., 1999; Morrison et al., 1999). В течение 24 ч экспрессии лиганда активированный Notch1 обнаруживается в соседних клетках (Murata et al., 2006), также как и экспрессия, по крайней мере, двух notch генов мишеней, HES1 и HES5 (Zheng et al., 2000; Zine et al., 2001; Lanford et al., 2000). Клетки, которые экспрессируют HES1 или HES5 д. развиваться как поддерживающие клетки. Два др. notch гена мишени, Hey и HeyL, также могут экспрессироваться в поддерживающих клетках, но их паттерны внутри улитки ещё не определены. Такой паттерн экспрессии полностью согласуется с notch-обусловленной латеральной ингибицией и указывает на то, что развивающиеся волосковые клетки удерживают своих соседей от принятия сходной судьбы. Имеется большое количество данных о развивающейся эмбриональной улитке мышей и о развивающейся и регенерирующей basilar papilla кур, которые подтверждают эту гипотезу. В обеих системах устранение развивающихся или существующих волосковых клеток позволяет соседним, не-волосковым клеткам, изменять свои судьбы и развиваться как замещающие волосковые клетки (Kelley et al., 1995; Adler et al., 1996; Roberson et al., 1996; Roberson et al., 2004; Duncan et al., 2006). На молекулярном уровне данные, согласующиеся с гипотезой, подтверждают, что передача сигналов notch действует, чтобы подавлять слабую экспрессию Atoh1, которая первоначально обнаруживается в просенсорных клетках. В частности, делеция Notch1, Jag2, Dll1, HES1 или HES5 ведет к избыточной продукции волосковых клеток (Lanford et al., 1999; Zheng et al., 2000; Zine et al., 2001; Keirnan et al., 2006). Более того, компаундная делеция Jag2 и Dll1 приводит к еще большей избыточной продукции, чем у одиночных мутантов, указывая на аддитивный эффект (Kiernan et al., 2006). Делеция др. генов, которые регулируют предачу сигналов Notch, таких как Rbp-J (Yamamoto et al., 2006) или COUP-TFI (Tang et al., 2006) также ведет к усилению продукции волосковых клеток. Наконец, инициальная экспрессия Atoh1, по-видимому, не затрагивается у Jag2 мутантов, но в большее количество клеток остается Atoh1 позитивными после нормального начала Jag2 (Lanford et al., 2000), указывая на то, что роль передачи сигналов notch заключается в ингибировании Atoh1. Эта гипотеза подтверждается также демонстрацией, что ко-экспрессия HES1 достаточна, чтобы ингибировать способность Atoh1 индуцировать волосковые клетки в Kolliker's органе (Zheng et al., 2000) и наблюдением, что временная активация Atoh1 в кластерах клеток Kolliker's органа ведет к активации пути notch (Woods et al., 2004).

Результаты, рассмотренные выше, подтверждают, что рассортировка просенсорных клеток на волосковые и поддерживающие клетки происходит благодаря последующим взаимодействиям. Первоначально все просенсорные клетки инициируют слабую экспрессию Atoh1, которая, если не ослабевает, то д. приводить к развитию волосковых клеток. В то же самое время те же самые клетки являются позитивными по Ids 1,2,3. Присутствие Ids предупреждает Atoh1 от соединения с E-белками и активирует транскрипцию генов, специфичных для волосковых клеток. Кроме того, Atoh1, как было показано, способствует своей собственной транскрипции (Helms et al., 2000), так что экспрессия Id может также предупреждать активацию позитивной петли обратной связи для Atoh1. Вскоре после начала экспрессии Atoh1, экспрессия Id подавляется в субнаборе клеток внутри просенсорного домена. Факторы, которые обеспечивают это подавление только в небольшом наборе клеток, неизвестны. Однако, как только оказываются подавленными Ids в этих клетках, репрессия позитивной петли обратной связи Atoh1 устраняется и эти клетки оказываются способными увеличивать уровень экспрессии Atoh1.

Среди инициальных мишеней для этой увеличенной экспрессии Atoh1 находятся notch лиганды Jag2 и Dll1. Экспрессия этих лигандов в развивающихся волосковых клетках ведет к активации Notch1 (Murata et al., 2006) и экспрессии нижестоящих мишеней HES1 и HES5 в соседних клетках. Комбинация экспрессии Id вместе с HES1/5 достаточна, чтобы погасить экспрессию Atoh1 и детерминацию волосковых клеток в этих клетках.

Development of supporting cells

В результате сигнальных взаимодействий Atoh1/Id/Notch клетки внутри просенсорного домена достигают точки, на которой экспрессия Atoh1 или усиливается и клетки оказываются в процессе развития волосковых клеток, или экспрессия Atoh1 падает или теряется приводя в результате к потере детерминации волосковых клеток. Эта вторая популяция клеток, которая предположительно развивается как поддерживающие клетки. Факторы, которые индуцируют эти клетки, в основном неизвестны. Однако, эктопические волосковые клетки в Kolliker's органе рекрутируют окружающие клетки, чтобы сформировать из них поддерживающие клетки, демонстрируют, что волосковые клетки генерируют индуктивные сигналы для развития поддерживающих клеток (Woods et al., 2004).

Молекулярная природа индуктивных сигналов для общего развития поддерживающих клеток не установлена. Однако, имеются доказательства роли сигнального пути fibroblast growth factor в развитии pillar клеток, уникального типа поддерживающих клеток внутри кортиева органа. Fgfr3 первоначально экспрессируется в популяции клеток внутри просенсорного домена улитки, начиная с E15.5 (Peters et al., 1993; Pirvola et al., 1995, Mueller et al., 2002). Домен экспрессии Fgfr3, по-видимому, включает клетки, которые развиваются как pillar клетки, наружные волосковые клетки и Deiters' клетки, хотя не было проведено отслеживание дефинитивных клонов. Медиальная граница этого домена очень острая и располагается непосредственно рядом с развивающимися внутренними волосковыми клетками. Делеция или ингибирование передачи сигналов Fgfr3 ведет к нарушению как детерминации. так и дифференцировки pillar клеток (Colvin et al., 1996; Mueller et al., 2002; Puligilla et al., 2007). В частности, многие внутренние pillar клетки отсутствуют, подтверждая дефект детерминации, тогда как наружные pillar присутствуют, но, по-видимому, не дифференцированы (Puligilla et al., 2007). Напротив, делеция Sprouty2, антагониста Fgfr, который экспрессируется в виде паттерна, сходного с Fgfr3, приводит к формированию дополнительных pillar клеток (Shim et al., 2005).

Наконец, Fgf8, Fgf с высокой связывающей активностью в отношении Fgfr3, инициально экспрессируется исключительно в развивающихся внутренних волосковых клетках, начиная с E15.5, указывая на индуктивное взаимодействие между внутренними волосковыми клетками и соседними клетками предшественниками (Pirvola et al., 2002; Jacques et al., 2007). В согласии с этой гипотезой условная делеция Fgf8 также приводит к дефектам в развитии pillar клеток, хотя фенотип менее тяжелый, чем у мутантов Fgfr3 mutants (Jacques et al., 2007). Более того, повышенные уровни Fgf8 ведут к усилению экспрессии маркеров pillar клеток внутри домена экспрессии Fgfr3 (Jacques et al., 2007). В дополнение к уменьшению количества pillar клеток улитка у мутантных Fgfr3 мышей также содержит достоверно более высокое количество наружных волосковых клеток, указывая тем самым, что Fgfr3 может также действовать, чтобы ингибировать образование волосковых клеток возможно в области между внутренними и наружными pillar клетками (Puligilla et al., 2007). Анализ изменений в экспрессии генов показывает усиление передачи сигналов Bmp4 в улитке мутантов Fgfr3, а in vitro эксперименты демонстрируют, что Bmp4 действует, чтобы индуцировать образование наружных волосковых клеток. Эти результаты предоставляют интригующие данные, указывающие на то, что пути передачи сигналов Fgf и Bmp могут взаимодействовать внутри домена pillar cell/outer hair cell, чтобы сформировать правильный паттерн этой области в органе Корти.

Fig. 4. Determination of cell fates in the organ of Corti. Cells located within the otocyst can develop along one of four different pathways. As cochlear prosensory cells, as closely related vestibular prosensory cells, as cells that will give rise to neurons in the auditory and vestibular ganglia or as non-sensory epithelia. Cells that will develop as cochlear prosensory cells initially express a number of genes that have been shown to play a role in prosensory specification, including Tbx1, Jag1, Lfng, Fgfr1 and Sox2 (see text for details). Following prosensory specification, all prosensory cells express Atoh1 leading to the initiation of a hair cell specification program. At the same time, prosensory cells also express Ids1, 2 and 3 which act to inhibit Atoh1 activity. Id expression is subsequently down-regulated in cells that will develop as hair cells, leading to an increase in the level of Atoh1 expression and the initiation of expression of the notch ligands, Jag2 and Dll1. Expression of notch ligands leads to activation of the Notch1 and the downstream target genes HES1 and HES5, in neighboring cells. The presence of HES genes along with continued expression of Ids leads to loss of Atoh1 expression. At the same time, developing hair cells produce inductive signals, including activation of the Fgf signaling pathway, that recruit surrounding cells to develop as supporting cells. While Fgf signaling clearly plays a role in the development of some types of pillar cells, other unidentified inductive signals (indicated by “?”) are also assumed to exist.

Summary

As the cochlear duct extends, its floor becomes partitioned into three regions, a central prosensory domain and two non-sensory flanking domains. Our understanding of the factors that specify the prosensory domain remains limited, but activation of the notch signaling pathway and the transcription factor Sox2 play impor- tant roles. Within the prosensory domain, expression of Atoh1 initiates a genetic program that, if unabated, will ultimately lead to the development of a hair cell. However, as a result of cellular and genetic interactions involving the Id and notch signaling pathways, only a subset of cells within the prosensory domain are able to develop as hair cells. Other prosensory cells are diverted from the hair cell fate and are subsequently induced to develop as supporting cells (Fig. 4).

From this summary it is clear that our understanding of the development of the organ of Corti has improved dramatically in the last 10 years. But it should be emphasized that at this point we have only elucidated general signaling interactions that apply to essentially all hair cell epithelia. With the exception of Fgf signal- ing, the interactions and molecules that regulate the development of the many unique aspects of the organ of Corti, such as the development of inner and outer hair cells and the alignment of cells into ordered rows, remain unknown. Hopefully the continu- ing examination of the effects of different genetic mutants on cochlear development and the development of better and more specific mouse lines for inner ear or cochlear specific genetic deletion will result in a better understanding of how this fascinat- ing structure develops.

Cellular commitment and differentiation in the organ of CortiMATTHEW W. KELLEY Int. J. Dev. Biol. 51: 571-583 (2007) doi: 10.1387/ijdb.072388mk

Cellular commitment and differentiation in the organ of Corti
MATTHEW W. KELLEY
Int. J. Dev. Biol. 51: 571-583 (2007) doi: 10.1387/ijdb.072388mk