ДИФФЕРЕНЦИРОВКА ЭМБРИОНАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ (ES)

Isolation and Development of Human ES Cells

Происхождение эмбриональных стволовых клеток. Три типа клеток ранних эмбрионов мышей могут рассматриваться как стволовые: эмбриональные стволовые (embryonic stem (ES)) клетки, трофобластные стволовые (trophoblast stem (TS)) клетки и внеэмбриональные энтодермальные (extraembryonic endoderm (XEN)) клетки [5]. Соответственно на стадии позднего бластоциста источником стволовых клеток могут служить три типа клеток - эпибласт (один из слоев эмбриобласта), трофэктодерма, образованная из трофобласта, и внезародышевая энтодерма, которая вместе с гипобластом является производным первичной энтодермы. Эти типы клеток уже не являются тотипотентными. Из клонов этих клеток могут быть получены постоянные клеточные линии, сохраняющие способность к самообновлению и производству разных дифференцированных клеток. ES клетки происходят из эпибласта бластоциста, у химер ES клетки могут вносить вклад развитие всех частей эмбриона, но обычно они не участвуют в образовании производных трофэктодермы или первичной энтодермы. Эти плюрипотентные клетки в стандартных средах клеточных культур с добавлением цитокина leukemia inhibitory factor (LIF) могут расти неопределенно долго как недифференцированные. Известны несколько генов, отвечающих за поддержание качества упомянутых клонов. Гены для двух взаимно противодействующих транскрипционных факторов Oct4 и Cdx2 действуют как "селекторные", т.е. предопределяющие судьбу внутренней клеточной массы и клеток трофэктодермы, обеспечивая сегрегацию этих двух клонов. Генетические нарушения в Oct4 в уже существующих ES клеточных линиях заставляют их дифференцироваться в производные трофобласта. Имеющиеся наблюдения указывают на то, что Nanog действует как ген селектор судьбы эпибласта относительно судьбы первичной энтодермы. Потеря гена Nanog из ES клеток заставляет их приобретать признаки вне-эмбриональной энтодермы. Установлено, что потеря рецепторной тирозин киназы Grb2 нарушает образование первичной энтодермы и экспрессию Gata6 на поздней стадии бластоциста. Так что передача сигналов Nanog и Gata6/Grb2 облегчает рассортировку в бластоцисте клонов эпибласта и первичной энтодермы. Имеется несколько различий между мышиными и человеческими ES клетками, включая морфологию, скорость роста и потребность в LIF. Например, внутренняя клеточная масса бластоцистов человека может сохранять потенциал генерации трофэктодермы.

Генетические характеристики ES клеток

В настоящее время получено около 200 линий ES клеток человека и их количество постоянно растет. Установлено, что группа из 532 генов специфицирует ES клетки людей [6]. Известны некоторые молекулярные маркеры, отвечающие за качественные особенности ES клеток людей [7]. Большая часть транскриптома у ESCs кодирует гены пар лиганд-рецептор и секретируемые ингибиторы сигнальных путей [6,8,9].

Сигнальные пути. Для поддержания недифференцированного состояния ESCs мышей важен фактор подавления лейкемии (Leukaemia inhibitory factor - LIF). LIF осуществляет свой эффект путем связывания гетеродимерного рецептора LIFR-gp130 на клеточной мембране и активации signal transducer and activator of transcription-3 (STAT3). Затем активированные фосфорилированием STAT3 димеры транслоцируются в ядро, где они функционируют в качестве транскрипционных факторов. Хотя LIF-(LIFR-gp130)-STAT3 сигнальный путь не является универсальным, он представляет собой четкий пример того, как активация цитокинового пути может быть использована для изменения клеточной судьбы и потенциала клеток.

Помимо пути, ведущего к транслокации в ядро STAT3, внутриклеточные домены гетеродимеров LIFR-gp130 могут, после связывания LIF, захватывать нерецепторную Janus тирозин киназу (JAK) и antiphosphotyrosine immunoreactive kinase (TIK) и активировать другие пути. Например, индуцировать фосфорилирование протеин киназ (extracellular signal-regulated protein kinases, ERK1 и ERK2), и увеличивать активность протеин киназы mitogen-activated protein kinase (MAPK), благодаря тирозин-фосфатазе-2, содержащей домен SRC-HOMOLOGY-2 (SH2).

BMP4 также рассматривается как ключевой фактор. Его эффект на культивируемые ES клетки напоминает LIF: в отсутствие BMP4 ES клетки дифференцируются в нейроны. В присутствии LIF, BMP4 вносит вклад в LIF каскад, усиливая само-обновление и плюрипотентность ES клеток путем активации гена, кодирующего транскрипционный фактор SMAD4 (similar to mothers against decapentaplegic homologue-4), который, в свою очередь, активирует членов Id (inhibitor of differentiation) семейства генов. Напротив, в отсутствие LIF, BMP4 противодействует LIF каскаду, взаимодействуя с разными SMAD транскрипционными факторами (напр., SMAD1, 5 и 8), которые обладают ингибирующим эффектом на Id гены. BMP белки, как было установлено, являются мишенями другого каскада, который инициируется соединением WNT со свои рецептором. Sato и др. показали, что активация канонического WNT пути поддерживает недифференцированный фенотип ESCs мышей и людей и поддерживает экспрессию специфичных для плюрипотентного состояния транскрипционных факторов OCT4 и REX1, известного также как zinc-finger protein-42 ( ZFP42), и гена Nanog в отсутствие добавления LIF. То же самое происходит после активации нижестоящих мишеней передачи сигналов WNT, таких как cyclin-D1, MYC36 и BMP белков.

Выявлен также сигнальный путь, который регулирует взаимодействие между mTOR (mammalian target of rapamycin) и двумя нижестоящими субстратами: eukaryotic translation-initiation factor 4E (eIF4E)-связываюзщим белком-1, и рибосомальнойl-протеин-S6 киназой.

Другой путь ведет к гену phosphatase and tensin (Pten), который завершает передачу сигналов phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K), дефосфорилируя ее субстрат фосфатидилинозитол-3,4,5-трифосфат. Серин/треониновая киназа AKT является нижестоящим эффектором PI3K, которая фосфорилирует mTOR in vitro, указывая тем самым на прямую связь между mTOR и PI3K-AKT путем, который негативно регулируется с помощью фактора PTEN.

Гены-эффекторы. Все сигнальные пути в конечном счете ведут в ядро, а в случае ES клеток приводят к индукции транскрипции или репрессии генов, ответственных за поддержание плюрипотентности стволовых клеток. Транскрипционный фактор OCT4 является POU-доменовым фактором, который экспрессируется всеми плюрипотентными клетками во время эмбриогенеза и обильно экспрессируется недифференцированными клетками мышей и плюрипотентными ES клетками человека. Правда, нейрональная дифференцировка происходит при сохранении экспрессии Oct4, что ставит под сомнение общепринятое мнение, что подавление Oct4 необходимо для дифференциации соматических клонов. Фактор OCT4 может рассматриваться как участвующий в предупреждении дифференцировки трофэктодермы и вообще соматических клеток из внутренней клеточной массы, а также для поддержания плюрипотентного состояния во время эмбрионального развития. Пока лишь выявлено действие мутантного гена Wnt3 на уровень фактора OCT4 в мышиных ES клетках.

SOX2 (SRY related high-mobility group(HMG)-box protein-2) является членом семейства HMG-доменовых ДНК-связывающих белков, которые участвуют в регуляции транскрипции и архитектуры хроматина. Фактор SOX2 формирует третичный комплекс с фактором OCT4 или белком OCT1 на энхансерных последовательностях гена Fgf4. Ген Sox2 экспрессируется в ES клетках и также экспрессируется в нервных стволовых клетках. При изучении фенотипических проявлений гена у мутантных Sox2 эмбрионов и у химер по Sox2 в примитивной и вне-эмбриональной эктодерме, т.е. мультипотентных предшественниках всех эмбриональных и трофобластных типов клеток. Аналогичную роль играют и другие гены, экспрессирующиеся в популяции клеток-основательниц эмбрионов, например Foxd3 (ген транскрипционного фактора, который также известен как Genesis и принадлежит к forkhead семейству транскрипционных факторов с winged-helix ДНК-связывающей структурой). ES клетки генотипа Foxd3-/- не могут образоваться, несмотря на нормальную экспрессию генов Oct4, Sox2 и Fgf4 в клетках Foxd3-/- внутренней клеточной массы. Это указывает на прямое взаимодействие между OCT4 и FOXD3, которое существует и между OCT4 и SOX2.

Идентифицирован новый ген, кодирующий гомеодомен-содержащий транскрипционный фактор, который отвечает за LIF-независимую способность обновления и плюрипотентности мышинных ES клеток. Этот ген стал называться Tir nan Og или Tir Na Nog, по мифологической стране Кельтов 'вечной молодости. Nanog мРНК присутствует в примордиальных зародышевых и эмбриональных зародышевых клетках, и выявлена также генитальном гребне. Функция Nanog в зародышевых клетках прогрессивно уменьшается по мере из созревания. Недифференцированные дикого типа ES клетки обычно экспрессируют Nanog. Однако, физиологические уровни Nanog в ES клетках не предупреждают их дифференцировку после удаления LIF. При физиологических условиях, Nanog, по-видимому, является одним из нескольких факторов, которые экспрессируются в плюрипотентных клетках и подавляются в начале дифференцировки. Однако, фактор NANOG не входит в группу из 532 генов. которые были идентифицированы, как специфичные для ES клеток людей. Nanog-/- мышиные ES клетки медленно дифференцируются в клоны вне-эмбриональной энтодермы, что согласуется с отсутствием примитивной эктодермы у Nanog-/- эмбрионов. Итак, экспрессия Nanog ответственна за поддержание примитивной эктодермы у эмбрионов. Персистенция Nanog скорее задерживает, чем блокирует дифференцировку ES клеток. Напротив, избыточная экспрессия Nanog дает вызывает более устойчивую плюрипотентность. Более того, он обеспечивает устойчивую плюрипотенность соматических клеток после их слияния с ES [10] . Итак, количество Nanog на клетку является критическим для стабильного поддержания в недифференцированном состоянии даже в присутствии LIF. Считается, что Nanog может регулировать дифференцировку посредством репрессии транскрипции генов, которые способствуют дифференцировке (напр., гены энтодермального GATA-binding protein-6, Gata6 и Rex1/Zfp42). Известно, что активатор транскрипции и опухолевый супрессор p53 соединяется с промотором Nanog, делая тем самым возможной p53-зависимую супрессию экспрессии Nanog. Интересно, что p53-связывающий элемент был также обнаружен непосредственно выше гена Pten. Установлены взаимодействия между Nanog и STAT3. Соседние octamer и sox элементы были также идентифицированы как цис-регуляторные элементы в Fgf4 , Sox2, Utf1 и Fbx15 генах, которые экспрессируются в ES клетках и во время эмбриогенеза. Картированы также и сайты для транскрипционных факторов OCT4, SOX2 и NANOG в промоторах большой популяции генов, которые предопределяют позитивно или негативно ES клетки человека. Показано, что промоторные области оккупируются совместно OCT4, SOX2 и NANOG как в транскрипционно активных генах, которые выполняют роль в предопределении качественных особенностей ES клеток (недифференцированный фенотип), так и в неактивных генах, которые способствуют их развитию, будучи депрессированными (дифференцировка).

В отсутствие LIF, усиленная экспрессия гена Pem, который продуцирует гомеодомен-содержащий белок, блокирует дифференцировку ES клеток как in vitro, так и in vivo. PEM участвует в регуляции перехода между недифференцированным и дифференцированным состоянием клеток у ранних эмбрионов мышей. Из-за кратковременности существования клеточной популяции внутренней клеточной массы или примитивной эктодермы, ранняя роль фактора PEM in vivo менее очевидна, чем его поздняя роль на пост-имплантационных стадиях. После имплантации, экспрессия Pem обнаруживается в эктоплацентарном конусе, примитивной энтодерме, париетальной и висцеральной энтодерме (но не в примитивной эктодерме), указывая тем самым, что PEM выполняет вне-эмбриональные функции. Роль белков группы Polycomb (PcG) в контроле стволовых клеток

Стволовые клетки должны поддерживать специфичные для дифференцировки гены выключенными при сохранении способности быстрого включения их по мере надобности. Установлено, что уникальные свойства хроматина стволовых клеток млекопитающих позволяют осуществлять этот деликатный баланс.

Было показано [11], что многие гены ES клеток мышей, включая некоторые из тех, что участвуют в дифференцировке, характеризуются необычной комбинацией эпигенетических модификаций. Сюда входит ацетилирование лизина 9 гистона H3 (H3K9) и метилирование H3K4, которые маркируют активный хроматин, и триметилирование H3K27, которое типично для молчащего хроматина. В большинстве генов не стволовых клеток обнаруживаются или активные или репрессивные маркеры, но не оба.

Бернштейн и коллегами [12] (2006) в ES клетках мышей идентифицировали как H3K4, так и триметилированный H3K27 в генах, которые кодируют онтогенетически важные транскрипционные факторы. Обе группы показали, что потеря этих необычных комбинаций эпигенетических маркеров коррелирует с дифференцировкой. Предполагается, что присутствие как активных, так и репрессивных меток позволяет генам, специфичным для дифференцировки в ES клетках, быть репрессированными, но быть готовыми к активации, когда будут получены соответствующие сигналы.

Как же специфицируются уникальные эпигенетические профили стволовых клеток? Было предположено участие белков Polycomb group (PcG) [11]. Авторы показали, что ES клетки, которые дефицитны по EED, компоненту PcG-комплекса эмбриональной эктодермы, который необходим для метилирования H3K27, экспрессируют гены, специфичные для дифференцировки, которые обычно репрессированы в этих клетках. Дальнейшие исследования ES клеток [13,14] идентифицировали большие количества сайтов связывания белков PcG по всему геному ES клеток, которые соответствовали генам, функционирующим в развитии и дифференцировке. Эти гены были также маркированы по триметилированному лизину H3K27 и были транскрипционно молчащими. Boyer et al [13] показали, что дефицит компонента EED приводит к активации этих обычно репрессированных генов. Было установлено [13,14, что гены мишени для белков PcG активируются во время дифференцировки ES клеток мышей. Авторы предполагают, что PcG белки поддерживают репрессированное состояние хроматина до поступления сигналов, индуцирующих дифференцировку, после чего они обеспечивают быструю экспрессию этих генов. Lee et al. [14] также нашли, что транскрипционные факторы OCT4, SOX2 и NANOG, описанные выше, также присутствуют в большинстве мест связывания белков PcG в ES клетках. Необходимо понять, как эти белки вносят вклад в уникальные свойства хроматина ES клеток.

Терапевтическая роль ES клеток

Влияние ES клеток на функцию сердца

Дифференцировка в кардиомиоциты описана для линий эмбриональных стволовых клеток HES-2 [15] и H-1, -7, -9 и -14 [16-19]. Так, в работе Kehat et al [20] обнаружили структурные и функциональные свойства кардиомиоцитов на ранних стадиях в клетках, развившихся из клеток эмбриональных тел. Клетки, имевшие спонтанную сократительную активность, характеризовались наличием тяжелой цепи миозина, -актинина, десмина, antinaturietic белка и кардиального тропонина, белкам, обнаруживаемым обычно в кардиальной ткани. Экспрессируемые гены транскрипционных факторов согласуются с кардиомиоцитами ранних стадий. Электрическая запись от этих клеток, изменения в перемещении ионов кальция в пределах клеток и сократительная реакция в ответ на стимуляцию катехоламиновыми гормонами подобны таким же показателям ранних кардиомиоцитов, наблюдаемых у млекопитающих в развитии.

Denning et al., [21] выявили стандартизированные условия для культивирования и дифференцировки линий эмбриональных стволовых клеток BG01 и HUES-7 и осуществили инициальную характеристику получаемых кардиомиоцитов. Дифференцировка BG01 и HUES-7 приводила к появлению сокращающихся регионов между 13 и 36 днем со спонтанными сокращениями до 50-го дня в некоторых эмбриональных телах BG01 и HUES-7. Возникающие кардиомиоциты экспрессировали -adrenoceptors, а также кардиальные транскрипционные факторы и структурные белки. Эти наблюдения согласуются с другими исследованиями, где авторы индуцировали кардиальную дифференцировку с помощью сыворотки [17,18], 5-азадеоксицитидина [16], аскорбиновой кислоты [22] или совместного культивирования с висцеральными энтодерм-подобными клетками [22]. Эти и др. кардиальные индукторы, такие как ростовые факторы (напр., члены сверхсемейства TGF- 1), oxytocin, erythropoietin и DMSO [23], могут облегчать кардиомиогенез в эмбриональных стволовых клетках. Существенное значение имеет и сигнальный путь JAK2/STAT3 при инициальных стадиях кардиомиогенеза из эмбриональных стволовых клеток [24].

Icariin существенно увеличивал уровни мРНК кардиальных транскрипционных факторов GATA4 и Nkx2.5, и специфичных для сердца генов ?-MHC, MLC-2v и ?-AR зависимым от концентрации и времени способом [25]. Кардиомиоциты, происходящие из эмбриоидных тел, обработанных icariin, были более чувствительные к isoprenaline, они обнаруживали усиление генерации эндогенного NO во время ранних стадий кардиального развития. Воздействие на них icariin вызывало продолжительный подъем соотношения cAMP/cGMP перед сдвигом к фенотипу кардиомиоцитов. Сходным образом существуют подходы для увеличения количества кардиальных клеток предшественников, включая добавление ретиноевой кислоты или dimethyl sulphoxide, ингибирующих передачу сигналов BMP [26]. Модуляция передачи сигналов WNT также может оказаться эффективной [ 27].

Как сообщает Lior Gepstein из израильской группы из Technion-Israel Institute of Technology [28], которая вместе с коллегами из США выделили ES клетки из эмбриона человека и инъецировали их в сердце свиньи с аномально низкой частотой сокращений. У 11 из 13 свиней инъецированные клетки создали свой собственный сердечный ритм. У пяти свиней это было ограничено короткими периодами, но у шести свиней биение поддерживалось устойчиво и напоминало паттерн нормально бьющегося сердца. Следовательно, данная техника может быть использована и для создания "биологических водителей ритма" и лечения людей с нарушением сердечного ритма.

Таким образом, помимо эффекта замещения ES клетки могут обеспечивать дефектные кардиомиоциты необходимыми генетическими факторами. В работе Fraidenraich et al. [29] разработана модель онтогенетических аномалий сердца с помощью Id генов у мышей, которые являются доминантными негативными антагонистами различных basic helix-loop-helix транскрипционных факторов. Отсутствие, по крайней мере, 2-х из трех Id генов Id1, Id2, или Id3 является летальным для развивающегося эмбриона из-за разнообразных врожденных пороки сердца, включая дефекты межжелудочковой перегородки, атрезию тракта оттока и истончение компактного миокарда. Однако, при инъекции ES клеток дикого типа (Id1+/Id2+/Id3+) в бластоцист 20% таких мышей доживали до рождения и не обнаруживали признаков пороков сердца гистологически и эхокардиографически, хотя размеры тела и сердца были значительно меньше. Фактически, ES клетки представляли только 20% восстановленного сердца на стадии E17.5. Секретируемый фактор, отвечающий за такое удаленное частичное восстановление Id нокаутного фенотипа был идентифицирован как IGF-1, который, если вводился внутрибрюшинно беременным матерям, вызывал эффект той же самой нормализации, обнаруживаемый после инъекции ES клеток перед оплодотворением. Авторы определили, что ближайшим сигналом, индуцируемым ES клетками, необходимым, чтобы скорректировать изменения генной экспрессии, является экспрессия Wnt5a.

Как известно, IGF-1 активирует IGF-1R рецептор, это приводит к транслокации Akt в ядро и тем самым способствует клеточной жизнеспособности кардиальных стволовых клеток.

Итак, применение чужеродных ES клеток в практике лечения людей остается проблематичным из-за ряда трудностей, главная из которых тканевая несовместимость, приводящая к отторжению имплантированных клеток. В настоящее время проводятся активные клинические исследования по использованию ES клеток для аутологических трансплантаций.

Клетки для аутологичных трансплантаций. Прямое введение недифференцированных ES клеток в сердце ведет к формированию тератом [30]. Характерная особенность ES клеток, заключающаяся в отсутствии контроля развития или предопределения клеточной судьбы, привлекает к ним внимание исследователей, пытающихся использовать это качество с целью восстановления поврежденных органов человека. Подобное состояние отсутствия дефинитивного контроля или плюрипотентность приобретают ядра после переноса в ооциты, из которых удалено собственное ядро. Существует методика "терапевтического клонирования", заключающаяся во введении ядра клетки больного в яйцеклетку без ядра. Эта яйцеклетка развивается в эмбрион ранней (предимплантационной) стадии. Стволовые клетки, получаемые из такого эмбриона, генетически идентичны изначальной клетке больного, но эмбриональная среда перепрограммирует их к тому, чтобы стать плюрипотентными, и приобрести возможность превращаться практически в любую ткань, будучи введенными в организм больного [31]. Такие частично дифференцированные клонированные клетки можно пересаживать обратно в сердце донора ядер без риска их отторжения его иммунной системой [32]. Контроль экспрессии Oct4 и Nanog является важным для успешного клонирования, при котором унипотентное клеточное ядро донора перенесенное в ооплазму, становится плюрипотентным. Установлено, что при этом экспрессируется ряд онтогенетических генов, ассоциированных с плюрипотентностью. Правда реактивация молчащих соматических аллелей Oct4 и Nanog происходит только частично в мышиных клонах. Напротив, инактивация Х хромосомы, по-видимому, происходит также как во время нормального развития.

Далее была разработана возможность получать ES клетки после переноса в них ядер соматических клеток (somatic-cell nuclear transfer (SCNT)) на мышах, а теперь и на человеке. Затем стали использовать плюрипотентные стволовые клетки вместо ооцитов в качестве реципиентов для межклеточного слияния. Такие гибридные клетки обнаруживают потерю стадио- и ткане-специфических маркеров родительских соматических клеток (gene extinction) и de novo активацию признаков и генов, которые характерны для плюрипотентных клеток. Незначительные аномалии в экспрессии и метилировании некоторых импринтируемых генов происходят в мышиных клонах, которые происходят из соматических клеток и ES клеток. Однако, жизнеспособное клональное 'потомство' может доживать до взрослого состояния. Демонстрации реактивации X хромосомы после слияния клеток и её последующей случайной инактивации во время дифференцировки подтверждает, что плюрипотентные стволовые клетки могут перенастроить характер инактивации правильно. Возникает интересное предположение, заключающееся в том, что клеточное слияние может естественным образом происходить и in vivo, так что у взрослых стволовые клетки одной ткани могут генерировать дифференцированные клетки, которые специфичны для др. ткани путем слияния с местными клетками и последующей сегрегацией. В действительности, однако, клеточное слияние не может объяснить всех случаев появляющихся трансдифференцировок.

Итак, клонируемые бластоцисты могут быть использованы для получения почти безупречно подходящих ES клеточных линий после SCNT ядер из соматических клеток пациента, которые можно будет заставить дифференцироваться in vitro и обеспечить пациента клетками для аутологичных трансплантаций. Получение таких линий из индивидуальных специфических стволовых клеток посредством переноса ядер соматических клеток [33] или слияний клеток [34] могут позволить создавать стволовые клетки, содержащие собственный генетический материал индивида, чтобы использовать их для лечения.

Кроме того, возможно достижение соматическими клетками плюрипотентности при использовании клеточных экстрактов и за счет индуцированного культивированием репрограммирования клеток [35]. Известно существование мультипотентных клеток предшественников, MAP-C клеток, которые происходят из стромы взрослого костного мозга, по-видимому, приобретают снова плюрипотентность in vitro в отсутствие других клеток, которые могли бы секретировать факторы плюрипотентности. Однако, это долговременный процесс, а уровень экспрессии клетками MAP-C Oct4 в 1,000-раз меньше, чем в ESCs.

Литература

1. Anversa P, Olivetti G. Cellular basis of physiological and pathological myocardial growth// In Handbook of Physiology. The Cardiovascular System: the Heart, ed. E Page, H Fozzard, JR Solaro, New York: Oxford Univ. Press. 2002. - P. 75-144

2. Beltrami A.P, Urbanek K, Kajstura J, Yan S-M, Finato N, et al. 2001. Evidence that human cardiac myocytes divide after myocardial infarction// N. Engl. J. Med. -2001. - Vol. 344. P. 1750-57

3. K.Urbanek, F. Quaini, G. Tasca,D. et al. Intense myocyte formation from cardiac stem cells in human cardiac hypertrophy// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2003 . -Vol. 100. No.18. P. 10440-10445

4. Ohtsuka M., Takano H., Zou Y., et al. Cytokine therapy prevents left ventricular remodeling and dysfunction after myocardial infarction through neovascularization// The FASEB Journal. - 2004. - Vol.18. P. 851-853.

5. Ralston A. and Rossant J. Genetic regulation of stem cell origins in the mouse embryo // Clinical Genetics. - 2005. - Vol.68. No.2. P. 106

6. Brandenberger, R. et al. Transcriptome characterization elucidates signaling networks that control human ES cell growth and differentiation// Nature Biotechnol.- 2004. - Vol.22,. P. 707-716

7. Sj?berg L. L. and Svensson F.. Molecular markers for human embryonic stem cell differentiation// In "DNA-technology", Chalmers May. - 2005

8. Boiani M. and Schuler H. R. Regulatory networks in embryo-derived pluripotent stem cells// Nature reviews molecular cell biology. - 2005. - Vol. 6, No 11, P.872-884

9. Sato, N. Sanjuan I. M., Heke M., et al. Molecular signature of human embryonic stem cells and its comparison with the mouse// Dev. Biol. - 2003. - Vol. 260. P. 404-413

10. Silva J., Chambers I., Pollard S., Smith A.. Nanog promotes transfer of pluripotency after cell fusion// Nature. - 2006. - Vol. 441, No 7096, P. 997-1001

11. Azuara, V. et al. Chromatin signatures of pluripotent cell lines// Nature Cell Biol. - 2006. - (doi: 10.1038/ncb1403)

12. Bernstein, B. E. et al. A bivalent chromatin structure marks key developmental genes in embryonic stem cells// Cell. - 2006. - Vol. 125. P. 315-326

13. Boyer, L. A. et al. Polycomb complexes repress developmental regulators in murine embryonic stem cells// Nature. - 2006. (doi:10.1038/nature04733)

14. Lee, T. I. et al. Control of developmental regulators by polycomb in human embryonic stem cells// Cell. - 2006. - Vol. 125. P. 301-313

15. Mummery, C., Ward-Van Oostwaard, D., Doevendans, P., et al. Differentiation of human embryonic stem cells to cardiomyocytes: role of coculture with visceral endoderm-like cells// Circulation. - 2003. - Vol. 107. P. 2733-2740

16. Xu, C., Police, S., Rao, N. and Carpenter, M.K. Characterization and enrichment of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells// Circ Res. - 2002. - Vol. 91. P. 501-508

17. He, J.Q., Ma, Y., Lee, Y., Thomson, J.A. and Kamp, T.J. Human embryonic stem cells develop into multiple types of cardiac myocytes: action potential characterization// Circ Res. - 2003. - Vol. 93P. 32-39.

18. Reppel M., Boettinger C. and Hescheler J. Beta-adrenergic and muscarinic modulation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes// Cell Physiol Biochem. - 2004. - Vol.14. P. 187-196

19. Xue T., Cho H.C., Akar F.G., et al. Functional integration of electrically active cardiac derivatives from genetically engineered human embryonic stem cells with quiescent recipient ventricular cardiomyocytes: insights into the development of cell-based pacemakers// Circulation. - 2005. - Vol.111. P. 11-20

20. Kehat, I., Kenyagin-Karsenti, D., Druckmann, M., et al. Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes portraying cardiomyocytic structural and functional properties// J. Clin. Invest. - 2001 .- Vol. . ????

21. Denning C., Allegrucci C., Priddle H., Barbadillo-Muсoz M. D., et al. Common culture conditions for maintenance and cardiomyocyte differentiation of the human embryonic stem cell lines, BG01 and HUES-7// Int. J. Dev. Biol.- 2006. - Vol. 50.No 1. P. 27-37

22. Passier, R., OostwaarD, D.W., Snapper, J., et al. Increased cardiomyocyte differentiation from human embryonic stem cells in serum-free cultures// Stem Cells. - 2005. - Vol. 23. P. 772-780

23. Heng, B.C., Haider, H.K.H., Sim, E.K., Cao, T. and Ng, S.C. Strategies for directing the differentiation of stem cells into the cardiomyogenic lineage in vitro// Cardiovasc Res. - 2004. - Vol. 62. P. 34-42.

24. Foshay K., Rodriguez G., B. Hoel, et al. JAK2/STAT3 directs cardiomyogenesis within murine embryonic stem cells in vitro// Stem Cells. - 2005. - Vol.23. P. 530-543

25. Zhu Dan-yan, Lou Yi-jia. Icariin-mediated expression of cardiac genes and modulation of nitric oxide signaling pathway during differentiation of mouse embryonic stem cells into cardiomyocytes in vitro// Acta Pharmacologica Sinica .- 2006.- Vol. 27, No. 3. P. 311

26. Sachinidis, A., Fleischmann B.K, Roell W, Kolossov E, et al. Cardiac specific differentiation of mouse embryonic stem cells// Cardiovasc. Res. - 2003. - Vol. 58. P. 278-291

27. Pal, R. & Khanna, A. Role of Smad- and Wnt-dependent pathways in embryonic cardiac development// Stem Cells Dev. - 2006. - Vol 15. P. 29-39

28. http://newsvote.bbc.co.uk/mpapps/pagetools/print/news.bbc.co.uk/2/hi/health/3692942.stm

29. Fraidenraich D, Stillwell E., Romero E., et al.. Rescue of cardiac defects in Id knockout embryos by injection of embryonic stem cells// Science . - 2004. - Vol.306. P. 247

30. Laflamme, M. A. & Murry, C. E. Regenerating the heart// Nature Biotechnol. - 2005. - Vol. 23. P. 845-856

31. Jaenisch R. Human cloning-the science and ethics of nuclear transplantation// N Engl J Med. - 2004. - Vol. 351. P. 2787-2791

32. Lanza R, Moore M.A.S., Wakayama T., Perry A. C.F. , et al Regeneration of the infarcted heart with stem cells derived by nuclear transplantation// Circ Res. - 2004. - Vol. 94. P. 820-827

33. Brambrink, T. , Hochedlinger, K. , Bell, G. & Jaenisch, R. ES cells derived from cloned and fertilized blastocysts are transcriptionally and functionally indistinguishable// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2006. - Vol. 103. P. 933-938

34. Cowan, C. A. , Atienza, J. , Melton, D. A. & Eggan, K. Nuclear reprogramming of somatic cells after fusion with human embryonic stem cell// Science. - 2005. - Vol. 309. P. 1369-1373

35. Hochedlinger K., Jaenisch R. Nuclear reprogramming and pluripotency// Nature. - 2006.- Vol. 441, No 7097, P. 1061-1067

Мглинец В.А.