Роль Взаимодействия между Малыми GTPases и Белками Полярности
Crosstalk between small GTPases and polarity proteins in cell polarization
Sandra Iden1 & John G. Collard Nature Reviews Molecular Cell Biology 9, 846-859 (November 2008) | doi:10.1038/nrm2521
Cell polarization is crucial for the development of multicellular organisms, and aberrant cell polarization contributes to various diseases, including cancer. How cell polarity is established and how it is maintained remain fascinating questions. Conserved proteins of the partitioning defective (PAR), Scribble and Crumbs complexes guide the establishment of cell polarity in various organisms. Moreover, GTPases that regulate actin cytoskeletal dynamics have been implicated in cell polarization. Recent findings provide insights into polarization mechanisms and show intriguing crosstalk between small GTPases and members of polarity complexes in regulating cell polarization in different cellular contexts and cell types.
Высшие организмы состоят из различных типов клеток, каждый со специфической функцией, которая часто необходима для приобретения особой формы клеткой. Напр., нейроны вовлекаются в сложную сигнальную сеть с сотнями соединений с др. клетками. Для эффективной передачи нейронального сигнала на периферические регионы тела предпочтительным является формирование длинных аксонов. Напротив. основной функцией эпителиальных клеток является образование барьера, который защищает тело от окружающей среды. Поэтому образование тесно упакованных клеточных слоёв, которые делают возможным только ограниченный и регулируемый транспорт молекул является наивысшим приоритетом. Эпителиальные клетки поэтому обычно компактной формы и содержат специализированные клеточные соединения. Т.о., в зависимости от их функции клетки оптимизируют свою морфологию посредством активации специфических сигнальных клеточных программ, которые ведут к клеточной асимметрии, которая также обозначается как полярность.
Полярность клеток достигается совместными действиями белков полярности. Эти молекулы законсервированы в ходе эволюции и могут реагировать на наружные и внутренние сигналы полярности (напр.. градиенты ростовых факторов или цитоскелет из микротрубочек, соотв. ). Путем сборки мультипротеиновых комплексов, они индуцируют передачу нижестоящих сигналов, чтобы запустить формирование клеточной асимметрии. Из трех описанных комплексов белков полярности - partitioning defective (PAR), Crumbs and Scribble (Box 1) - комплексы PAR обладают наиболее широкой функцией. При некоторых процессах поляризации эти комплексы кооперируются, чтобы индуцировать полярность, в то время как в др. системах они противостоят др. др., в результате чего и устанавливается или поддерживается клеточная асимметрия1-3. Получены указания на регуляции комплексов полярности. Малые GTPases из сверхсемейства Ras, которые действуют как молекулярные переключатели во многих сигнальных путях, по-видимому, играют критическую роль в процессах клеточной поляризации. RAP1 является ближайшим гомологом белка Ras и участвует в процессах клеточной адгезии4. Rho (Ras homologous) семейство белков из сверхсемейства Ras представлено более 20 членами, включая , и 5. Rho GTPases регулируют и координируют ремоделирование цитоскелета, напр.. индуцируя полимеризацию актиновых филамент в линейные волокна или разветвленную сеть. Т.к. все малые GTPases обеспечивают цикл Rho белков между активным GTP-связанным и неактивным GDP-связанным состоянием при содействии guanine nucleotide-exchange factors (GEFs). GEFs активируют Rho белки, в то время как GTPase-activating proteins (GAPs) инактивируют Rho белки (Box 2). В дополнение к высокому количеству регуляторов, описано свыше 70 Rho белков (Fig. 1). Большинство этих эффекторов являются киназами или действуют как каркасные белки, чтобы увязать активацию Rho GTPases с нижестоящими путями передачи сигналов (Fig. 1). Более того, Rho GTPases могут регулировать активность др. др. посредством взаимного влияния. CDC42 может активировать RAC1 (Ref. 6) , а RAC1 может подавлять активность RhoA7, 8. Временной и пространственный баланс между активностью разных малых GTPases является критическим для многих клеточных процессов, таки х как межклеточная и клетка-матрикс адгезия, клеточная миграция, поляризация клеток и (EMT)5. В целом контрактильные силы, которые индуцируются с помощью RhoA противодействуют адгезивным силам, которые индуцируются с помощью RAC1.
Недавние исследования показали, что белки полярности общаются с RAP1 и с различными Rho белками, чтобы индуцировать пространственно ограниченное ремоделирование цитоскелета, которое необходимо для поляризации многих типов клеток.
Asymmetric cell division
Первыми доказательствами взаимодействий между белками полярности и Rho GTPases в регуляции клеточной полярности стали исследования по асимметрии клеточных делений у Caenorhabditis elegans и Drosophila melanogaster (rev. Refs 9, 10). У этих организмов асимметричное распределение белков полярности перед клеточным делением коррелирует с локальными различиями в , которая регулируется с помощью активности Rho белка. Асимметричные деления клеток предшественников делают возможной генерацию дочерних клеток с разными клеточными судьбами; эти деления происходят во время эмбрионального развития и у взрослых организмов (напр.. во время поддержания популяции стволовых клеток).
Генетический скрининг у C. elegans выявил 6 par генов (Box 1), которые необходимы для первых асимметрических клеточных делений оплодотворенных яиц11,12.После оплодотворения одноклеточный эмбрион поляризуется вдоль передне-задней оси, чтобы подготовиться к асимметричному делению. и сегрегируют в передний домен, тогда как и распределяются в задний домен. В то же самое время первоначально униформная сеть актомиозина оказывается ограниченной передним полюсом, генерируя тем самым контрактильный передний и не контрактильный задний домен. Эти различия в контрактильности достигаются за счет асимметричного распределения Rho-регуляторных белков, включая переднее положение RhoGEF ECT-2 и заднее RhoGAP CYK-4 (Ref. 13). RhoGAPs RGA-3 и RGA-4, были идентифицированы недавно и регулируют активность Rho во время поляризации одноклеточного эмбриона14. Установление контрактильной полярности нуждается в формировании переднего и заднего PAR доменов. CDC42, как полагают, связывает актомиозиновую сеть с PAR асимметрией13, но точные механизмы, которые синхронизируют PAR и контрактильную полярность, неясны. У D. melanogaster, нейробласт является подобным стволовой клетке нейрональным предшественником, который ограниченно само-обновляется и дает малые ganglion mother cells (GMCs). Нейробласты вычленяются из слоя поляризованного нейроэпителия и наследуют апикально-базальную полярность. Во время деления нейробласта апикальный кортекс обогащается белками полярности PAR3, (aPKC) и PAR6, в то время как белки полярности , Discs large () и Lethal giant larvae (LGL) регулируют установку митотического веретена вдоль апикально-базальной оси15. Соответственно, детерминанты клеточной судьбы, включая and , накапливаются в базальном кортексе и тем самым сегрегируют в проспективную базальную дочернюю клетку9,16. Подобно первому делению эмбриона C. elegans, базальное расположение детерминантов клеточной судьбы зависит от асимметричной актомиозиновой сократимости апикального кортекса. Scribble-комплекса белок LGL модулирует сеть актомиозина путем связывания и ингибирования myosin-II (Refs 17, 18). LGL ингибируется с помощью aPKC-обеспечиваемого фосфорилирования в апикальном кортексе19, тем самым создается механизм для апикального ограничения активности myosin-II. Эти данные показывают, как общение между белками полярности связано с эффекторными путями Rho GTPases.
Системы, описанные выше, участвуют в более генеральной роли белков полярности и Rho GTPases в асимметричных клеточных делениях. В самом деле, некоторые недавние исследования на клетках млекопитающих описывают асимметричное распределение PAR белков полярности (напр., во время исключения полярного тельца в созревающих ооцитах мышей20, до асимметричных делений из 8-клеточного эмбриона мыши21, во время развития церебрального кортекса у мышей22 и при асимметричных делениях базальных эпидермальных клеток во время стратификации23). Однако наше сегодняшнее знание молекулярных взаимодействий между белками полярности и Rho GTPases в асимметричных клеточных делениях у млекопитающих недостаточно. Дальнейшая информация на молекулярные механизмы такого взаимодействия недавно получена в поляризации отростков нейронов, эпителиальных клеток и Т клеток. В контексте T-клеточной полярности, мы обратимся к антиген-зависимым асимметричным делениям активированных Т клеток24.
Neuronal cell polarity
Нейрон является первым примером поляризованных клеток, он является интересной моделью, с помощью которой можно исследовать становление клеточной асимметрии. Дифференцированные нейроны обладают множественными дендритами и одиночным аксоном, который может быть длиной более 1 м у моторных нейронов. Рецепторами опосредованные сигналы воспринимаются дендритами и транслируются в электрические сигналы, которые затем подвергаются переработке в теле клетки и посылаются к кончику аксона. На кончике происходит синаптическое высвобождение нейротрансмиттеров, приводящих к возбуждению или ингибированию соседних
Малые GTPases участвуют во многих аспектах развития и дифференцировки нейронов, включая выросты нейритов, аксонов и дендритов и миграцию аксонов25. Кроме того, некоторые исследования показали участие белков полярности в поляризации нейронов. Недавние данные показали, комплекс полярности PAR взаимодействует непосредственно с Rho и Ras-подобными малыми GTPases, чтобы контролировать спецификацию аксонов и морфогенез (see
Neurite outgrowth and axon specification. Чтобы исследовать процессы поляризации в деталях, изолированные нейроны гиппокампа интенсивно изучали в культуре клеток. Незрелые нейроны (Fig. 2, step 1,2) постоянно выпускают и отдергивают нейриты до тех пор, пока один из таких нейритов не получит доминантные сигналы, которые способствуют его развитию в аксон (Fig. 2, step 3). Все др. нейриты получают ингибирующие сигналы и развиваются в дендриты26 (Fig. 2, step 4). С помощью какого механизма инициирует
Функция Rho GTPases в росте нейронов была описана почти 10 лет назад, но лишь недавно стало ясно, что Rho GTPases участвуют также в критических ступенях формирования аксонов. CDC42 и RAC1 способствуют формированию и , в нейритах, тогда как RhoA обеспечивает коллапс конусов роста и ретракцию нейритов27. Rac-специфическая GEF T-cell-lymphoma invasion and metastasis-1 () поддерживает баланс антогонистической функции RhoA и RAC1 при выростах нейритов, путем регуляции Rac-зависимого фосфорилирования myosin-II и, следовательно, разборки актомиозина28. Более того, интерференция с активностями CDC42 и RAC1 блокирует образование аксона29. Два разных Rac активатора регулируют развитие аксонов посредством разных путей, которые регулируют динамику цитоскелета: TIAM1 спостобствует Rac-обеспечиваемой реорганизации актина на кончике аксона30, тогда как RAC1GEF (dedicator of cytokinesis protein-7) связывает активацию Rac с ингибированием белка, дестабилизирующего микротрубочки, (известного также как oncoprotein-18 (Op18)), чтобы способствовать образованию аксона25. Stathmin экспрессируется на высоком уровне в развивающихся аксонах и вмешивается в полимеризацию микротрубочек путем секвестрации свободных гетеродимеров тубулина31. Специфическая стабилизация микротрубочек в стволе проспективного аксона ,по-видимому, существенна для развития аксона32.
Недавние исследования показали, что различные малые GTPases осуществляют свою функцию нейрональной полярности посредством взаимодействия с белками полярности из комплекса PAR. Активация является основополагающим событием сигнального каскада, который использует различные малые GTPases, их регуляторы и различные члены комплекса PAR полярности (Fig. 2a). От первоначально симметричной локализации во всех нейритах, RAP1B оказывается ограниченным одиночным нейритом до какого-либо морфологического проявления поляризации (Fig. 2, step 2). На этой стадии др. белки, которые имеют отношение к спецификации аксона остаются случайно распределенными во всех нейритах. RAP1B, как полагают, активирует CDC42 и PAR комплекс, пространственно ограничивая PAR комплекс развивающимся аксоном29. Затем, RAC1 активируется иерархически ниже CDC42 и PAR комплекса как результат прямого взаимодействия между Rac активаторами TIAM1 и STEF (SIF and TIAM1-like exchange factor; известен также как TIAM2) с PAR3, это связывает передачу сигналов CDC42-PAR-комплекса с активацией RAC1 (Fig. 2a). Образование комплекса CDC42-PAR6-PAR3-TIAM1-RAC1, по-видимому, является критическим для установления полярности нейрона33.
Данные, описанные выше, выявляют иерархический сигнальный каскад, который лежит в основе спецификации аксона, но не могут объяснить, как распределение RAP1B оказывается ограниченным после инициального симметричного распределения на кончиках всех нейритов к локальному распределению в одиночном нейрите ещё до какой-либо морфологической видимой поляризации. Это ограничение обеспечивается частично E3 ubiquitin лигазой . SMURF2 избирательно находит неактивные RAP1B-GDP для протеосомами-обеспечиваемого протеолиза34 в нейритах, которые предназначены к развитию в дендриты. По ходу поляризации SMURF2 присутствует в теле клетки и в стволах всех нейритов, а PAR3, как полагают, рекрутирует SMURF2 в ростовой конус нейрона благодаря его взаимодействию с моторным белком микротрубочек KIF3A35,36. Это указывает на двойную роль PAR3 в RAP1B-зависимой поляризации нейронов: PAR3 действует выше RAP1B, чтобы контролировать его стабильность посредством рекрутирования SMURF2, в то же время PAR3, вместе с aPKC, является также эффектором RAP1B-опосредуемой передачи сигналов полярности. Протеосомная деградация является распространенным способом пространственного ограничения передачи сигналов малых GTPase. Во время вытягивания нейритов, напр., SMURF1 рекрутируется на сайт действия RhoA, возможно посредством ассоциации с aPKC, приводя к селективному убиквитилированию и деградации RhoA-GDP34,37.
Протеосомная деградация, т.о., находит неактивные RAP1B одинаково во всех нейритах, тогда как активный RAP1B локализуется только в будущем аксоне. Механизм этой эксклюзивной активации остается неясным, но возможно связан с разными активностями пока неизвестных GEFs или GAPs в RAP1B. В самом деле, активация phosphoinositide 3-kinase (PI3K) с помощью ростовых факторов в одиночном нейроне, который, по-видимому, использует разные изоформы Ras38,39, как полагают, индуцирует пространственно ограниченную продукцию (PtdIns(3,4,5)P3) в проспективном аксоне. Градиент PtdIns(3,4,5)P3 участвует в рекрутировании и активации ключевых игроков нижестоящей передачи сигналов полярности40. Большинство GEFs обнаруживает высоке сродство к PtdIns(3,4,5)P3 посредством своего . Итак, повышенная активность PI3K в проспективном аксоне может быть механизмом для рекрутирования специфических RAP1BGEFs, чтобы активировать RAP1B и тем самым инициировать спецификацию аксона.
Dendritic spine formation and maturation. После спецификации аксона развитие нейрона осуществляется за счет роста аксонального и дендритных отростков (Fig. 2). Образование и созревание т.наз. дендритных шипов (spines) является критическим для установления нейральных дуг (circuits). Дендритные шипы являются высоко подвижными, небольшими выпячиваниями вдоль дендритов, они составляют будущие сайты синаптических контактов. Шипы также подвергаются постоянному ремоделированию и их морфология является важной для нормального функционирования головного мозга. Многие нейрональные нарушения сопровождаются аномальной формой шипов.
Подобно спецификации аксона морфогенез шипов нуждается в сочетанной передаче сигналов с помощью Ras сверхсемейства GTPases. В соответствие с их ролю в контракции актина, RhoA, по-видимому, обладают ингибирующим эффектом на морфогенез шипов41, в то время как RAC1 способствует созреванию и поддержанию шипов42,43. Функция Rho GTPase в морфогенезе шипов использует также взаимодействие с PAR белками полярности (Fig. 2). В дифференцированных нейронах гиппокампа PAR3, aPKC и PAR6 локализуются в шипах, указывая тем самым, что они участвуют в морфогенезе шипов43,44. В самом деле, взаимодействие PAR3-TIAM1 пространственно ограничивает активацию RAC1 головкой шипа. Неправильно расположенная активация Rac ведет к увеличению образования выпячиваний на всех дендритах43. Интересно, что эта функция PAR3 в созревании шипов не зависит от связывания PAR3 с aPKC и PAR6 (Refs 43, 44). Вместо этого, PAR6 и aPKC, по-видимому, участвуют в формировании и поддержании (скорее, чем в созревании) дендритных шипов, т.к. экспрессия PAR6 или экспрессия постоянно активной aPKCzeta вызывают высокую плотность шипов. Напротив, ингибирование экспрессии PAR6 или ослабление активности aPKCzeta снижает количество шипов на дендритных остях44. Функция PAR6-aPKC не зависит от связывания CDC42 с PAR6, но участвует во взаимодействии с RhoA и его регулятором p190A RhoGAP. Ингибирование RhoA или его ключевого эффектора Rho-associated coiled-coil-containing protein kinase (ROCK) нормализует нарушенное образование шипов, которое обнаруживается вследствие молчания PAR6, указывая тем самым, что PAR6 негативно регулирует активность RhoA. В самом деле, PAR6-aPKC снижает активность RhoA, возможно благодаря взаимодействию aPKC с p190A RhoGAP, приводя к активации p190A RhoGAP. Такая активация тем самым ингибирует активность RhoA, а следовательно, и передачу сигналов ROCK, ниже PAR6 (Ref. 44). Эти находки указывают на то, что Rho GTPases и различные компоненты комплекса PAR вносят вклад в морфогенез шипов посредством двух разных механизмов. Соединение PAR6-aPKC с p190A RhoGAP супрессирует функцию RhoA, чтобы стимулировать образование шипов, в то время как взаимодействие между TIAM1 и PAR3 ограничивает активацию RAC1 областью головки шипа, чтобы способствовать созреванию шипа (Fig. 2b,c).
Подобно образованию аксона, RAP1 необходим и для образования дендритных шипов. RAP1 активируется вследствие передачи сигналов N-methyl-D-aspartate (NMDA) glutamate рецептора45, и его активность, по-видимому, регулируется с помощью RAP1GAP SPAR46. Однако остается неясным находится ли функция RAP1 выше CDC42, RAC1 и комплекса PAR (как это происходит во время образования аксона) .
T-cell polarity
Иммунные клетки нуждаются в поляризации чтобы осуществлять свои специфические функции. T и B лимфоциты обнаруживают ненормальное разнообразие в распознавании антигенов, специфичности и длительной иммунологической памяти. Т клетки циркулируют в крови и лимфатических сосудах. После стимуляции с помощью хемоаттрактантов Т клетки поляризуются пересекают эндотелиальный барьер, чтобы проникнуть во вторичные лимфоидные органы или воспаленные ткани. Активированные Т клетки могут инициировать разные иммунологические реакции на встречающиеся антигены. Эти реакции охватывают пределы от активации др. иммунных клеток до элиминации инфицированных или опухолевых клеток.
Chemokine-induced T-cell polarity. T лимфоциты. которые циркулируют в кровеносных и лимфатических сосудах имеют округлую морфологию. Во время адгезии, миграции или межклеточных взаимодействий они поляризуются вдоль передне-задней оси. Т клетки формируют богатый актином ведущий край, который обогащен также хемокиновыми рецепторами и интегринами, а крупный uropod или хвост находится сзади. различные посерхностные рецепторы, включая T-cell receptor (TCR), intercellular adhesion molecule (ICAM), CD44 и ezrin, накапливаются в uropod, что обеспечивает адгезию с др. клетками47,48 (Fig. 3a).
Т.к. поляризация Т клеток нуждается в драматических перестройках цитоскелета, то не удивительно, что Rho GTPases играют важную роль в этом процессе. RAC1 и CDC42 способствуют образованию активных центров для актина на ведущем крае во время индуцированной хемокинами поляризации Т клеток, и они необходимы для врастания Т клеток49-51. Тогда как образование uropod нуждается в активации RhoA на тыльной стороне и использует передачу сигналов ROCK52. Кроме того, RAP1A существенен для поляризации T клеток и активируется в течение секунд стимуляцией хемокинами. Экспрессия постоянно активного RAP1, но не RAP1 дикого типа, индуцирует поляризацию Т клеток в отсутствие внешних стимулов. Это указывает на то, что активация является инициирующим событием в процессе поляризации Т клеток53, 54. в
Только недавно стало ясно, что малые GTPases действуют сочетано с белками полярности во время поляризации Т клеток. Компоненты комплексов PAR, Scribble т Crumbs локализуются асимметрично в подвижных поляризованных Т клетках (Fig. 3a). DLG белки и Scribble накапливаются в uropod, а нокдаун Scribble или блокирование функции DLG4 ингибирует как формирование uropod, так и поляризованное распределение др. белков полярности. Более того, нокдаун Scribble устраняет случайную миграцию Т клеток55. Недавнее исследование показало существование иерархического сигнального каскада между RAP1A, Rho GTPases и PAR комплексом в контексте индуцированной хемокинами поляризации Т клеток54 (Fig. 3b). Активированные RAP1A, PAR3, aPKCzeta и CDC42 колокализуются с хемокиновыми рецепторами на ведущем фронте. Интересно, что стимуляция хемокинов с помощью stromal cell-derived factor-1alpha (SDF1alpha) активирует RAP1A, это сопровождается активацией CDC42 и aPKCzeta, которая в свою очередь существенна для активации нижестоящего RAC1. TIAM1 играет важную роль в этом контексте, т.к. TIAM1-дефицитные T лимфоциты обнаруживают строго редуцированную поляризацию в ответ на хемокины. Более того, TIAM1 и PAR комплекс необходимы для Rac-обеспечиваемой хемотактической миграции Т клеток в направлении градиента SDF1alpha. TIAM1 является нижестоящим эффектором RAP1A-GTP, и, по-видимому, сцеплен с PAR3 комплексом, а RAC1 с RAP1A-опосредованными сигналами полярности за счет одновременного соединения с PAR3 и активным RAP1A54 (Fig. 3b). Это указывает на то, что RAP1A активирует CDC42 после стимуляции хемокинами и рекрутирует TIAM1 и PAR комплекс на место активации. TIAM1 в свою очередь связывает сигнальный RAP1A-CDC42-PAR-комплекс с локальной активацией RAC1, чтобы индуцировать нуклеацию актина на ведущем крае54. Эти находки показывают, существенное сходство в сигнальных путях, которые лежат в основе спецификации аксона и подчеркивают генеральную роль RAP1 выше Rho GTPases и RAP комплекса в клеточной поляризации.
Polarity aspects in immunological synapse formation. Активация Т клеток в ответ на антиген связана с образованием иммунологических синапсов, поляризованных, преходящих, адгезивных контактов между Т клетками и . Обширные перестройки актинового цитоскелета необходимы для установления иммунологических синапсов и разные исследования описывают активацию CDC42 и RAC1 в иммунологических синапсах поле привлечения TCR56,57. Во время образования иммунологических синапсов белки полярности, такие как DLG и Scribble, перераспределяются из uropod на иммунологический синапс и колокализуются временно с PAR3, Crumbs-3 и TCR55. Нокдаун Scribble ведет к дефектам в TCR-опосредованной поляризации55, это указывает на то, что белки полярности выполняют важные функции в образовании иммунологических синапсов.
T клетки остаются в контакте с антиген-презентирующей клеткой в течение нескольких часов, это указывает на то, что иммунологические синапсы действуют и помимо своей роли в активации ранних Т клеток. Недавнее исследование строго подтвердило, что долговременная индуцированная иммунологическими синапсами полярность ведет к асимметричным клеточным делениям. Во время этого процесса Scribble сегрегирует прочь от PKCzeta, PKCzeta-содержащая дочерняя клетка детерминируется в направлении клона клеток памяти, а Scribble-содержащая клетка дифференцируется в эффекторную Т клетку24. Этот феномен напоминает процесс, который наблюдается при асимметричных клеточных делениях у низших организмов. Scribble. как было показано, взаимодействует с CRTAM, который необходим для колокализации CDC42 и aPKCzeta-содержащих комплексов при активации TCR в поздней фазе поляризации т клеток58, предоставляя тем самым альтернативный механизм пространственного ограничения активности Rho GTPase и полимеризации актина на месте передачи сигналов полярности. Однако экспериментальные данные, которые показывают взаимодействие между Rho GTPases и белками полярности для образования иммунологических синапсов и асимметричных клеточных делений пока отсутствуют.
Epithelial apico-basal cell polarity
Эпителиальные слои покрывают органы и полости тела, такие как легкие, кишечник или кожа. Тем самым они обеспечивают механическую защиту или опосредуют секрецию, абсорбцию и сенсорные функции. Эпителиальные клетки обладают асимметричной организацией соединительных комплексов. Строгая межклеточная адгезия обеспечивается с помощью (или zonula adherens) с помощью , тогда как (или zonula occludens) согдают диффузионные барьеры для растворимых молекул между клетками. Плотные соединения также образуют барьер для белков и липидов в мембранах, тем самым поддерживая различающиеся составы апикального и базолатерального доменов плазматической мембраны.
Образование апикально-базальной полярности интенсивно изучали у D. melanogaster и на эпителиальных клетках млекопитающих и были идентифицированы многие структурные и сигнальные белки. Апикальные PAR3 и Crumbs-3 комплексы и базолатеральный Scribble комплекс (Box 1) участвуют в становлении и поддержании клеточной асимметрии в контактирующих эпителиальных клетках. Мы сконцентрировались на взаимодействии между Rho GTPases и белками полярности (о apico-basal polarization, см Ref. 59 и обзор Mellman and Nelson в данном номере, а обсуждение молекулярных и функциональных взаимодействий белков полярности см. Refs 1, 2, 60).
Epithelial cell-cell contact formation and maintenance. Установление межклеточных контактов и последующей апикально-базальной поляризации нуждается в E-cadherin-опосредованной межклеточной адгезии61. Ламеллиподии и филоподии соседних клеток собираются в примордиальные адгезии, которые являются позитивными по E-cadherin и некоторым проспективным белкам плотных соединений62 (Fig. 4A). Образование кластеров эндогенных E-cadherin ведет к активации RAC1 (Ref. 63). Более того, димеризация E-cadherin активирует CDC42 (Ref. 64), тогда как ligation экзогенных nectins активирует и CDC42 и RAC1 (Refs 65, 66). Созревание примордиальных адгезий в линейные апикально-базальные поляризованные межклеточные контакты с дискретными слипчивыми и плотными соединениями нуждается в стимулировании aPKC путем взаимодействия между Rho GTPases и PAR комплексом(Fig. 4A). Соединение CDC42-GTP или RAC1-GTP с PAR6 высвобождает врожденную способность PAR6 активировать aPKC67, но имеются строгие доказательства предоминирующей функции RAC1 в формировании эпителиальных апикально-базальных поляризаций68-70. Взаимодействие между TIAM1 и PAR3 купирует активацию RAC1 с активацией aPKC, а потеря TIAM1 нарушает образование функциональных плотных соединений в кератиноцитах70. Более того, RAC1 контролирует внеклеточным матриксом индуцированную переориентацию апикально-базальной полярности в трехмерных культурах эпителиальных кист PI3K- aи aPKC-зависимым способом71,72. в
Вклад активности CDC42 в формирование апикально-базальной поляризации менее ясен. CDC42 безразличен для поляризации эпителиальных монослоев в двухмерных культурах70,73, в то же время он участвует в образовании просветов трехмерных культивируемых эпителиальных кист74. Сходным образом функция RhoA в апикально-базальной полярности всё ещё противоречива. Активность RhoA снижается по мере созревания межклеточных контактов75, а RAC1, как было показано, супрессирует активность RhoA в слипчивых соединениях за счет стимулирования ассоциации p190 RhoGAP с cadherin-связанным p120 catenin во время образования межклеточных контактов76. Однако RhoA и actomyosin контрактильность необходимы для ранних межклеточных адгезий77 и для генерации кортикального актомиозинового кольца во время апикально-базальной поляризации78. Это указывает на то, что сбалансированные активности RhoA и RAC1 или CDC42 вносят вклад в общую тканевую стабильность79-81. в
Мало доказательств того, что Scribble и Crumbs комплексы осуществляют свои функции при апикально-базальной поляризации благодаря коммуникациям с Rho GTPases. Хотя истощение Scribble нарушает межклеточные адгезии, роль Scribble в этом процессе, по-видимому, независима от соединения с PAK-interacting exchange-factor-beta (βPIX) и от активации RAC182. Более того, взаимодействие между белками комплекса Crumbs, PALS1 ((protein associated with LIN-7)-1) и PATJ (PALS1-associated tight-junction protein; Box 1), с CDC42 , как сообщалось. участвует скорее в поддержании, чем формировании плотных соединений. PATJ и PALS1,как полагают, рекрутируют CDC42GAP RICH1 (RhoGAP-interacting with CIP4 homologues protein-1), чтобы установить плотные соединения, в которых RICH1 и каркасный белок angiomotin (AMOT) контролируют CDC42-зависимую сортировку и рециклинг компонентов плотных соединений83.
Rho GTPases and polarity proteins in EMT. Во время морфогенеза органов определенные эпителиальные клеточные слои подвергаются EMT. Это маркируется потерей апикально-базальной полярности и межклеточных адгезий, изменениями от 'булыжника' к веретено-подобной морфологии и усилению миграционной способности84. Transforming growth factor-beta (TGFbeta) является мощным индуктором EMT, т.к. он супрессирует эпителиальные функции и способствует экспрессии мезенхимных факторов. Потеря плотных соединений во время TGFβ-индуцированного EMT частично достигается за счет интерференции белков полярности и передачи сигналов RhoA (Fig. 4Ba-Bd). Рецепторный комплекс TGFβ receptor (TGFβR) ассоциирует с и фосфорилирует PAR6, который соединяется с SMURF1 и приводит к протеосомной деградации RhoA и последующему распаду плотных соединений и к EMT85 (Fig. 4Bb). TGFβ-обеспечиваемая предача сигналов может также подавлять уровни белков PAR3 и Crumbs-3, приводя к распаду плотных соединений и к EMT86,87 (Fig. 4Bc,Bd).
Важно, что поведение инвазивных и метастатических опухолевых клеток сильно напоминает таковое у клеток, которые подвергаются EMT. Имеются многочисленные доказательства, что разрегулирование передачи сигналов полярности вносит вклад в развитие и прогрессирование рака88,89. В подтверждение этого, Scribble, DLG и LGL сегодня рассматриваются как гены опухолевых супрессоров у D. melanogaster и млекопитающих; мутации или делеции соотв. генов ведут к росту неопластической ткани88,90,91. Сходным образом аберрантная передача сигналов Rho GTPase, как известно вносит вклад как в формирование, так и прогрессирование многих раков92-94. Учитывая многосторонние взаимодействия между Rho GTPases и белками полярности в апикально-базальной и фронт-тыл полярности эпителиальных клеток, вполне возможно, что нарушение взаимодействий между этими группами сигнальных белков влияет на различные аспекты формирования и прогрессирования опухолей.
Polarized migration of adherent cells
Поляризация клеток существенна для миграции индивидуальных клеток или групп слипчивых клеток во время развития, во взрослом организме и при патологических ситуациях, таких как рак. Во время развития головного мозга, напр., нейроны мигрируют вдоль в определенные части головного мозга. Миграция эпителиальных клеток является существенной во время тканевого морфогенеза и для поддержания кожного и кишечного барьера во взрослом организме. Т.к. опухолевые клетки также мигрируют во время метастазирования, то понимание механизмов, с помощью которых клетки мигрируют и врастают в ткань, могут помочь разработке специфических лекарств, влияющих на метастатический процесс.
Клеточная миграция является суммарным эффектом CDC42- и RAC1-обусловленной экспансии клеточных выпячиваний и поляризации цитоскелета в направлении миграции (фронт клетки) и RhoA-управлоямой ретракции мембран и адгезий клетка-матрикс в подтягиваемом конце (тыльная сторона клетки)95. Клетки, которые постоянно мигрируют и поэтому обладают поляризованной морфологией фронт-тыл с асимметричным распределением поверхностных рецепторов, адгезивных белков, сигнальных молекул, цитоскелетных компонентов и пузырьков. Направление и эффективность клеточной миграции детерминируется растворимыми молекулами, такими как ростовые факторы, хемокины и средовые сигналы, такие как внеклеточный матрикс96,97. Недавно различные исследования показали, что собственно поляризация и направленная миграция многих типов клеток, включая астроциты, эпителиальные клетки и фибробласты, нуждается в скоординированном взаимодействии между Rho GTPases т белками полярности (Fig. 5).
Wound-induced astrocyte polarization. Астроциты не являются нейронами головного мозга и выполняют разнообразные функции, включая пищевую подпитку нейронов, высвобождение нейротрансмиттеров, иммунная защита в головном мозге и репарация поврежденных нервных клеток98. Сигнальные пути, участвующие в миграции астроцитов, вызванной физическими повреждениями, интенсивно исследовались в культивируемых астроцитах крыс.
Формирование астроцитами выпячиваний и клеточная миграция в направлении свободного пространства раны инициируется ранами от царапин. Этот процесс использует усиленную нуклеацию актина на ведущем крае, поляризацию и стабилизацию микротубулярных филамент и изменение позиции центросом и аппарата Гольджи в направлении раны99 (Fig. 5a). Эти перестройки цитоскелета контролируются с помощью передачи сигналов Rho GTPase. CDC42 был идентифицирован как ключевой регулятор поляризации астроцитов во время миграции. В ответ на царапиной индуцированное вовлечение integrin , CDC42 обеспечивает поляризацию цитоскелета, направление выпячивания, позиционирование Гольджи и центросом. Напротив , RAC1 способствует выросту выпячиваний, тогда как доминантно-негативный RhoA не оказывает эффекта на поляризацию астроцитов и вырост выпячиваний99.
Etienne-Manneville et al. выявили интригующий молекулярный путь, который использует сочетанное взаимодействие Rho GTPases и многих белков полярности во время поляризации астроцитов100,101. CDC42 локализуется и активирует PAR6 и aPKC на ведущем крае, где aPKC фосфорилирует и тем самым инактивирует Ser/Thr киназу glycogen synthase kinase-3beta (GSK3β). Это способствует ассоциации белка опухолевого супрессора adenomatous polyposis coli (APC) с плюс концами микротрубочек и делает возможным последующее взаимодействие APC с DLG1 на ведущем крае. Это взаимодействие необходимо для направленной к фронту поляризации цитоскелета из микротрубочек и оно делает возможным целенаправленный транспорт пузырьков к ведущему краю100, 101 (Fig. 5b).
Неясно, какие факторы обеспечивают активацию CDC42. Интригует функция белка полярности Scribble выше процесса поляризации, описанная ранее. Посредством betaPIX, Scribble локализует активный CDC42 на ведущем крае поляризующихся астроцитов. Этот процесс нуждается как в каталитическом GEF домене, так и в Scribble-связывающем мотиве βPIX. Однако активация CDC42 per se не зависит от Scribble, это указывает на то, что комплекс Scribble-βPIX пространственно ограничивает функцию CDC42 скорее, чем активирует CDC42 на ведущем крае102. Неясно, функционируют ли RAP1 выше CDC42, чтобы активировать эту GTPase, как это было показано в поляризованных нейронах29 и T клетках54. в
Migration of fibroblasts and epithelial cells. Большая часть наших знаний о функции Rho GTPase в клеточной подвижности получена в исследованиях на фибробластах. Миграторная способность эпителиальных клеток, однако испытывает строгое влияние со стороны степени своих внутриклеточных контактов, которые предупреждают миграцию. Хотя некоторые молекулярные механизмы, касающиеся подвижности фибробластов и эпителиальных клеток, сходны, некоторые сигналы, описанные ниже, могут иметь зависимое от типа клеток и специфических стимулов значение.
Недавние исследования показали, что Rho GTPases сотрудничают с белками полярности в фибробластах и эпителиальных клетках, чтобы контролировать направленную клеточную миграцию. Компоненты PAR, Scribble и Crumbs комплексов локализуются на ведущем крае (Fig. 5a) и регулируют поляризацию фронт-тыл, хемотактическую миграцию и заживление ран культивируемых эпителиальных клеток. Интересно, что эти компоненты или взаимодействуют непосредственно с Rho GTPases или контролируют активность Rho GTPase посредством модуляции их GEFs и GAPs (Box 1). Scribble локализует CDC42 и RAC1 на ведущем крае эпителиальных клеток, возможно посредством βPIX, способствуя тем самым поляризации аппарата Гольджи и направленной миграции103. Однако, Scribble , как было показано, супрессирует миграцию эпителиальных клеток путем обеспечения E-cadherin-based межклеточной адгезии83. белок полярности PATJ , как полагают, рекрутирует PAR3 и aPKC белки полярности на ведущий край поврежденных эпителиальных клеток104. CDC42 активирует aPKC, возможно посредством PAR6, и тем самым инициирует множественные нижестоящие сигнальные события. Напр., aPKC и PAR3, совместно с Rac-специфическим GEF TIAM1, обеспечивают стабильную поляризацию фронт-тыл и хемотактическую миграцию кератиноцитов за счет стабилизации микротрубочек95. Более того, PAR3 и aPKC пространственно контролируют эндоцитоз integrin посредством эндоцитотического адапторного белка Numb. aPKC-обеспечиваемое фосфорилирование Numb предупреждает эндоцитоз integrin на ведущем крае105 и тем самым поддерживает стимулирующий integrin adhesion сигнал, который необходим для поляризованной миграции99 (Fig. 5b).
Мало известно о факторах, которые регулируют активность CDC42 во время поляризованной миграции фибробластов или эпителиальных клеток. Не было описано GEFs, которые специфически стимулируют CDC42 в ответ на миграторные сигналы. Однако, CDC42 GAP секвестрируется и ингибируется на ведущем крае с помощью регулятора dynein Nudel, тем самым CDC42 активируется (Fig. 5b) и таким образом способствует CDC42-зависимой поляризации центросом, сохранению миграции и заживлению ран106. Более того,накопление PtdIns(3,4,5)P3 в мигрирующем фронте коррелирует с локальной активацией CDC42. Позитивная петля обратной связи между CDC42 и PI3K как полагают, поддерживает как высокие уровни PtdIns(3,4,5)P3, так и активность CDC42 на ведущем крае, тогда как противодействующая фосфатаза PTEN (phosphatase and tensin homologue) исключается из этого региона97. Рассмотрение роли RAP1 в передаче PtdIns(3,4,5)P3-обусловленных сигналов полярности для активации CDC42 в нейронах, позволяет предположить, что RAP1 обеспечивает активацию CDC42 сходным способом во время поляризованной миграции эпителиальных клеток.
Как обсуждалось выше, клеточная миграция достигается за счет баланса функции CDC42 и RAC1 на фронте клетки и функции RhoA в её тылу. Последние исследования указывают на то, что функция белков полярности заключается в антагонистической регуляции активности Rho GTPase. Rho эффектор ROCK может фосфорилировать PAR3 в его регионе связывания aPKC, это приводит к разрушению комплекса PAR3-TIAM1-aPKC-PAR6 и ведет к снижению клеточной миграции107 (Fig. 5b). Т.о., RhoA негативно контролирует CDC42-индуцированную и RAC1-зависимую клеточную миграцию благодаря взаимодействию с PAR3 комплексом. Однако, aPKC также, по-видимому. ограничивает активность RhoA на фронте мигрирующих клеток. p190A RhoGAP идентифицирован как мишень для фосфорилирования с помощью GSK3β в мигрирующих фибробластах. GSK3β-обеспечиваемое фосфорилирование p190A RhoGAP приводит к ингибированию его GAP активности в отношении RhoA108. Вместе с предыдущими исследованиями, которые описали ингибирование GSK3beta посредством aPKC100,109, становится очевидным, что во время клеточной миграции негативная петля обратной связи, которая состоит из aPKC, GSK3β и p190A, супрессирует активность RhoA и ROCK (Fig. 5b), как это было показано в отношении полярности нейронов
44.
Conclusions and perspectives
Cell polarization is achieved by intricate communication between different classes of proteins, including small GTPases, polarity proteins and cytoskeletal components. These components are differentially distributed within a cell and in many cases they antagonize each other. Such opposing function, for example, between RhoA and RAC1 in cell migration or between the PAR and Scribble complexes in apico–basal polarization, is fundamental for the establishment of cellular asymmetry. Moreover, Rho GTPase signalling substantially controls signalling by polarity proteins and vice versa. It seems that there is a further level of interconnectedness of Rho GTPase and polarity protein signalling, whereby the PAR polarity complex has a central role in balancing Rho GTPase activity. On the one hand, PAR6 and aPKC promote RAC1 and CDC42 polarity signalling and suppress RhoA function, but on the other hand, the RhoA pathway can inhibit RAC1- and CDC42-mediated effects by interfering with the formation of a functional PAR complex (Fig. 6). Such mutual regulation allows for the spatial control of Rho GTPase activity at sites where there is overlapping expression of RhoA and RAC1 or CDC42. For example, despite its function in trailing edge retraction, active RhoA has also been detected at the leading edge of migrating cells110, whereas PAR3 has been reported to partially localize to the rear107. Considering the large number of Rho GTPase regulators and effectors and the diversity of polarity proteins, it seems likely that additional modes of crosstalk between Rho GTPases and polarity proteins will be identified in the future. It might be that polarity proteins contribute to Rac–Rho antagonism in more polarization processes than are currently known.
It will be important to extend future studies to in vivo systems to examine the physiological relevance of the identified polarity signalling events and to investigate the consequences of deregulated polarity signalling in animal tumour models. Several laboratories have recently generated mice deficient for key players of Rho GTPase and polarity protein signalling. The constitutive deletion of many of these polarity regulators, including aPKClambda, PAR3, RAC1, CDC42 and ROCKII, is embryonic lethal111-115, which highlights their importance for proper development. In this respect, research should focus on knocking-out the regulators of relevant Rho GTPases to further understand the complex interplay between Rho GTPases and polarity proteins in normal development and in various aspects of cancer.
