REST считается основным репрессором нейрогенеза^2-5, а активация с помощью REST генов мишеней достаточна для превращения нейральных стволовых и клеток предшественников в нейральные фенотипы^6,7. Однако, активность REST, по-видимому, зависит от клеточного контекста; напр., REST может обнаруживать как онкогенную^8-10, так и опухоли супрессирующую функцию⁵, а также участвует в гематопоэтической и кардиальной дифференцировке^3-5. Embryonic stem (ES) клетки являются плюрипотентными, которые обладают потенциалом как бесконечно самообновляться, так и дифференцироваться во все три зародышевых листка тела¹¹. Получены доказательства, что REST выполняет уникальную роль как защитник само-обновления и плюрипотентности ES клеток мышей, соответствуя экспрессия критических регуляторов, таких как Oct4, Nanog, Sox2 и c-Myc. Определяли уровни REST белка в ES клетках мышей, растущих в условиях само-обновления и в условиях дифференцировки (Fig. 1a; ES and EB, соотв.). Как и ожидалось, western blotting показал, что ES обладают более высокими уровнями экспрессии REST и наиболее репрезентативных маркеров само-обновления (белки Oct4, Sox2 и c-Myc) по сравнению с EB клетками, указывая тем самым. что экспрессия REST связана с само-обновлением. Чтобы определить, регулирует ли REST само-обновление ES клеток мышей, авт. использовали два подхода с двумя клеточными линиями - YHC334 (YHC) и RRC160 (RRC) (see Supplementary Information). В первом использовали polymerase chain reaction with reverse transcription (RT-PCR; Fig. 1b), quantitative RT-PCR (qRT-PCR; Fig. 1c) использовал др. набор праймеров, чем тот, который использовался для регулярной RT-PCR, и western blotting (Fig. 1d), каждый из них показал, что обе линии Rest^+/- мышиных ES клеток (YHC и RRC) исели существенно более низкие уровни транскриптов и белка Res, чем ES клетки родителей. Метод щелочной фосфатазы¹², использовался для измерения само-обновляемости у этих клеток, он показал, что уровни само-обновления в обеих Rest^+/- ES клеточных линиях были более чем наполовину ниже, чем в родительских ES клетках мышей (Fig. 1e, f). При втором подходе, исключается любая адаптивная реакция накопления с помощью Rest^+/- ES клеточных линий мышей, мы определяли, является ли пониженное самообновление, наблюдаемое в Rest^+/- ES клетках мышей, будет наблюдаться также в ES клетках мышей, обработанных короткими interfering RNA (siRNA) против Rest мРНК (siRest). qRT-PCR метод подтвердил, что siRNA-обработанные клетки действительно имеют пониженные уровни Rest и Oct4, демонстрируя 50% нокдаун Rest и Oct4, соотв., в siRest- и siOct4-обработанных клетках (Fig. 1g). Это в дальнейшем было подтверждено с помощью western blotting (Fig. 1h). Метод самообновления этих клеток (Fig. 1i) затем показал. что в то время как мышиные ES клетки, обработанные non-targeting контрольными (NT) siRNA. почти не обнаруживают изменений по самообновлению (94.5%), мышиные ES клетки, обработанные siRest, обнаруживают приблизительно 50% снижение самообновления (see Supplementary Fig. 1 в отношении эффекта 4-х разных siRest конструкций на способность самообновления ES клеток мышей). SiOct4-обработанные мышиные ES клетки также обнаруживают снижение самообновления (47%), это согласуется с ролью Oct4 в самообновлении мышиных ES клеток¹³. Т.о., siRest-обусловленный нокдаун транскриптов Rest transcripts и не nonspecific активность siRNA вызывают снижение самообновления мышиных ES клеток, результат, сходный с тем. что наблюдается в линиях Rest^+/- ES клеток мышей. Эксперименты по избыточности функции (Fig. 1j), в которых самообновляющиеся мышиные ES клетки трансфицировали в плазмиды, кодирующие ген резистентности к neomycin и или green fluorescent protein (GFP) или REST¹², показали, что клетки, трансфицированные GFP, обнаруживают очень низкий уровень поддержания самообновления, тогда как клетки, трансфицированные REST, обнаруживают примерно 55% уровень поддержания самообновления. Всё это подтверждает роль REST в поддержании самообновления мышиных ES клеток. Чтобы определить клоны, в которые Rest^+/- гаплонедостаточные мышиные ES клетки дифференцируются после выхода из REST-обусловленного самообновления осуществляли RT-PCR (Fig. 2a) и qRT-PCR (Fig. 2b) родительских мышиных ES клеток, YHC и RRC клеток, растущих в условиях самообновления в присутствии leukaemia inhibitory factor (LIF). Rest^+/- клетки обнаруживали активацию маркеров, специфичных для мезодермы, энтодермы, эктодермы и трофоэктодермы. Экспрессия всех этих маркеров дифференцировки отсутствовала или обнаруживалась на очень низком уровне в самообновляющихся родительских мышиных ES клетках. Эти результаты в RRC клетках (data not shown) и YHC клетках были очень сходны. Заметим, хотя нейрональный маркерный ген Calbindin является непосредственной мишенью REST1, др. маркеры дифференцировки, пока неясно, являются ли прямыми мишенями для REST, это указывает на то, что REST может поддерживать плюрипотентность мышиных ES клеток частично посредством прямой репрессии экспрессии некоторых генов дифференцировки и частично за счет косвенного механизма, в котором non-REST-target гены дифференцировки репрессируются как следствие REST-обеспечиваемого поддержания самообновления. Дифференцировка Rest^+/- гаплонедостаточных клеток во множественные клоны, растущие в условиях самообновления, подсказала нам определить характеристики дифференцировки EB клеток, произошедших от дикого типа и Rest^+/- ES клеток. RT-PCR of Rest^+/- EB клеток выявил экспрессию маркеров для всех клонов, включая эктодерму, мезодерму, энтодерму и трофэктодерму (Fig. 2c). Некоторые из этих маркеров или отсутствовали или заметно были редуцированы у дикого типа ES-клеток, произошедших из EB клеток. Т.о., хотя дикого типа и Rest^+/- клетки начинали экспрессию множественных маркеров дифференцировки в EB клетках, Rest^+/--производные клетки экспрессировали большие количества клональных маркеров, чем EB клетки. произошедшие из дикого типа мышиныe ES клеток, указывая тем самым, что нехватка REST предрасполагает мышиные ES клетки к дифференцировке. Чтобы определить, дифференцируются ли siRest-обработанные мышиные ES клетки также в различные клоны, мы использовали qRT-PCR метод применительно к этим клеткам. растущим в условиях самообновления (Fig. 2d). Эти результаты показали, что siRest в самом деле усиливает экспрессию маркеров разных клонов. Отметим. что точный уровень экспрессии каждого маркера дифференцировки варьирует между siRest-обработанными и Rest^+/- мышиными ES клетками (Fig. 2b), по-видимому, из-за различий в методах, использованных для редукции уровня REST в этих клетках (т.е., в то время как Rest^+/- клетки могут обнаруживать дополнительные адаптивные реакции как результат более длительного культивирования, чем siRest-обработанных мышиных ES клеток, (последние обнаруживают более непосредственные эффекты REST нокдауна). Тем не менее общие результаты указывают на то, что выходящие из REST-обусловленного самообновления siRest-обработанные клетки дикого типа и Rest^+/- мышиные ES клетки были способны дифференцироваться в разные клоны. Внутренняя клеточная масса бластоциста, как было установлено, содержит самообновляющиеся клетки, которые экспрессируют такие белка, как Nanog, Oct4 и Sox2. Чтобы определить, экспрессируется ли REST в бластоцистах, анализировали бластоцисты мыши с помощью двойной иммунофлюоресценции, используя anti-REST антитела и антитела против Nanog, Oct4 или Sox2. В соответствии с её ролью в самообновлении мышиных ES клеток, REST ко-экспрессировался с этими регуляторами самообновления во внутренней клеточной массе бластоциста (Fig. 2e) (see Supplementary Information for a discussion on the role of REST in cells of the inner cell mass).

Когда позволяли родительским мышиным ES клеткам и Rest^+/- (YHC and RRC) гаплонедостаточным клеткам расти в условиях самообновления , чтобы с помощью метода RT-PCR исследовать уровни транскрипции различных маркеров самообновления, мы установили, что пониженные уровни REST в Rest^+/- клетках соответствуют пониженным уровням транскриптов и некоторых др. генов самообновления, таких как Oct4, Nanog, Sox2, Tbx3 и c-myc (Fig. 3a), это указывает на то, что REST защищает экспрессию этих генов самообновления. Western blot анализ тех же самых клеток также показал, что Rest^+/- клетки обнаруживают существенно сниженные уровни белков c-Myc и Oct4 по сравнению с родительскими мышиными ES клетками (Fig. 3b), указывая тем самым, что подавление REST негативно влияет на сигналы самообновления. Чтобы подтвердить дальнейшую роль REST в поддержании сигналов самообновления, мы предприняли тот же самый эксперимент, показанный на Fig. 1j, в котором эндогенно добавленный REST поддерживал самообновление мышиных ES клеток, растущих в условиях дифференцировки и затем анализировали экспрессию c-Myc и Oct4 с помощью western blotting. Как показано на Fig. 3c, экзогенно добавляемый REST, но не GFP, поддерживал уровни белков c-Myc и Oct4 в мышиных ES клетках, растущщих в условиях дифференцировки. Всё это указывает на то, что REST защищает экспрессию некоторых генов самообновления.

Чтобы определить, как REST поддерживает экспрессию множественных генов самообновления, мы исследовали возможную роль miRNAs в самообновляющихся REST-обеспечиваемых мышиных ES клетках. Мы изучали профили miRNA в дикого типа и Rest^+/- мышиных ES клетках, растущих в условиях самообновления. miRNAs из самообновляющихся дикого типа мышиных ES клетках распадались на две группы, экспрессирующиеся и репрессированные miRNAs (Supplementary Fig. 1 and Supplementary Table 1). Rest^+/- YHC и RRC клеточные линии имели сходные профили miRNA, которые были резко противоположны таковым из дикого типа ES клеток. Более того, miR-124a, которая, как недавно было показано, нацелена на REST¹⁴ и miR-106a и miR-106b, чьи предсказуемые мишени включают Rest, позитивно регулировались в Rest^+/- клетках, указывая тем самым, что может существовать регуляция, использующая двойные негативные петли обратной связи для поддержания гомеостаза. Используя базы данных miRNA (http://cbio.mskcc.org/mirnaviewer and http://pictar.bio.nyu.edu/), мы установили набор miRNAs, которые могут в потенциале быть нацелены на гены самообновления, такие как Nanog, Sox2, Tbx3 и c-myc (Supplementary Table 2). Эти miRNAs присутствовали лишь на низких уровнях в самообновляющихся мышиных ES клетках и присутствовали на высоких уровнях как Rest^+/- гетерозиготных клетках, так и в EB клетках, Чтобы определить, соединяется ли REST непосредственно с регуляторными последовательностями (chromatin) этих miRNA-содержащих генов, мы искали потенциальные сайты связывания REST (Supplementary Table 3), используя MatInspector модуль из Genomatix базы данных¹⁵. Мы нашли несколько потенциальных REST-связывающих сайтов для каждого из эти х генов. Метод иммунопреципитации хроматина (Fig. 3d) и метод количественной иммунопреципитации хроматина (Fig. 3e) на ES клетках выявил, что REST соединяется только со специфическими сайтами хроматиновых генов для каждой из этих miRNAs. В эксперименте по избыточности функции сходным образом было показано (Figs 1j и 3c), как экзогенно добавленный REST восстанавливает функцию самообновления мышиных ES клеток, растущих в условиях дифференцировки, мы анализировали экспрессию miRNAs в таких клетках с помощью qRT-PCR. Как показано на Fig. 3f, уровни этих miRNAs были сравнимы с таковыми в самообновляющихся мышиных ES клетках, экспрессирующих высокие уровни как в Rest^+/- гетерозиготных клетках, так и в EB клетках, и экспрессировали низкие уровни в EB клетках, трансфицированных экзогенными REST. Чтобы подтвердить REST-обусловленную репрессию miRNAs, мы провели эксперимент по потере функции, в котором мы воздействовали на мышиные ES клетки siRest и анализировали экспрессию miRNAs с помощью qRT-PCR. Как было показано, siRest-обусловленный нокдаун REST приводил к повышенным уровням экспрессии miRNA по сравнению с контролем (Fig. 3g). Чтобы подтвердить, что siRest-обусловленный нокдаун REST, который увеличивает экспрессию miRNAs, снижает также экспрессию генов самообновления, мы использовали метод qRT-PCR. Как показано на Fig. 3h, siRest-обработанные мышиные ES клетки обнаруживают пониженные уровни экспрессии Rest, Oct4, Nanog и Sox2 . Следовательно, REST репрессирует этот набор miRNAs и строго указывает на то, что, по крайней мере, некоторые из miRNAs, в свою очередь, вмешиваются в экспрессию критических регуляторов самообновления, таких как Oct4, Nanog и Sox2.

Чтобы определить, вовлекаются ли непосредственно REST-регулируемые miRNAs в поддержание самообновления, использовали метод самообновления к мышиным ES клеткам после трансфекции клеток индивидуальными предшественниками этих miRNAs. По крайней мере, один из этих предшественников miRNAs, pre-miR-21, заметно понижал способность к самообновлению мышиных ES клеток на 60%, по сравнению с таковой NT siRNA. Напротив, pre-miR-26a не оказывала существенного влияния на эффективность самообновления по сравнению с той же самой NT siRNA (Fig. 4a). Мы измеряли уровни miR-21 и miR-26a с помощью qRT-PCR. В самом деле, pre-miR-трансфицированных клеток обнаруживали более чем 10-кратное и 300-кратное увеличение экспрессии miR-21 и miR-26a соотв. (Fig. 4b).

Чтобы подтвердить, что эффект pre-miR-21 на самообновление был специфическим, мы трансфицировали мышиные ES клетки NT siRNA или смесью pre-miR-21 плюс или NT siRNA или anti-miR-21 и использовали метод самообновления. Как показано на Fig. 4c, pre-miR-21 plus NT siRNA понижали способность самообновления на 30% по сравнению с одной только NT siRNA. Это снижение самообновления с помощью 50 nM pre-miR-21 составляло половину от того, что мы наблюдали с 100 nM pre-miR-21 (Fig. 4a), это указывало на то, что в этих условия, 50-100 nM pre-miR-21 находилась в линейном ранге своей активности по супрессии сомообновления мышиных ES клеток. Более того, супрессия самообновления с помощью pre-miR-21 устранялась с помощью anti-miR-21, но не с помощью NT siRNA, указывая тем самым, что понижение самообновления было специфическим для pre-miR-21. Затем мы использовали метод qRT-PCR , чтобы определить уровни экспрессии маркеров самообновления Oct4, Nanog, Sox2 и c-myc в клетках, обработанных pre-mir-21. Результаты показали соотв. снижение уровней экспрессии этих маркеров в pre-mir-21-обработанных клетках (Fig. 4d). Это первое доказательство одиночной miRNA как регулятора самообновления мышиных ES клеток. Интересно, что в ранних сообщениях было показано, что miR-21 является одной из miRs, чья экспрессия выше в дифференцированных по сравнению с недифференцированными ES клетками¹⁶. Итак, полученные результаты показывают, что REST-репрессируемая miR-21 регулирует самообновление мышиных ES клеток. Т.о., REST обладает вновь отрытой ролью в поддержании самообновления и плюрипотентности мышиных ES клеток. Более того, хотя REST может осуществляют свою функцию частично за счет непосредственной репрессии некоторых из своих мишеней, генов дифференцировки, таких как calbindin, мы получили доказательства, что REST действует посредством репрессии транскрипции специфической miRNA, miR-21, которая супрессирует самообновление благодаря соотв. потере экспрессии критических регуляторов самообновления Oct4, Nanog, Sox2 и c-Myc (Fig. 4e). Супрессирует ли miR-21 непосредственно экспрессию этих регуляторов самообновления, ингибируя тем самым самообновление, или miR-21 ингибирует самообновление за счет др. механизма, с последующей супрессией этих регуляторов самообновления, неясно. Конечно, биоинформатикой предсказываемые сайты связывания miR-21, присутствуют в мРНК Sox2 и Nanog, но не в Oct4 и c-myc (Supplementary Table 2). Если эти сайты действительно функционируют как сайты мишени для miR-21 и если miR-21 сайты мишени на самом деле отсутствуют в Oct4 и c-myc мРНК, то эти наблюдения д. указывать на то, что miR-21-обеспечиваемая регуляция самообновления мышиных ES клеток использует регуляторный каскад, инициируемый потерей экспрессии Sox2 и Nanog, что д. приводить к потере экспрессии Oct4 и c-Myc. Примечательно, что Oct4, Nanog и Sox2 , как было установлено, оккупируют совместно последовательности Rest promoter/enhancer, возможно в виде активирующего комплекса¹⁷.Более того, REST формирует часть Nanog-Oct4 комплекса¹⁸ и как было предсказано, является главным компонентом Oct4-Sox2-Nanog сети в ES клетках¹⁹. Итак, REST является новым элементом взаимосвязанной регуляторной сети, необходимой для поддержания самообновления и плюрипотентности культивируемых мышиных ES клеток.