Промежуточные Филаменты

Структура и Функции

Intermediate filaments: from cell architecture to nanomechanics
Harald Herrmann, Harald Ba"r, Laurent Kreplak, Sergei V. Strelkov & Ueli Aebi
Nature Reviews Molecular Cell Biology 8, n7, 562-573 (July 2007) | doi:10.1038/nrm2197
Intermediate filaments (IFs) constitute a major structural element of animal cells. They build two distinct systems, one in the nucleus and one in the cytoplasm. In both cases, their major function is assumed to be that of a mechanical stress absorber and an integrating device for the entire cytoskeleton. In line with this, recent disease mutations in human IF proteins indicate that the nanomechanical properties of cell-type-specific IFs are central to the pathogenesis of diseases as diverse as muscular dystrophy and premature ageing. However, the analysis of these various diseases suggests that IFs also have an important role in cell-type-specific physiological functions.


Рис.1.  | Intermediate filament organization in metazoan cells.


Рис.2.  | Structural model of cytoplasmic and nuclear intermediate filament protein dimers.


Рис.3.  | Destruction of muscle architecture in desminopathy.


Рис.4.  | Overview of the assembly and decay pathway of various desmin mutants.


Рис.5.  |  Hypothetical scheme for the disease mechanism caused by desmin mutations.


Box 1  |  The alpha-helical coiled-coil structure of the intermediate fibre dimer.


Box 1  |  The atomic force microscope: a multipurpose tool for biology


DATABASES
OMIM
  • Alexander disease
  • Hutchinson–Gilford progeria syndrome
  • myofibrillar myopathy
  • Werner syndrome
    • UniProtKB
    FURTHER INFORMATION
    В отличие от растений и грибов клетки животных лишены клеточной стенки и поэтому животные нуждаются в др. способах стабилизации клеток и тканей. Более того, животные нуждаются в мышцах для различных важных активностей, таких как сердцебиения, кровообращение, перистальтическая активность во время приема и периваривания пищи и для локомоции. Эта способность к автономным движениями бросает строгий вызов целостности ткани и вызывает нужду в механизмах, улаживающих механические стрессы. В то время как артроподы используют наружный скелет для стабилизации своих частей тела, большинство др. животных используют разнообразные компоненты для стабилизации мультиклеточных ансамблей и тканей. Одним из характерных признаков животных является существование межклеточных соединений, таких как desmosomes, adherens junctions, gap junctions и tight junctions. Совместно с intermediate filaments (IFs), специфичных для metazoan цитосклетной системы, эти соединения генерируют проходящие через клетки сети как высокой ригидности, так и гибкости, которые интегрируют индивидуальные клетки динамически и функционально в ткани1-3. Поэтому необходимо рассматривать специфические клеточные системы IF как инструментклеток для функциональной интеграции соотв. цитоскелетных систем с физиологическими потребностями индивидуальных тканей и в конечном итоге целых органов.
    У людей белки IF кодируются, по крайней мере, 65 генами, образуя брольшое семейство белков с ограниченной идентичностью последовательностей3,4. Они отвечают за огромные различия между IF системой и системами как microtubule (MT), так и microfilament (MF) — двумя принципиальными цитоскелетными элементами эукариотических клеток. Эти две системы участвуют во многих базовых клеточных функциях, так что мутации их субъединиц, tubulin и actin, оказываются значительно менее толерантными, чем таковые в IF белках. Однако, недавние исследования показали множественные болезненные мутации различных IF белков. ведущие к сложным болезнфм, которые непосредственно отражают запутанные паттерны экспрессии генов IF5,6.
    В противоположность широко распространенному мнению, что индивидуальные IFs обладаютют более или менее сходными или идентичными функциями и свойствами, мы подчеркиваем, что IFs обладают помимо своей клеточно-специфичной экспрессии существенными различиями первичных последовательностей. Из-за клеточно-специфических свойств и высокого количества различных IF систем мы использовали в качестве образца мезенхимный белок vimentin и мышечную систему IF, которая представлена desmin. Однако, др. IF белки, такие как synemin, syncoilin, nestin и, до некоторой степени, keratins также экспрессируются вспецифических мышцах в разных количествах во время различных фаз жизни.

    Cytomatrices work together


    Одним из главыных 'skeletons' у животных является внеклеточный матрикс (extracellular matrix (ECM)), который представлен сложным трехмерным каркасом из фиброзных белков и состоит в основном из collagens. Коллагеновые фибриллы ECM соединяются с внутренностью клеток с помощью hemidesmosomes и focal adhesions7,8. Принципиальным молекулярными компонентами для этого вза имодействия являются integrins, которые могут соединяться с IFs, MFs и ассоциированными с мембраной коллагенами. Следовательно, и форма и функциональня компартментализация клеток metazoan строго зависит от скоординированного взаимодействия между ECM и цитоскелетом.
    Независимо от того, ограничены ли MTs и MFs в основном цитоплазмой, большинство клеток metazoan содержит две приницпиально разные системы: одна внутри ядра, прикрепленная к внутренней ядерной мембране, и др. которая является цитоплазматической, которая соединяет межклеточные соединительные комплексы, расположенные на плазматической мембране с наружной ядерной мембраной9. Цитоплазматическая IF системя является основным фактором, сталибизирующим форму клетки, как было продемонстрировано с помощью микроинъекций пептидов, которые разрушали индивидуальные IFs10. В ядре, система IF собирается из ламинов, которые вместе со всё увеличивающимися количествами ассоциированных трансмембранных и хтроматин-связывающих белков составляют ядерную пластинку (lamin)11. Отметим, что простые прикрепленные животные, такие как гидры, и артроподы, по-видимому, не экспрессируют цитоплазматические IF белки.
    Ламина участвует в организации гетерохроматина и предоставляет платформу для сборки различных ядерных белковых комплексов. Эта группа из всё увеличивающихся элементов сети включает emerin, lamina-associated proteins (LAPs), lamin B receptor (LBR), семейство heterochromatin protein-1 (HP1) и — благодаря MAN1 — даже сигнальные молекулы, такие как SMAD белки, которые могут взаимодействовать с транскрипционными факторами11. Кроме того, согласно недавним находкам, ламина соединяется посредством SUN-доменовых белков с рядом белков наружной ядерной мембраны из семейства nesprin, которые сами по себе соединяются с MTs, MFs и IFs, или непосредственно или с помощью белков. таких как plectin или ACF7, из семейства spectraplakin12-14 (Fig. 1). Взаимодействие из трех систем цитоплазматических филамент как с этими мультифункциональными 'cytolinker' белками, так и с молекулярными моторами, также как и регуляция их взаимодействия с помощью протеин киназ и фосфатаз, генерирует динамическую мультикомпонентную систему, которая обеспечивает, среди прочего, позиционирование ядра и различных клеточных органелл, включая митохондрии15. Итак, оба эти взаимосвязанные белковые каркасы (ядерная ламина и цитоскелет) вносят существенный вклад в динамику и структурную целостность клеток. Используя технику микроманипуляций, было непосредственно продемонстрировано, что ECM механически связан с ядерным матриксом и с ядрышками посредством цитоскелета и клеточно-адгезивных структур16.
    В гипотетической эпителиальной клетке три ключевых системы филамент цитоскелета, microfilaments (MFs), microtubules (MTs) и intermediate filaments (IFs), соединяются др. с др. с помощью димерных комплексов молекул типа plakin, таких как plectin и BPAG1. Кроме того, множество MT-ассоциированных белков и актин-связывающих белков, включая моторные белки, ещё больше увеличивают сложность этих взаимодействий. IFs купированы с IF-закрепляющими бляшками межклеточных соединений (desmosomes) с помощью desmoplakin, прототипической молекулы бляшек (plakin), и с таковыми соединений клетка-матрикс (hemidesmosomes) с помощью plectin и BPAG1. Трансмембранные белки, которые обеспечивают контакты с соседними клетками и с внеклеточным матрикосм (ECM) являются десмосоными cadherins и integrins, соотв. IFs, более того, связаны с outer nuclear membrane (ONM) с помощью plectin и nesprin-3, в то время как nesprin-2 закрепляет систему MF в ядре. На внутренней стороне ядерной оболочки слой ядерных IF белков (lamins) прикрепляется к порам и к белкам inner nuclear membrane (INM), а также к хроматину. Мембранные белки из INM могут быть сцеплены с ONM и тем самым обеспечивать механическую непрерывность от ECM до хроматина. ER, endoplasmic reticulum; MTOC, microtubule-organizing centre; NPC, nuclear pore complex. * High resolution image and legend (124 KB) * Figures and tables index * Download Power Point slide (322 KB)

    Tissue specificity and development


    В соответствии со своей ролью в целостности тканей и детерминации формы клеток у взрослых организмов, IFs также, как полагают, играют важныу роль в координации механических сил в эмбриональном развитии, росте и созревании специфических тканей17. В то время как B-type lamins экспрессируются во время всех эмбриональных стадий, экспрессия A-type lamins включается только во время дифференцировки. Напротив, экспрессия цитоплазматических IF белков зрначительно сложнее и осуществляется параллельно со специфическими путями эмбриогенеза и дифференцировки. В частности, мышечные клетки экспрессируют desmin в качестве главного IF белка, а нейрональные клетки синтезируют белки триплета нейрофиламент, а также α-internexin и nestin, тогда как клетки предшественники обеих этих тканей экспрессируют мезенхимный IF белок vimentin. Глиальные клетки синтезируют glial fibrillary acid protein (GFAP), экспрессия которого часто предшествует экспрессии vimentin. Наконец, эпитилии экспрессируют множественные и разнообразные кератины. Впечатляющим примером сложных программ является тонко-контролируемая экспрессия во время дифференцировки keratins в различных сегментах экзокринных потовых желез. В секреторной части экспрессируются 4 разных кератина в миоэпителиальных клетках железы, 6 др. кератинов синтезируются в секреторных железистых клетках один кератин обнаруживается в обоих клеточных слоях. Клетки просветного клеточного слоя экспрессируют 9 разных кератинов, что является примером наивысшей сложности в одиночном слое эпителиальных клеток18.
    Взаимодействие между клетками в клеточных слоях в тканях и органах, таких как эпидермис и сердце, обеспечивается частично с помощью десмосом. Эти межклеточные соединения используют специфичные для десмосом зависимые от кальция адгезивные молекулы, такие как desmogleins и desmocollins, и тем самым закрепляют различные IFs клеточно-специфическим образом; они закрепляют кератины в эпителии, desmin в кардиомиоцитах и vimentin в клетках паутинной и мягкой мозговой оболочки мембран, которые покрывают ЦНС (meninges) а также в клетках специализированного эндотелия19. IFs по-разному отделяются от и организуются параллельно MF-закрепляющим структурам типа слипчивых соединений (Fig. 1). Координация функции обеих систем — напр., в интеркалировнных дисках сердца — на сегодня в основном неуловима, но использует белки бляшек plakoglobin и plakophilin, хотя сегодня становится ясно, что состав межклеточных соединитеьных структур значительно сложнее, чем это предполагалось20. В соответствии со своей центральной функцией в тканевом гомеостазе мутации как десмосомных, так и IF белков ведут к тяжелым нарушеням функции в некоторых тканях, особенно в сердце21,22. Итак, тонкая настройка взаимодействия этих различных элементов может быть предварительным условием оптимальной функции, ремоделирования и репарации ткани23.

    Structure of IF proteins


    IF белки были сгруппированы в 5 типов или в sequence homology classes (SHC), на базе характеристик аминокислотных последовательностей3. Кислые и щелочные кератины сгруппированы в тип 1 и 2, соотв. Vimentin, desmin и GFAP отнесены к типу 3, белки нейрофиламент составляют тип 4,и ядерные lamins являются типом 5. Используя функциональные критерии для классификации, IF белки могут быть альтеранативно подразделены на три независимые группы в соответствии с их способом сборки: кератины, vimentin-подобные белки и ламины.
    Несмотря на огромное разнообразие среди IF белков все они обладают общим планом структурного посторения с приблизительрно в 45-nm длиной центральным α-спиральным 'палочкообразным' доменом, который фланкирован не-alpha-спиральными N- и C-терминальными концевыми доменами, называемыми 'головка' и 'хвост', соотв. Структурная организация coil 2 сильно законсервиована; но определенные различия существуют в плане построения coil 1 и хвостового домена цитоплазматических (Fig. 2, upper model) и ядерных (Fig. 2, lower model) IF белков, как напр. на Fig. 2 для vimentin и lamin A. В частности, ламины обладают 42 добавочными аминокислотами в спирали 1B и очень консервативной immunoglobulin-fold структурой из 108 аминокислот в центре хвостового домена (Fig. 2).

    На первом уровне сборки две индивидуальрные полипептидные цепочки ассоциируют параллельно и in register, чтобы сформировать двойную спираль, как показано Crick для кератинов ещё 50 лет назад (Box 1; Fig. 2). Эти двухспиральные димеры являются основными строительными блоками при сборке IF. Цитоплазматические IF белки формируются при низкой ионной силе и физиологических значениях pH, в анти-параллельные, наполовину сплетенные тетрамеры. В зрелых филаментах эти тетрамеры грубо выравниваются вдоль оси филамент. Как следствие анти-параллельной ассоциации полярных димеров IFs не обладают полярностью в противоположность MTs и MFs. Напротив, свойства расстворимости ламинов значительно белее сложные. Хотя стабильные димеры, получаются при высоких pH и концентрации солей около 250 mM NaCl, формирование комплексов высшего порядка начинается вскоре после установления более физиологических концентраций24,25.Механические свойства IFs в определенной степени определяются этими двойными спаралями. В то же самое время силы слипичвости между соседними димерами также важны для наномеханического поведения IFs. Хотя исследования химических поперечных связей показывают существование нескольких специфических способов латерального dimer–dimer расположения26, вполне возможно, что индивидуальные димеры могут до некоторой степени скользить относительно один др. Итак, имеются как свойства двухспиральных димеров, так и боковых взаимодействий др. с др., которые специфицируют наномеханическое поведение индивидуальных IFs в терминах пластичности, ломкости и противодействия изгибам (Box 2). В конечном итоге эти характеристики транслируются в уникальные свойства завершенной IF сети, которая обладает, как полагают, амортизирующей функцией.

    Filament assembly and dynamics


    Одним из фурндаментальных различий между IFs и MTs и MFs является тот факт, что белки субъединиц MTs и MFs (tubulin и actin, соотв.) являются глобулярными белками со связанными нуклеотидами, которые они могут гидролизовать после завершения сборки. Гидролиз нуклеотидов ведет к конформационному изменению и следовательно, конформационный статус MTs и MFs связан с химическим грузом клетки; т.е., с концентрацией доступных нуклеотид трифосфатов.
    IF assembly. In vitro сборка IF не непосредственно зависит от кофакторов, но in vivo их ремоделирование и and и структуные характеристики как 'stress absorbers' функционально зависят от комбинированного действия киназ, фосфатаз и хаперонов7,27. более того, IFs резистентны в воздействиям, таким как холод или высокие концентраци солей, т.к. они не диссоциируют даже в буферах высокой ионной силы (1.5 M KCl). Только в буферах низкой ионной силы они дезинтегрируются в растворимые комплексы. Биохимические свойства цитоплазматических и ядреных IFs отличаются существенно и это, по-видимому, служит основой для их принципиально отличных путей генерации филаментозных структур28-30. Дальнейшие доказателства из исследований in vitro показывают, как пути сборки ядерных и цитоплазматических IF белков отличаются25. Среди цитоплазматических IF белков, возможны два типа сборки: в то время как кератины представляют собой облигатные гетерополимерные димеры из одного кислого и одного щелочного партнеров, desmin и vimentin IFs могут давать гомополимеры, хотя в большинстве ситуаций они образуют смешанные димеры с белками из той же самой группы сборки, бок-о-бок с гомодимерами. IF свойства могут быть , следовательно, значительно модулированы даже в или вдоль одной из филамент. Напр., паттерны совместной сборки комплексов делают возможрным включение 4-х различных белков нейрофиламент, NF-L, NF-M, NF-H и alpha-internexin, в нейрофиламенты. В периферических нервах SHC3 IF белок peripherin включается в нейрофиламенты в разных соотношениях, образуя тем самым добавления к триплетным белкам нейрофиламент.
    Сходный уровень сложности вносится в мышечные IFs посредством IF белков, таких как synemin и syncoilin, которые подобно NF-M и NF-H, имеют длинный non-alpha-helical C-терминальный хвостовой домен. Synemin и syncoilin не образуют IFs сами по себе, но интегрируются в IFs посредством димеризации их α-спирального rod домена с таковым vimentin, desmin, α -internexin или NF-L. Synemins экспрессируются во всех типах мышечных клеток и снабжают IFs способностью взаимодействовать с costameres31 посредством dystrophin и utrophin32. Более того, их способность ассоциировать с актин-связывающим белко α -actinin и с vinculin дает возможность IFs непосредственно соединяться с фокальными адгезиями и тем самым с MF системой33. Итак, смешанные IFs могут вызывать огромные сложности, даже при изменении вдоль одной из филамент, которая в свою очередь делает IFs одой из наиболее изменчивых биохимических 'платформs'.
    Кроме того, IFs из членов трех групп сборки — кератинов, vimentin-like IF белков и lamins — не образуют ко-полимеров, но могут располагаться как самостоятельные системы филамент в одном типе клеток. Следовательно, они выполняют разные функции бок-о-бок и могут в то же самое время усиливать др. др. Итак, если клетка представляется как сложнный материал, то внесение только одного элемента без сомнения недостаточно, чтобы объяснить интегративыне параметры, такие как вязко-упругие свойства и резистентность к механическим стрессам34. Последнее, но не менее важное, поверхность индивидуальных типов IF может варьировать существенно благодаря низкому сходству аминокислотных последовательностей индивидуальных IF белков в тех частях двойной спирали, которые экспозируются на поверхности, а также во всех головных и хвостовых доменах. Итак, в отличие от MTs и MFs, каждый данный тип IF отличается существенно от др. в отношении своих химических поверхностных свойств.
    Cytoplasmic unit-length filament formation. В отличие от актина и тубулина цитоплазматические IF белки не образуют зародышей, к которым добавляются индивидуальные субъединицы, такие как мономеры и димеры, но они ассоциируют боками в полной толщины приблизительно в 60-nm длины IFs, известные также как unit-length filaments (ULFs), с помощью процесса, который завершается в секунды. Более того, это боковое взаимодействие настолько сильно, что оно происходит даже при высоком pH вследствие добавления солей28, 35. Дальнейшая, более медленная фаза элонгации управляется продольным отжигом (annealing) индивидуальных ULFs, происходящим и возможно использующим молекулярные перестройки в индивидуальных ULFs. Итак, ULFs служат как ядра для образования IF и составляют строительные блоки для роста филамент. Кроме того, растущие IFs всё ещё могут сливаться конец-в-конец. В третьей, кооперативной фазе, диаметры филамент уменьшаются, это указывает на дальнешую реорганизацию внутрифиламентозных субъединиц36. Эта ступень 'радиальрной компакции' происхтодит в одинаковой степени в разных условиях сборки, указывая тем самым, что она представляет собой важную общую ступень в превращении промежуточной сборки в зрелые IFs. Недавно была описана математическая модель кинетики этого процесса сборки37.
    Dynamics of nuclear lamins. В противоположность цитоплазматическим IF белкам, сборка ламинов in vitro из димеров использует одновременно боковую и продольную ассоциации димеров25. Так, уже спустя 5 сек после инициации сбокр и обнаруживаются взаимосвязанные фибриллярные нити различной длины и толщины. Изменчивость в диаметре (2–16 nm) обнаруживается вдоль индивидуальных волокон, более толстые части имеют шишко-образную поверхность, которая, по-видимому, представляет собой глобулярную immunoglobulin-складку хвостового домена (Fig. 2). Легко предсказать, что измерения, базирующиеся на высоких концентрациях белка для сборки и использующие массовые сборки, такие как в rheology, будут давать более сложные результаты благодаря гетерогенности генерируемых структур38. В противоположность сценарию быстрой сборки in vitro ламиновые структуры, формируемые in vivo, по-видимому, более или менее регулярные (когда их можно наблюдать, такие как ламина ооцитов Xenopus laevis 24).
    In vivo, динамика IFs отслеживалась с помощью микроинъекций флюоресцентно меченных IF белков или с помощью трансфекции химерных IF белков и green fluorescent proteins30,39. В то время как цитоплазматические IFs , по-видимому, более динамичны, ядерные ламины, как было показано, остаются более или менее на месте, как только оказываются интегрированными в ламину, указывая тем самым, что они являются частью стабильной молекулярной суперсети или матрикса40,41.

    Single IF mechanics and beyond


    На уровне одиночных филамент недостаточно информации о механических свойствах трех компонентов цитоскелета. Используя atomic force microscopy (AFM), сегодня возможно получение time-lapse картин и механических стрессов на одиночные филаменты, включая и IFs, различными способами (Box 2). Эта техника может быть усовершенствована для использования в методах анализа эффектов мутаций, а также и ассоциированных с мутациями белков, на свойства филамент.
    Soft, extensible and nearly unbreakable. Сборка In vitro как рекомбинантных, так и аутентичных IF белков дает выглядящие гладкими, гибкие филаменты под ЭМ и AFM42. На таких картинах подсчитана персистентная длина приблизительно в 1 µm для vimentin IFs43, которая в свою очередь дает динамический модуль упругости при сдвиге из немногих Pa для разбавленной суспензии (0.1–1 mg per ml) из перепутанных IFs. Это значение достоверно меньше, чем таковое для собранных MFs при той же самой концентрации белков44. Богатый кератином ороговевающий эпидермальный слой кожи содержит сеть IF, которая в 100- 1000-раз более сконцентрирована и следовательно, обладает модулем упругости , характерным для MPa45. Далнейшее выравнивание кератиновых IFs и связывание поперек с помощьюдисульфдных мостиков дает у млекопитающих придатки, такие как копыта, ногти, оперение и волосы. Эти материалы обладают модулями упругости ранга GPa46, который может быть понижен, по крайней мере, в 10 раз с помощью редуцирующих агентов, таких как dithiothreitol47.
    IFs не просто гибкие филаменты, они также обладают необычной растяжимостью по сравнению с MFs и MTs. В недавнем AFM исследовании было продемонстрировано, что одиночные нейрофиламенты, desmin и keratin IFs могут быть растянуты в 3.5-раза48 (250% tensile strain; Box 2). Это сравнимо с rheological измерениями, осуществленными на спутанных IFs , которые могут выдерживать 300–400% деформации сдвига прежде чем сеть разорвется49. Сходным обазом, нити слизи миксин, которые выталкиваются, являются макроскопически видимыми пучками выравненных кератин-подобных IFs, могут выдерживать 220% относительрной деформации растяжения прежде, чем разорваться. Напротив, шерсть и волосы могут выдерживать до 50–60% растяжения в воде из-за сильных поперечных связей за счет дисульфидных мостиков46.
    IFs совмещают необычную растяжимость со строгой устойчивостью к разрывам50. Предварительные AFM данные показывают, что одиночная десминовая филамента может выдерживать 1–2 nN перед разрывом при 250% tensile strain (L.K., unpublished observations). Для сравнения MFs рвутся при 0.6 nN при низком уровне относительной деформации растяжения51. Благодаря поведению одиночных филамент богатые кератином волокна разрываются при значительных стрессовых воздействиях между 150 и180 MPa. Это достигается за счет эффектного уплотнения выше порога натяжения, который является разным для каждого типа волокна. Хотя т.наз. деформационное упрочение (strain-hardening) является общим свойством всех IF ансамблей, оно не наблюдается в MFs и MTs. Даже расстворенная суспензия филамент обнаруживает нелинейное увеличение их динамичного модуля упругости при сдвиге для крупныхотносительных деформаций сдвига (50% или более)44.
    Mechanical properties of the cytoskeletal network. В цитоскелете IFs, по-видимому, действуют синергично с MF и MT сетями. На базе измерений in vivo потери устойч ивости MT, недавно было предположено, что MTs могут быть более резистентными к силам сжатия, чем ожидалось, исходя из измерений in vitro MTs52. Механизм, предполагаемый в этом исследовании, заключается в том, что IFs подкрепляют MTs, которые в свою очередь снижают способность IFs сгибаться. Было также продемонстрировано в сопутствующем исследовании, что смешанная суспензия перепутанных vimentin IFs и актиновых филамент имеет значительно больший динамический модуль упругости при сдвиге по сравнению с суспензией каждого в отдельности при тех же общих концентрациях белков53. В качестве возможного механизма авт. предполагают. что хвостовой домен vimentin может непосредственно соединяться с MFs, давая в результате поперечно связанную сеть вместо спутанной суспензии. Фактически прямое связывание может быть даже необязательным для объяснения кооперативного поведения двух систем филамент. Вместо этого мы полагаем. что большинство хвостовых доменов f vimentin высовывается с поверхности филамент, т.к. ранее это было показано для хвостового домена нейрофиламент триплетного белка NF-H, в результате чего возникает гидродинамичный радиус, который выше, чем физический hf.bec в 5 nm54. Следовательно, ригидные MFs, будучи внедренными в матрикс vimentin IF, д. быть более ограничены в движениях, чем если бы они были окрвжены др. MFs. Также как в случае MTs, это боковое усиление д. давать более жесткий гель.
    Эти независимые исследования подкрепляют тот факт, что IFs могут механически интегрироваться в MF и MT цитоскелет, создавая каркас с уникальными свойствами. Интересно отметить, что вклад IFs в механические свойства клеток и тканей был полностью нивелирован большей частью исследователей. Это конечно не связано с отсутствием пригодных экспериментальных подходов, которые существуют (rev. Ref. 55). Вместо этого большинство исследователей объясняет механические свойства клетк и тканей , связывая их только с изменениями в архитектуре сетей MF и MT несмотря на на присутствие IF систем55.

    Mechanotransduction


    Функция устойчивого к стрессам структурного континуума, такого как IF система, в гомеостазе клеток не изучена на механистическом уровне, но она может составлять важную платформу для обеспечения процессов клеточной механотрансдукции17. Ранее исследования по интеграции ECM рецепторов с элементами цитоскелета подчеркивали прямую механическую связь структур клеточной поверхности со склетом ядра56. Более того, было продемонстрировано, что растягивание клеток, таких как кардиальные миоциты, вызывает индукцию непосредственно–ранних генов, соповождаемую сильной ростовой реакцией 57. Важность сетей трансклеточных IF для целостности тканей стала очевидной после открытия мутаций кертинов. вызывающих болезни, которые приводят к тяжелой ломкости клеток кожи у затронутых пациентов в ответ на механические травмы. Более того, недавние подтверждения получены от различных редких заболеваний, указывающих на то, что помимо своих структурных функций, IF участвует также в передаче клеточных сигналов. В самом деле, эти клеточно-специфичные мультикомпонентные ансамбли белков являются все субстратами для реакций множественных фосфорилирований58, 59. Поэтому можно предположить, что количество эффективных взаимодействий является высоким и за пределами нашей способности соотв. их описания60.
    Как же механические стрессы влияют на физиологию ткани? Генный таргетинг является мощным инструментом, который может быть использован при анализе физиологичекой роли IF белков. Ген vimentin явился одним из первых IF генов, которые были нокаутированы у мышей61. Хотя эмбриональное и постнатальное развитие кажутся затронутыми не существенно, но радикальные эффекты наблюдались в экспериментальных ситуациях, вызванных физиологическими свойствами трансгенных животных. Напр., удаление 3/4 почечной массы было летальным у мышей, у которых отсутствует vimentin, из-за конечной стадии почечной недостаточности в течение 72 ч, тогда как контрольные мыши выживали благодаря восстановлению свойств кровобращения их сосудов62. Баланс продукции эндотелием nitric oxide и endothelin был нарушен у нокаутных мышей, т.к. они синтезировали больше endothelin, чем nitric oxide, а смерть была следствием отсутствия сосудистой адаптации к уменьшению нефронов. Однако, перфузия нефрэктомизированным мышам агониста endothelin-рецептора, позволяла выживать vimentin-нулевым мышам. Различные экспериментальные подходы продемонстрировали, что vimentin модулирует структурную реакцию артерий путем изменения тока и давления крови и тем самым играет критическую роль в механотрансдукции срезывающего напряжения (shear stress)63, 64 (т.е. в патологических условиях, при которых необходимы сосудистые адаптации). Было установлено, что в ситуации регенерации после индуцированной билатеральной почечной ишемии , vimentin является важным для обеспечения локализации Na–glucose cotransporter I на мембранах щеточной каймы, предупреждая тем самым глюкозурию у пост-ишемических мышей65.
    В разных физилогических контекстах потеря vimentin, по-видимому, вызывает нарушение моторной координации, как показывают поведенческие тесты у некоторых нокаутных мышей. Морфологический анализ головного мозга от vimentin-нулевых мышей выявил плохо развитую и очень аномальную Bergmann глию, а также онтогенетические дефекты клеток Пуркинье66. Сравнительно недавние эксперименты показали, что vimentin участвует в клеточных процессах, таких как ретроградная передача сигналов после повреждений нервов и миграция лейкоцитов по эндотелию, также наз. diapedesis67,68. В поврежденных периферических нервах локальный синтез в аксонах белков переносчиков, таких как vimentin, предоставляет молекулы, которые инкорпорируют потенциальные сигнальные молекулы, такие как транскрипционные факторы и mitogen-activated protein (MAP) киназы, в dynein ретроградные моторные комплексы. Очень важно, что регенерация поврежденных нейронов ганглиев дорсальных корешков задерживается у vimentin-нулевых мышей67. При diapedesis присутствие vimentin, как было показано, является важным для peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), т.к. эти клетки обнаруживают заметное снижение способности возвращаться домой в мезентерические лимфатические узлы и селезенку у vimentin-нокутных мышей. Более того, поврехностные рецепторы, которые являются критическими для возвращения домой лимфоцитов, такие как intracellular adhesion molecule-1 (ICAM1) и vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM1) на эндотелиальных клетках, а также integrin-β 1 yf PBMCs, экспрессировались и распределялись неправ ильно в отсутствие vimentin68. Следовательно, очевидно, что IFs активны в адгезии и трансмиграции лимфоцитов. Эти немногие примеры показывают, что хотя t vimentin не является существенным для генераци мышей, его экспрессия, по-видимому, существенна для выживания мышей в природных местообитаниях, где деятельность и здоровье животных подвергается воздействию инфекционных микробов, паразитов и хищников.

    IFs and disease


    Как упоминалось выше, IFs стали центром внимания, когда было устанровлено, что точковые мутации в генах кератина приводят к тяжелым blistering заболеваниям у людей (rev. Ref. 69). Наиболее подходящим объяснением механизма этих заболеваний стала модель механических стрессов, согласно которой воздействия на кожу механических стрессов приводит к разрушению большей части эпидермиса в отсутствие соотв. кератиновой сети. После этого открытия были продемонстрированы мутации в desmin , как вызывающие мышечную дистрофию (rev. Ref. 70; see also below). Вскоре были обнаружены и мутации в lamin A , также вызывающие мышечные дистрофии (rev. Ref. 71). Эта последняя находка привела к идентификации более чем 230 мутаций в lamin A , которые вызывают сложный набор, по крайней мере из 13 различных заболеваний людей6,72. Среди них тяжелые заболевания, которые вдут к преждевременному старению, такие как синдром Hutchinson–Gilford прогерии и атипический синдром Werner73. Наиболее интересны мутации в desmin и lamin A , вызывающие мышечные дистрофии и кардиомиопатию. Хотя механизм болезни не всегда ясен, предложнеы несколько моделей, включая стрессовую, клеточных судеб и генной экспрессии74.
    Одним из наиболее драматических фенотипов заболеваний является вызванный мутациями в IF белке GFAP. Эти мутации вызывают болезнь Alexander, фатальное нарушение ЦНС, которое характеризуется разрушительными нарушениями нормального развития головного мозга и черепа75. В качестве частичного патомеханизма болезни Alexander было предположено, что соотв. GFAP мутации могут представлять собой реакции астроцитов на стрессы76. Кроме того, нарушения в сигнальных путях, как вызванные мутациями в IF белках, могут быть ответственны за некоторые аспекты IF-связанных болезней в целом77.
    Проявление IF-связанных болезней обычно происходит в определенное время5. В то время как мутации кератинов могут проявлять себя во время рождения, заболевания сердца, вызываемые мутациями в desmin или lamin A обнаруживаются в относительно позднем возрасте во второй или третьей декаде жизни. Напротив, симптомы epidermolytic заболеваний, вызываемых мутациями кератинов, могут действительно улучшаться с возрастом. Это указывает на то, что комплект белков. которые участвуют в генерации этих заболеваний, изменяется во время развития и с возрастом. Более того, баланс между функциональным и болезненным состоянием зависит от незначительных изменений в IF цитоскелете.

    IFs — a dispensable part of muscle architecture?


    В скелетных и сердечной мышце позвоночных IF белок desmin встречается в большом количестве в структурах, которые окружают саркомеры в позиции Z-дисков и при соединении саркомеров с costameres (в случае скелетных мышц) или десмосомами (в случае сердечной мышцы). Помимо этого десминовые IFs структурно интегрируют ядра и митохондрии в цитоскелете миоцитов78. Хотя присутствие desmin не является существенным для собственно формирования мышц во время эмбрионального развития, как это былопродемонстрировано с помощью генного таргетинга у мышей, его отсутствие имеет серьезные последствия, когда мыши начинают тренироваться.
    Towards an understanding of desminopathies. Myofibrillar myopathy (MFM) гистологически характеризуется дезинтеграцией Z-дисков и миофибрилл, а также эктопическими subsarcolemmal и intrasarcoplasmic накоплениями и агрегациями desmin, alphaB-crystallin, plectin, ubiquitin, titin и др. белков (Fig. 3). Сисмптомы обычно проявляются во второй или третьей декаде жизни, это заболевание затрагивает как поперечно-полосатые, так и гладкие мышцы, приводя к медленно прогрессирующей миопатии. Однако, затрагивание кардиальной мышцы ведет к dilated cardiomyopathy (DCM), restrictive cardiomyopathy (RCM) или hypertrophic cardiomyopathy (HCM) и характеризуется ранним проявлением аритмий, как основной причины смерти у этих пациентов. Итак, патомеханизм, который лежит в основе возникновения MFM понятен лишь частично. Большинство исследований было сфокусировано на desminopathy и alphaB-crystallinopathy, которые вызываются мутациями в desmin и alphaB-crystallin, соотв. Для desminopathyнедавние исследования были сконцентрированы на гипотезе, что мутации в гене desmin обусловливают дефектную сборку IF и сто это приводит к агрегации неправильно упакованного белка70. Соотв. мутации в rod домене desmin, как было установлено, дают характерные дефекты сборки: или они арестовывают нормальный процесс сборки in vitro на специфических стадиях или они приводт к демонтажу нерегулярных структу предшественников79 (Fig. 4). В противполжность предудыщим мнениям, многие из мутаций делали возможным формирование филамент, хотя эти филаменты имеют явные альтерации в архитектуре филамент, включая изменения в количестве субъединиц на поперечный срез по сравнению с дикого типа desmin IFs80. Так, наномеханические свойства этих филамент, по-видимому, были тяжело нарушены.

    Ситуация в миоцитах еще более сложная благодаря гетерозиготности, т.к. затронутые пациенты обладают как дикого типа, так и мутантным аллелем. Принимая это во внимание было показано, что формирование филамент у мутантов дефицитных по сборке desmins может быть нормализовано в некотоых случаях присутствием десмина дикого типа81. Во многих случаях , однако, мутантный белок направляет белок дикого типа в не-IF структуры82. Их анализ in vitro вместе с исследования ми по трансфекции показал, что некомпетентный к сборкемутантный десмин формирует цитоплазматические агрегаты, тогда как мутанnyst ltcvbys? способные к образованию филамент , собираются в филаментозные сети79,83. Потенциальным механизмом, вызывающим болезнь мутациями, способными к формированию филамент, МОЖЕТ БЫТЬ тот, что неправильная укладка белка и/или альтерации паттернов поверхностных зарядов вмешиваются в собственно связывание с IF-ассоциированными белками. Альтернативно, альтерации прирожденных вязкоупругих свойств одиночных десминовых филамент могут вызывать неспособность к механической координации позиционирования индивидуальных мышечных волокон. Детальные исследования связывания с IF-ассоциирующими белками и анализ биофизических свойств на уровне одиночных филамент м. помочь пониманию. Напр., неправильно упакованный мутантный десмин или alphaB-crystallin может преодолевать механизмы контроля качества белка, предоставляемые ubiquitin–proteasomeпутем, и приводит к формированию агрегатов84,85. Образование агрегатов может действительно защищать миоциты, т.к. потенциальрно токсические растворимые белковые комплексы тем самым будут удалены86.В самом деле было продемонстрировано, что при некоторых связанных с десмином миопатиях, при которых повышена концентрация в клетках растворимого неправильно уложенного белка, наблюдается дисфункция митохондрий и активация митохондриального каскада апоптоза87,88.
    Итак, мутации desmin могут затрагивать миоциты и мышечных гомеостаз разными способами, которые не обязательно взаимоисключающие. Соотв. разные гипотезы были предложены в отношении патомеханизма в попытке объяснить как и на каком уровне организменной организации соотв. мутации могут оказывать свой эффект (Fig. 5). Однако, более рациональное понимание патогенеза desminopathy, нуждается в большей информации о фундаментальрных принципах функционирования мышц. Это в свою очередь может помочь понять патогенез этого сиротского заболевания , а также др. более распространенные дегенеративные мышечные заболевания89.

    Desmin at work


    Хотя 'plastic dish' клеточная биология выявила многие интересные свойства десминовых IFs, более существенное понимание было достигнуто в исследовани ях, которые использовали изолированные мышечные волокна. Было продемонстрировано, что степень структурных повреждений мышц в экспериментальных ситуациях — после форс ированного растягивания, напр., — коррелирует с исчезновением иммунореактивности десмина из мышц во время первых минут эксцентричных сокращений (которые определялись как удлиннение активированных мышц). Это, по-видимому, обусловлено маскированием эпитопа антител после структурной реорганизации десминовых IFs или протеолитического переваривания десмина90. После продолжительных упражнений (30 мин), в зависимости от типа мышцы, 8–24% мышечных волокон были десмин-негативны. Величина обнаруживаемой потери десмина коррелировала с потерей контрактильных сил. Хотя саркомерная организация нарушена несущественно, распределение titin было сильрно изменено в клетках, которые теряли иммунореактивность по десмину. Это указывает на то, что внесаркомерный цитоскелет, который преимущественно состоит из desmin, alpha-actinin и plectin, стабилизирует цитоскелет внутри саркомеров, который задействует titin и nebulin в качестве основных компонентов. Итак, две системы функционируют совместно, чтобы латерально интегрировать механическую работу в индивидуальном мышечном волокнеs и посредством costameres во всей ткани. Более того, эти эксперименты показали, что, desmin играет главную роль в обеспечении собственно сил трансдукции и распространения в мышце.
    Более того, механические взаимодействия между desmin IFs и costameres, Z-disks и ядрами наблюдали непосредственно благодаря пассивной деформации одиночной мышечной клетки. В частности, связь между этими структурами была количественно оценена с помощью интегрального экспериментального и компьютерного арнализа миофибрилл, от дикого типа и desmin-нулевых мышей91. Подобно vimentin-нулевым мышам, desmin-нулевые мыши развиваются нормальо вплоть до рождения. Вскоре после рождения их сердца обнаруживают обширные структурные дефекты, включая гибель миоцитов и кальцифицированный фиброз, которые указывают на главную неправильную функцию в работе мышц92-94. Самые ранние ультраструктурные дефекты, наблюдаются в затронутых митохондриях и эти дефекты могут быть частично устранены за сяет избыточной экспресии анти-апоптического регулятора BCL2 у desmin-нулевых мышей95,96. Как следствие нокаута desmin добровольные и принудительные упражнения негативно сказывались на нулевых мышах по сравнению с мышами дикого типа и следовательно, нормальные уровни десмина являются обязательным компонетом осуществления упражнений97. Это др. пример, в котором структурные и физиологические функции не могут быть разделены. Итак, эти эксперименты показали, что потеря десмина делает мышей 'ленивыми', это конечно важно в эволюци онном контексте для животных, чьё выживание как индивидов, так и вида критически зависит от их способности убегать.

    Conclusions


    Evidently, IFs are among the most versatile structures of metazoan cell architecture. They exist in two separate moieties that interact via the nuclear envelope by a complex system of inner and outer nuclear membrane proteins. These moieties are the nuclear lamins (which form a planar network that interlaces the inner nuclear membrane proteome and the interphase chromosome surface) and cell-type-specific cytoplasmic IFs (which form a flexible system of long individual filament arrays that integrate multiple cellular components, including MTs and MFs, into a dynamic, stress-buffering cytoskeleton).
    Through a multitude of associated proteins, IFs connect the cytoskeletons of a cell to cell–cell and cell–matrix junctions, thereby establishing transcellular networks. At these mechanically coupled interfaces, IFs interact with multiple supramolecular complexes that are part of regulatory and signalling chains, including receptor tyrosine kinases, such as integrins, and structural components of adhesion-plaque proteins, such as plakophilins. IFs are therefore a crucial part of the 'signalosome' of cells and tissues that translate changes of environmental conditions into alterations of gene expression at the cellular level. IFs also provide an extensive and biochemically versatile interface surface that can be tailored by individual cells to serve as a dynamic platform for the binding of protein complexes, organelles and 'receptors' that tether internal membranes to the cytoskeleton.
    The complex clinical phenotypes that are exhibited in humans as a consequence of mutations in IF proteins amply show how intimately IFs are linked to developmental processes of humans and animals. The most dramatic examples are lamin A mutations that lead to premature ageing, desmin mutations that destroy an entire organ (the heart) and GFAP mutations that cause Alexander disease. Therefore, as mutations in IF proteins, such as lamin A, affect the execution of genetic developmental programmes as well as ageing, the 'engineering' of IF proteins by evolution was and is of utmost importance for the successful development of vertebrates and probably animals in general.
    Сайт создан в системе uCoz