| NF-κB | NLS | | | RIPs | RHD | | TAD |

Прошло 20 лет с момента идентификации nuclear factor-κB (NF-κB) в качестве регулятора экспрессии легкой цепи κB в B клетках, исследования функции и регуляции семейства NF-κB продолжаются. Успехи в понимании того, как иммунная система воспринимает патогены и перерабатывает эту информацию посредством активации NF-κB, также как и всё увеличивающийся список болезней, при которых задействована дерегуляция NF-κB продолжают будить широкий интерес к регуляции этого индуцибельного фактора. При PubMed поиске найдено около 30,000 работ и около 3,000 обзоров, связанных с NF-κB. Основной объем работ в этой области NF-κB, приходящийся на исследования как источника парадигм передачи сигналов, которые широко применяются к данной системе, и как тигель, в котором сплавляются идеи несопоставимых областей, был модифицирован и созрел в новые концепции.

Индуцибельная регуляция генной экспрессии является центральным элементом нормальной физиологии и является ключевой для способности многоклеточных организмов приспосабливаться к средовым, механическим, химическим и микробиологическим стрессам. Благодаря удобству для экспериментов и важности для болезней NF-κB служит моделью реакции на клеточном, тканевом и организменном уровнях, которые контролируются посредством индуцибельных транскрипционных факторов. NF-κB играет свою наиболее важную и эволюционно законсервированную роль в иммунной системе, регулируя экспрессию индукторов и эффекторов во многих точках обширных сетей, которые определяют реакции на патогены. Поэтому большая часть наших знаний NF-κB получена в исследованиях сигнальных путей, имеющих отношение иммунологии. Размах NF-κB, однако выходит за пределы транскрипционной регуляции, ограниченной иммунным ответом, он действует более широко, влияя на события экспрессии генов, которые участвуют в жизнеспособности. дифференцировке и пролиферации клеток.

Разнообразие биологических ролей, выполняемых NF-κB, ставит некоторые интригующие вопросы о том, как ограниченный набор молекул, передающих сигнал, регулирует передачу сигналов к NF-κB во всех путях и напротив, как дискретные импульсы вызывают транскрипционные реакции, приспособленные к определенной ткани и органу с тем же самым ограниченным набором регуляторов. Нарушение его функции имеет многочисленные вредные последствия. В самом деле, литература заполнена сообщениями, связанными с дерегуляцией NF-κB при разнообразных патологических ситуациях (Courtois et al., 2006, Karin, 2006).

Всё увеличивающийся объём литературы по NF-κB делает написание всеобъемлющего обзора по NF-κB устрашающим. Поэтому вместо современного обзора мы попытались пролить свет на некоторые аспекты регуляции и функции NF-κB, которые отражают широкое физиологическое и медицинское значение этого транскрипционного фактора с особым вниманием тем областям, в которые достигается существенный прогресс, напр., регуляторным механизмам, которые иллюстрируют общие принципы, которые скорее всего распространяются на пути тех, в которых действует NF-κB. Мы организовали обзор вокруг стержневых компонентов NF-κB пути, а именно, IKK комплекса, ингибирующих IκB белков искомого транскрипционного фактора NF-κB.

Background

Базовая схема передачи сигналов NF-κB состоит из серии позитивных и негативных регуляторных элементов. Индуцирующие стимулы запускают активацию IKK, ведущую к фосфорилированию, убиквитинированию и деградации IκB белков (Figure 1). Высвобождаемые NF-κB димеры затем активируются посредством различных посттрансляционных модификацией и траслоцируются в ядро, где они соединяются со специфическими последовательностями ДНК и способствуют транскрипции генов мишеней. В своей основной форме, следовательно, путь состоит их рецептора и рецепторных проксимальных сигнальных адапторных молекул; IKK комплекса; IκB белков; и NF-κB димеров.

Семейство NF-κB транскрипционных факторов состоит из 5 членов p50, p52, p65 (RelA), c-Rel и RelB, кодируемых соотв. NFKB1, NFKB2, RELA, REL, and RELB, которые обладают общим N-терминальным Rel homology domain (RHD), ответственным за связывание ДНК и гомо- и гетеродимеризацию (Figure 2). NF-κB димеры соединяются с κB сайтов промоторов/энхансеров генов мишеней и регулируют транскрипцию путем рекрутирования коактиваторов и корепрессоров. Transcription activation domain (TAD), необходимый для позитивной регуляции генной экспрессии, присутствует только в p65, c-Rel и RelB. Лишенные TADs, p50 и p52 могут репрессировать транскрипцию, пока ассоциируют с TAD-содержащими членами семейства NF-κB или с др. белками, способными к рекрутированию коактиваторов. Конституитивное связывание p50 или p52 гомодимеров с κB сайтами на NF-κB-чувствительных промоторах может, таким образом, действовать, чтобы препятствовать трансактивации NF-κB до тех пор, пока не будут замещены способными к транскрипции NF-κB димерами.

Существенна структурная информация о NF-κB димерах в их неактивной IκB-связанной форме и активном ДНК-связанном состоянии. Кристаллическая структура NF-κB димеров, связанных с κB сайтами, показывает как immunoglobulin-подобные домены, которые представлены RHD, контактируют с ДНК. NH2-терминальный Ig-подобный домен обеспечивает избирательность для определенных типов κB сайтов, тогда как гидрофобные остатки в C-терминальном домене создают интерфейс димеризации между субъединицами NF-κB (Hoffmann et al., 2006). К сожалению, трехмерная структура C-терминального TAD пока не определена, скорее всего из-за неупорядоченной природы белка в этой области. Хотя функции RHD и TAD обычно рассматриваются как независимые, но оба домена подвергаются посттрансляционным модификациям, которые могут влиять на транскрипционную активность, также и на связывание ДНК (Figure 2).

В своем неактивном состоянии димеры NF-κB ассоциированы с одним из трех типичных IκB белков, IκBα (NFKBIA), IκBβ (NFKBIB) или IκB (NFKBIE), или белками предшественниками p100 (NFKB2) и p105 (NFKB1). Эти IκBs поддерживают NF-κB димеры в цитоплазме и являются критическими для восприятия сигналов. Существуют два inducibly экспрессируемых, атипичных IκB белка, Bcl-3 (BCL3) и IκBζ (NFKBZ), которые действуют совершенно по иному в регуляции NF-κB (discussed below). Наконец, альтернативный транскрипт гена NFKB1 у мышей кодирует IκB молекулу, IκBγ, чья биологическая роль остается неясной. Все IκB белки характеризуются присутствием множественных доменов ankyrin повторов (Figure 2). Прототипами и наиболее изученными членами семейства являются IκBα. IκBα, быстро деградирующие во время активации канонических NF-κB сигнальных путей, приводя к высвобождению множественных NF-κB димеров, хотя гетеродимер p65:p50 скорее всего является первичной мишенью IκBα. Установленная модель функции IκB постулирует, что IκBα удерживает NF-κB димеры в цитоплазме, предупреждая тем самым их ядерную транслокацию и последующее связывание с ДНК; однако ситуация в действительности много сложнее. Кристаллическая структура IκBα , связанного с гетеродимером p65/p50 показывает, что белок IκBα маскирует только nuclear localization sequence (NLS) в p65, в то время как NLS у p50 остается экспозированным. Экспозированные NLS у p50 связаны с nuclear export sequences (NES) в IκBα, а p65 ведет к постоянному кругообороту IκBα/NF-κB комплексов между ядром и цитоплазмой, несмотря на локализацию установившегося равновесия, которая является почти исключительно цитозольной (Ghosh et al., 2002). Деградация IκBα резко изменяет динамический баланс между цитозольной и ядерной локализацией NF-κB. Неканонический или альтернативный NF-κB путь, однако осуществляется посредством протеосомного процессинга скорее, нежели деградации, из p100 в p52, при этом высвобождаются p52 содержащие NF-κB димеры, которые управляют транскрипционным ответом, который отличен от того, что индуцируется каноническим, IκBα-регулируемым путем. Частично из-за деградации IκBα процессинг p100 регулирует разные популяции NF-κB димеров, канонического и неканонического NF-κB путей, регулируя самостоятельные наборы генов мишеней. в

Деградация IκB быстро индуцируется сигнальным событием, которое инициируется после специфического фосфорилирования этих молекул с помощью активированных IKK. Комплекс IKK содержит две высоко гомологичные киназные субъединицы, IKKα/IKK1 (CHUK) и IKKβ/IKK2 (IKBKB), и регуляторную субъединицу NEMO (важный модулятор NF-κB)/IKKγ (IKBKG) (Hacker et al., 2006). Хотя они обычно обнаруживаются в гетеромерных киназных комплексах, IKKα and IKKβ , но иногда они избирательно необходимы для специфических NF-κB сигнальных путей. В большинстве канонических передач сигналов NF-κB , напр., стоящих ниже TNFR1, IKKβ они необходимы и достаточны для фосфорилирования IκBα по Ser32 и Ser36 и IκBβ по Ser19 и Ser23. Т.к. они обычно не нужны для фосфорилирования и деградации IκBα в канонических сигнальных путях, то IKKα может обеспечивать фосфорилирование IκBα и, по-видимому, играет критическую роль в канонической NF-κB-зависимой транскрипционной реакции (discussed below). Неканонический путь, напротив, зависит только от субъединицы IKKα, которая действует с помощью фосфорилирования p100 и вызывает его индуцибельный процессинг в p52. Неканонический путь активируется с помощью субнабора членов сверхсемейства TNFR, тогда как канонический путь активируется с помощью более широкого и перекрывающегося набора рецепторов.

Фосфорилирование законсервированных сериновых остатков (DS'GXXS') в IκB белках приводит к их K48-сцепленной polyubiquitination с помощью βTrCP содержащих Skp1-Culin-Roc1/Rbx1/Hrt-1-F-box (SCF) E3 ubiquitin ligase комплексов (SCF&<sup>beta;TrCP</sup>) координированно с E2 UbcH5 (Perkins, 2006). Высвобождаемые NF-κB димеры соединяются с регионами промотора и энхансера, содержащими κB консенсусную последовательность 5' GGGRNWYYCC 3' (N-any base; R-purine; W-adenine или thymine; и Y-pyrimidine) (Hoffmann et al., 2006). Вырожденная природа последовательности сайта κB , которая обнаруживает более значительную изменчивость последовательностей, чем консенсусная последовательность приведенная здесь, в комбинации с варьирующими предпочтениями по связыванию NF-κB димеров и дает в результате большой список NF-κB-регулируемых генов (Gilmore, 2008). Транскрипция генов мишеней далее регулируется за счет посттрансляционных модификаций NF-κB, которые влияют на способность NF-κB димеров взаимодействовать с транскрипционными коактиваторами. NF-κB-зависимая транскрипция IκB белков, также как дополнительные механизмы таргетинга ДНК-связанных NF-κB димеров заканчивают ответ.

Signaling to IKK

Удивительное разнообразие стимулов приводящее к активации NF-κB. Сюда входят как эндогенные, так и экзогенные лиганды, а также множество физических и химических стрессов (Gilmore, 2008). Имеется существенный прогресс в идентификации белковых компонентов путей, которые завершаются активацией IKK , а многие из оставшихся пробелов нашего знания быстро заполняются.

Поразительно, исследования многочисленных сигнальных путей , ведущих к NF-κB продемонстрировали, что большинство сигнальных промежуточных образований, особенно те, что непосредственно выше IKK комплекса являются общими. Передача сигналов к NF-κB осуществляется посредством внутриклеточных адапторных белков, которые предоставляют блочность (modularity) путям активации NF-κB и делают возможной их включение в различные индуцированные рецепторами сигнальные события. Т.о., разнообразные сигнальные пути могут утилизировать некоторые общие компоненты для активирующих и ингибирующих путей. В частности, RIP и TRAF семейства белков играют сходные роли в большинстве путей, которые ведут к активации IKK (Figure 1). Хотя имеются исключения, некоторые из которых, описаны ниже, стало очевидно, что канонические и неканонические пути используют членов семейства TRAF для активации, тогда как только каноническая, NEMO-зависимая передача сигналов типична для IκBs дополнительно нуждается в RIP белках.

Стержневые элементы сигнального пути NF-κB обычно удаляются в несколько ступеней от своих рецепторов. Промежуточные ступени между рецептором и IKK формируют связи с параллельными сигнальными путями. Напр., IL-1R и RIG-I, оба из которых передают сигналы посредством TRAF6 к IKK, осуществляя это через различные рецепторные проксимальные адапторные компоненты MyD88 и MAVS, соотв. (Hacker et al., 2006). Т.о., когда IL-1R связывает IL-1 или RIG-I связывает цитоплазматическую dsRNA, то они активируют перекрывающиеся но уникальные сигнальные пути благодаря своим отличиям по вышестоящим сигнальным компонентам и следовательно, они индуцируют самостоятельные транскрипционные программы. Важно иметь в виду, что хотя отличающиеся вышестоящие события могут вызывать активацию IKK посредством общих механизмов, параллельные сигнальные пути, начинающиеся от неизбыточных рецепторных проксимальных сигнальных компонентов часто формируют взаимодействия, которые меняют форму реакции NF-κB путями, которые уникальны для индивидуальных сигнальных путей.

Одной из удивительных в области передачи сигналов NF-κB является характеристика роли K63-сцепленного или регуляторного убиквитинирования. Эта область исследования начинается с биохимической характеристики TRAF6 как E3 лигаза, которая вместе с E2 лигазой Ubc13/Uev1A может катализировать образование регуляторных цепей ubiquitin и индуцировать активацию IKK in vitro (Deng et al., 2000). Затем были продемонстрированы некоторые сигнальные компоненты, модифицируемые с помощью K63-сцепленной половинки ubiquitin после стимуляции (Chen et al., 2006). Т.к. имеются многочисленные сообщения, демонстрирующие убиквитинирование с помощью K63 различных сигнальных белков, однако по-прежнему отсутствует понимание какова функция регуляторного убиквитинирования во время передачи сигналов. Задержанная кинетика регуляторного убиквитинирования и наблюдение, что оно часто нацелено на очень малую фракцию любого данного белка, даже внтри сигнальных комплексов, указывает на то, что K63 ubiquitination может быть следствием определенных адапторов с E3 лигазной активностью, агрегирующей с др. белками во время передачи сигналов NF-κB. Даже для чрезвычайно сильных и быстро убиквитинируемых адапторов, таких как IRAK1 и MALT1, неясно, происходят ли K63-сцепленная ubiquitination до активации IKK и деградации IκB? (Oeckinghaus et al., 2007, Windheim et al., 2008). Т.к не было четко показано. что K63-связанное убиквитинирование предшествует активации IKK , то остается определить, являются ли эти события внутренне предназначены, чтобы участвовать в передаче сигналов или необходимы для компетентности сигнальных путей, в которых они появляются. Часть доказательств, которая строго подтверждает, что K63 убиквитинирование играет активную роль в передаче сигналов, является существование нескольких deubiquitinases (DUBs), особенно заметна A20, которая обеспечивает негативную обратную связь в путях передачи сигналов NF-κB (Chen et al., 2006). Общепринято, что большинство генетических доказательств и механистических указаний всё ещё необходимо для сосредоточения регуляторной убиквитинации на передаче сигналов NF-κB .

TRAFs-Adapters in Most NF-κB Pathways

TRAFs являются промежуточными продуктами в почти во всех путях передачи сигналов NF-κB; реакция на повреждения ДНК , по-видимому, единственное замеченное исключение (Hacker et al., 2006, Scheidereit, 2006). Существует 7 TRAF белков, которые обладают общим С-терминальным доменом TRAF, состоящим из двойного спирального (coiled-coil) домена, который обеспечивает как гомо- так и гетеротипические межбелковые взаимодействия. Кроме того, TRAFs 2-7 имеют N-терминальные RING finger домены, которые могут функционировать как E3 ubiquitin лигазы, путем катализа переноса ubiquitin на белки мишени - функция, которая была продемонстрирована лучше всего для TRAFs 2 и 6. Среди TRAF белков, TRAF2, TRAF5 и TRAF6 были охарактеризованы наиболее полно как позитивные регуляторы передачи сигналов к NF-κB. Исследования, сфокусированные на роли K63-сцепленного убиквитинирования в передаче сигналов NF-κB в последние 7 лет, установили важную роль TRAF E3 лигазы в активации комплекса IKK ведущей как для канонических, так и неканонических NF-κB путей и продемонстрировали существование K63 ubiquitination из множественных компонентов пути (Chen et al., 2006). Помимо NF-κB, TRAF белки необходимы в некоторых и др. путях, напр., AP-1, и, следовательно, служат в качестве точки ветвления к нижестоящим множественным рецепторам. Хорошо изученные TNFR1 и Toll/IL-1R сигнальные пути предоставляют четкие доказательства функции TRAF белков в активации IKK (Hacker et al., 2006, Hayden et al., 2006).

После связывания TNFα, TRAF2 рекрутируется на TNFR1 за счет его взаимодействия с TRADD (Hsu et al., 1996). Однако, несмотря на недостаточность активации AP-1, TRAF2-дефицитные клетки имеют относительно интактную передачу сигналов TNF к NF-κB (Yeh et al., 1997). TRAF5 также взаимодействует с TNFR1 сигнальным комплексом, однако TRAF5 нокауты обладают также нормальной активацией NF-κB с помощью TNF; TRAF2/5 двойные нокаутные клетки, однако дефектны по активации IKK (Nakano et al., 1999, Tada et al., 2001, Yeh et al., 1997). Т.к. E3 лигазная активность TRAF2 , как полагают, необходима для активации IKK, но существует несколько предостережений этому предположению. Во-первых, делеция RING finger домена устраняет способность TRAF2 рекрутировать IKK в рецепторный комплекс, что затрудняет оценку важности TRAF2 E3-лигазной активности независимо от функции адаптора в активации NF-κB (Devin et al., 2000). Во-вторых, нокдаун K63-специфической E2 лигазы Ubc13 блокирует TRAF2 autoubiquitination, но не активацию NF-κB, тогда как ubc13-/- макрофаги обнаруживают сходное отсутствие эффекта на активацию NF-κB (Habelhah et al., 2004, Yamamoto et al., 2006). Интересно, что др. группа наблюдала частичные дефекты передачи сигналов TNF к NF-κB у ubc13+/- гетерозиготных макрофагов и splenocytes (Fukushima et al., 2007). Следовательно, передача сигналов TNFR1 для функции TRAF2 ubiquitin лигазной активности остается более или менее установленной. Можно с уверенностью заключит, что TRAF2 и TRAF5 вместе необходимы для активации NF-κB с помощью TNFR1.

В передаче сигналов Toll/IL-1 TRAF6 рекрутируется в рецепторный комплекс и необходим для MyD88-зависимой активации NF-κB с помощью IL-1 и лигандов TLR4 (Hacker et al., 2006, Hayden et al., 2006). Однако подобно TRAF2, значение E3-лигазной активности TRAF6 остается спорным. Восстановление TRAF6-дефицитных клеток у TRAF6 мутантов, лишенных signature мотива у E3 RING-finger лигазы - т.е., самого RING finger - осуществляется полностью с помощью IL-1-индуцированной активации NF-κB. но не активации JNK (Kobayashi et al., 2001). Недавно, однако , было показано, что точковая мутация в ring finger у TRAF6 неспособна к восстановлению активации NF-κB в TRAF6 нокаутных клетках (Lamothe et al., 2007). Следовательно, роль активности TRAF6 E3 теперь определенно установлена. Делеция Ubc13, сходным образом дает противоречивые результаты. Ubc13 нокауты неспособны обнаруживать достоверные дефекты в TRAF6-обеспечиваемой активации NF-κB нижестоящих LPS, IL-1, CD40 или BAFF, несмотря на нарушение активации MAPK (Yamamoto et al., 2006). Гетерозиготные спленоциты и макрофаги, однако, обнаруживают легкие дефекты в LPS-индуцированной IκBα деградации, менее тяжелые, чем при потере p38 фосфорилирования, и у этих мышей передача сигналов BCR к NF-κB, по-видимому, не изменена (Fukushima et al., 2007). В передаче сигналов T клеточных рецепторов условное устранение Ubc13 ведет к частичной, но достоверной редукции активации NF-κB, хотя активация JNK и TAK1 нарушена тяжелее (Yamamoto et al., 2006). Следовательно, возможно слишком рано делать определенные заключения о генеральной роли TRAF/Ubc13-обеспечиваемой убиквитинации в активации IKK.

Помимо TRAF2 и TRAF6, ubiquitin лигазная активность TRAF3 была описана, как регулирующая сигнальные NF-κB пути. Неканонический путь NF-κB характеризуется превращением p100 в p52 и его независимостью от IKKβ и NEMO. Вместо этого участвует альтернативный путь активации IKKα с помощью NF-κB-inducing kinase (NIK) (Hacker et al., 2006, Scheidereit, 2006). TRAF3, который взаимодействует с рецепторами, которые запускают альтернативный путь (Hauer et al., 2005), также взаимодействует с NIK и теперь стало ясно, что активация NIK негативно регулируется с помощью TRAF3. В покоящемся состоянии, TRAF3 индуцирует NIK ubiquitination и деградацию, но после стимуляции TRAF3 подвергается сигнал-зависимой деградации, обеспечиваемой др. членами семейства TRAF, вследствие чего происходит накопление и активация NIK и последующая активация неканонического пути (Liao et al., 2004). Недавно эта негативная роль TRAF3 была продемонстрирована генетически путем устранения летальности TRAF3-дефицитных мышей путем делеции гена p100 (He et al., 2006). Остается неясным, как альтернативный путь, передающий сигналы посредством деградации TRAF3, может влиять на способность TRAF3 выполнять его аддитивную роль в качестве ключевого медиатора TLR-индуцированных ответов на type I interferon (Hacker et al., 2006, Oganesyan et al., 2006).

Т.о., TRAF белки, по-видимому, играют критическую роль в индуцированной рецепторами активации IKK как в каноническом, так и неканоническом путях. Остается неясным могут ли они действовать первоначально как катализаторы K63-сцепленной ubiquitination или как адапторные белки. TRAF белки могут непосредственно рекрутировать комплекс IKK посредством связывания IKKα или IKKβ (Devin et al., 2001), хотя для большинства сигнальных путей описаны дополнительные механизмы рекрутирования IKK. Напр., при передаче сигналов антигенных рецепторов IKK может быть рекрутирован посредством взаимодействия с членами семейства PKC, тогда как при передаче сигналов TNFR1, IKK может быть рекрутирован на рецепторный комплекс посредством RIP1 kinase. Ключевыми остаются вопросы механизма(ов), с помощью которого TRAF белки вносят вклад в активацию IKK, особенно в связи с RIP белками, и их вкладов в NF-κB пути, в которых их роль пока не установлена с определенностью.

RIPs-Key Adapters in Canonical NF-κB Signaling

Receptor-interacting proteins (RIPs) , по-видимому, действуют как выше, так и с TRAF белками. чтобы активировать IKK. RIP белки действуют ка к настоящие адапторы в сигнальных путях NF-κB путем взаимодействия с вышестоящими сигнальными кассетами посредством хорошо охарактеризованных белок-связывающих доменов и рекрутирования IKK комплекса посредством связывания NEMO. Члены семейства RIP участвуют в большинства TRAF-зависимых путей, напр., передаче сигналов от TNFR сверхсемейства и Toll/IL-1R. Кроме того, существуют также несколько путей, в которых члены семейства RIP являются важными, хотя потребность для TRAFs менее ясна. Эти пути активации RIP-зависимой/TRAF-независимой IKKβ могут включать передачу сигналов антигенных рецепторов также как и передачу сигналов в ответ на повреждения ДНК. Существуют семь RIP family kinases , которые характеризуются своими консервативными serine/threonine киназными доменами (Meylan et al., 2005). RIP1 и RIP3 также обладают общим RIP homotypic interaction motif (RHIM). RIP1 обладает death domain (DD), который обеспечивает взаимодействие с др. death domain-содержащими адапторами и рецепторами. RIP3 , как полагают, действует скоординировано с RIP1, посредством RHIM-обеспечиваемых взаимодействий; однако большинство NF-κB сигнальных путей функционируют нормально в отсутствие RIP3 (Newton et al., 2004). IВместо этого RIP3 может взаимодействовать с и репрессировать RIP1-индуцированную активацию NF-κB в специфических примерах (Meylan et al., 2004). RIP2 содержит C-terminal caspase activation and recruitment domain (CARD), который скорее всего обеспечивает взаимодействия с определенными рецепторами и адапторами. Члены семейства RIP участвуют в канонических сигнальных NF-κB путях, где они, по-видимому, вызывают TRAF-независимое рекрутирование IKK комплекса за счет непосредственного взаимодействия с NEMO. Благодаря киназной активности RIP1 и RIP2, как было установлено, безразличны для некоторых путей активации NF-κB, считается, что RIPs могут действовать как адапторы и каркасы для облегчения TRAF-индуцируемой активации IKK (Lee et al., 2004, McCarthy et al., 1998). Подобно TRAFs, путь пердачи сигналов TNFR1 служит в качестве модели функции RIP в активации NF-κB .

RIP1 связывается с NEMO и имеет важное значение для TNFα-индуцированной активации IKK и NF-κB (Hsu et al., 1996, Kelliher et al., 1998, Ting et al., 1996, Zhang et al., 2000). В отсутствие RIP1, рекрутирование IKK происходит посредством TRAF2, но не ведет к активации IKK (Devin et al., 2001). Т.о., RIP1 играет роль, которая выходит за рамки простого рекрутирования комплекса IKK. Хотя типичный каскад фосфорилирования может предусматривать механизм обжалования действий RIP, но неожиданно, как было установлено, активность RIP1 kinase необязательна для активации IKK (Lee et al., 2004). RIP1 может вместо запуска (nucleate) сборки сигнального комплекса, который индуцирует активацию IKK посредством олигомеризации NEMO и последующее аутофосфорилирование IKK (Delhase et al., 1999). Недавние сообщения указывают на то, что это событие может служить в качестве примера роли регуляторного убиквитинирования в передаче сигналов. RIP1 является inducibly убиквитинированным с помощью TRAF2 в результате стимуляции TNFα и.как сообщалось, мутации акцепторных lysines в RIP1 аннулируют связывание NEMO и активацию IKK (Ea et al., 2006, Li et al., 2006). Тщательный анализ этих данных, однако, предполагает, что RIP1 мутанты акцепторов лизина не способны ubiquitinated, также не ассоциируют с TNFR1, тем самым делая роль убиквитинирования RIP1 непонятной (Ea et al., 2006). Более того, что TNFα-индуцированное убиквитинирование RIP1, по-видимому, устраняется в traf2-/- клетках, TNFα-индуцированная активация IKK остается частично нетронутой (Lee et al., 2004). В передаче сигналов TNFR1, следовательно, существует явная потребность в действии RIP1 в качестве адапторного белка, способствующего рекрутированию и активации IKK, хотя механизм, с помощью которого достигается активация

В дополнение к передаче сигналов TNFR1 и активации IKK посредством др. death домен-содержащих членов семейства TNFR, RIP1, как было описано, необходим также для TRIF-зависимой активации NF-κB посредством TLR3 и TLR4, также как и для активации NF-κB посредством RIG-I (Cusson-Hermance et al., 2005, Meylan et al., 2004). Более того, RIP1 необходим для индуцированной повреждениями ДНК активации IKK посредством PIDDosome (Hur et al., 2003, Janssens et al., 2005). Интересно, что RIP1 не требуется для активации неканонического пути посредством CD40 или LTβR (Vivarelli et al., 2004). Следовательно, RIP1, по-видимому, необходим для активации субнабора канонических, но не noncanonical, NF-κB сигнальных путей. Регуляция NIK непосредственно с помощью TRAFs и связывания NEMO с помощью RIP1 согласуется с тем, что RIP белки не участвуют в неканонической передаче сигналов.

Помимо RIP1, RIP2 широко используется в сигнальных путях к NF-κB. RIP2 содержит C-терминальный CARD, мотив гомотипического взаимодействия, который делает возможной функцию RIP2 в разных наборах сигнальных путей NF-κB. Сигнальные пути рецепторов антигенов проливают существенный свет на роль CARDs в активации NF-κB. Как BCL10, так и CARD11 (CARMA1) являются CARD-содержащими белками, которые являются критическими для IKK активации нижестоящих или Т-клеточных или В-клеточных рецепторов антигенов. Наиболее примечательной особенностью комплекса BCL10, CARD11, MALT1 (CBM) является индуцированная им олигомеризация вследствие передачи сигналов, которая. как полагают, является ключевым событием IKK активации этих нижестоящих CARD-содержащих адапторных белков (Schulze-Luehrmann et al., 2006). RIP2, по-видимому, необходим для BCL10-обеспечиваемой передачи сигналов NF-κB (Ruefli-Brasse et al., 2004). Действуют ли рецепторы антигенов также посредством белков семейства TRAF, чтобы передавать сигналы к NF-κB, пока ещё не показано убедительно. TRAF6, вообще-то частично комплементирующий с TRAF2, скорее всего является нижестоящим TRAF по отношению к CBM комплексу; но это пока спорно (Scheidereit, 2006, Schulze-Luehrmann et al.,

Члены семейства NOD-LRR рецепторы распознавания внутриклеточного паттерна являются CARD-содержащими белками, которые могут активировать IKKβ посредством RIP2. RIP2 соединяется с NEMO и, как полагают, непосредственно обеспечивает активацию комплекса IKK с помощью proximity-induced механизмов (Inohara et al., 2000). Однако, недавние результаты указывают на то, что RIP2 действует с TAK1 и TRAFs, чтобы индуцировать убиквитинирование NEMO и нижестоящие сигнальные пути (Abbott et al., 2007, Kim et al., 2008). Подобно RIP1, киназная активность RIP2 по-видимому, не нужна и RIP2 также убиквитинируется посредством действия Ubc13/TRAF6 (Hasegawa et al., 2007, Park et al., 2007, Yang et al., 2007). Роль белков TRAF окончательно не установлена в NOD-LRR-обусловленной активации NF-κB. Вполне возможно, что путаница по этому вопросу может быть результатом различных членов семейства TRAF, TRAF2, 5 и 6, обладающих перекрывающейся или компенсационной функцией, аналогичные ситуации наблюдаются для TRAF2 и TRAF5 в передаче сигналов TNFR1 (Abbott et al., 2007, Hasegawa et

Т.о., RIP белки, RIP1 в качестве DD к NEMO адаптору и RIP2 в качестве CARD к NEMO адаптору, по-видимому, играют аналогичную роль в некоторых канонических путях активации NF-κB. RIP белки рекрутируют IKK комплекс посредством связывания с NEMO и могут обеспечивать активацию комплекса путем непосредственной олигомеризации или ubiquitin-зависимых механизмов. Вносят ли непосредственный вклад TRAF белки в эту функцию RIP посредством убиквитинирования или осуществляют это косвенно, пока неясно, хотя это станет ясно с идентификацией ключевой роли TAK1 в большинстве RIP-зависимых NF-κB путей.

TAK1/NIK-IKK Kinases?

Передача сигналов к, стоящим ниже IKK, RIPs и TRAFs зависит от нескольких киназ, которые участвуют в путях передачи сигналов NF-κB. В случае канонического NF-κB пути эта роль в основном выполняется с помощью TAK1 (TGFβ-activated kinase-1) (Sato et al., 2005, Shim et al., 2005). В неканоническом пути вместо этого используется NIK для активации IKKα и фосфорилирования p100 (Senftleben et al., 2001, Xiao et al., 2001). Действуют ли NIK и TAK1 аналогично один другому, т.е. являются предположительно IKK kinases (IKK-Ks), вопрос дискуссионный. Несмотря на четкую потребность в TAK1 во множественных сигнальных путях к IKK, механизм действия TAK1 в передаче сигналов к NF-κB остается неясным. Во-первых, генетическое устранение TAK1 выявляет варьирующие недостатки активации NF-κB в разных канонических сигнальных путях. Передача сигналов TNFR1 к NF-κB , по-видимому, полностью устранена, тогда как эффект передачи рецепторов антигенов более спорный (Liu et al., 2006, Sato et al., 2005, Wan et al., 2006). Во-вторых, служит ли TAK1 непосредственно в IKK-K или обеспечивает активацию посредством промежуточных киназ, MEKK3 напр., пока неясно (Blonska et al., 2005, Li et al., 2006). В-третьих, даже посредством путей, запускаемых с помощью LTβR, ведущих к IKK посредством многих из одних и тех же сигнальных промежуточных звеньев, этот путь не зависит от TAK1 (Shim et al., 2005). Вместо этого кажется, что TAK1 в целом функционирует в путях. которые также нуждаются в RIP для активации IKK. В самом деле, RIP может быть ответственным за рекрутирование TAK1 (Blonska et al., 2005). TAK1 участвует как в путях передачи сигналов рецепторов антигенов, так и NOD, ни один из которых, по-видимому, не зависит с определенностью от TRAF белков, хотя существуют указания на то, что это скорее всего имеет место (Abbott et al., 2007, Hasegawa et al., 2007, Sun et al., 2004). Альтернативно, могут существовать некоторые пути, которые передают сигналы независимо от RIPs, которые. кстати, включают большинство неканонических путей, могут активировать IKK без TAK1. Напротив, NIK могут активировать неканонический путь в отсутствие RIP белков.

NIK непосредственно фосфорилирует и активирует IKKα и эта модель подтверждается анализом NIK-/- и aly/aly мышей, которые несут инактивирующие точковые мутации в NIK kinase (Hacker et al., 2006). Регуляция NIK контролируется с помощью комбинированного действия TRAF белков, как обсуждалось выше. В дополнение к TRAF3, cIAP1 и cIAP2 участвуют в качестве E3 лигаз. ответственных за регуляцию постоянных уровней NIK levels (Petersen et al., 2007, Varfolomeev et al., 2007, Vince et al., 2007). Деградация cIAP, расположенная ниже неканонических стимулов, может функционировать подобно деградации TRAF3, в ведущей к накоплению активации NIK и IKKα (Varfolomeev et al., 2007). Однако, механизм регуляции cIAP вследствие лигатирования рецепторов нуждается в дальнейшей характеристике.

Итак, немногие общие сигнальные компоненты обеспечивают активацию IKK в большинстве условий. В неканоническом пути, TRAF и NIK достаточны для активации IKKα NEMO-незвисимым способом. Однако, канонический путь, по-видимому, более сложен. В целом каноническая передача сигналов связана как с TRAF, так и с RIP белками, а также с киназой TAK1, хотя в определенных путях могут функционировать и др. белки, напр., IRAK1, может действовать аналогично RIP. Очевидно, что ключом к этим различиям скорее всего является связывание RIP, или аналогичных белков с NEMO, т.к. оба эти компонента могут быть универсально необходимы для канонической активации NF-κB. Позволяет ли это взаимодействие TAK1 или др. киназам фосфорилировать IKK или способствует IKK transautophosphorylation, остается предметом будущих дебатов. Если отсутствует IKK-K в канонических путях, то точную функцию TAK1 в активации IKK ещё предстоит определить.

Organization and Activation of the IKK Complex

Хотя описаны исключения, в целом принято, что активация NF-κB нуждается в активации или IKKα или IKKβ. Отсюда следует, что понимание регуляции активности IKK является центральным для понимания активации NF-κB. Несмотря на важность IKK, основные пробелы в нашем знании остаются в отношении биохимии IKK комплекса. Однако, некоторые недавние успехи указывают на то, что эта область на пороге важных прорывов в понимание механизмов

IκB kinase впервые была очищена как basally активный высокого молекулярного веса комплекс, фосфорилирующий серины 32 и 36 в IκBα (Chen et al., 1996). зависимая от стимулов активность киназы была последовательно идентифицирована несколькими группами и было установлено, что она состоит из двух каталитических киназных субъединиц, IKKα (IKK1) и IKKβ (IKK2) и регуляторной субъединицы NEMO (IKKγ) (DiDonato et al., 1997, Mercurio et al., 1997, Rothwarf et al., 1998, Woronicz et al., 1997, Yamaoka et al., 1998, Zandi et al., 1997, Regnier et al., 1997). IKKα и IKKβ, вместе с IKKi (IKKε) и TBK1, представляют собой семейство IKK белков. IKKα и IKKβ обладают 52% общих идентичных последовательностей с более существенной степенью сходства в каталитическом домене (65%). NEMO является белков м 48 kDa, который не родственен IKKα и IKKβ и содержит С-терминальный Zn finger-подобный домен, лейциновую застежку и N-терминальный и С-терминалный coiled-coil домены (Figure 2).

Целенаправленное разрушение каждого из IKK генов, также как трансгенные и условно нокаутированные животные, были получены и изучены (Gerondakis et al., 2006, Pasparakis et al., 2006). Первоначальное сходство между фенотипами IKKβ нокаутов и p65 нокаутов говорило за центральную роль IKKβ в активации p65 димеров посредством фосфорилирования IκBα. Мыши, дефицитные по IKK?α переживали эмбриональное развитие, но погибали перинатально из-за множественных морфологических дефектов, в частности из-за абортированного развития эпидермиса и скелета. Первоначально казалось, что IKKα несущественна для классической активации NF-κB, но последующие сообщения выявили потребность в IKKα во многих неканонических NF-κB сигнальных путях и вообще-то в некоторых канонических сигнальных путях тоже (Solt et al., 2007, Takaesu et al., 2003). Более того, как будет рассмотрено ниже, не нужная для деградации IκBα во всех путях, IKKα скорее всего играет роль в NF-κB-зависимой экспрессии генов в канонических сигнальных путях. NEMO необходим для передачи сигналов во всех канонических NF-κB путях, а NEMO-дефицитные мыши также погибают в эмбриогенезе из-за массивного апоптоза гепатоцитов. NEMO-дефицитные клетки обнаруживают более тяжелую и широкую потерю активации NF-κB, чем IKKβ нокаутные клетки, демонстрируя тем самым, что некоторые канонические пути остаются интактными в отсутствие IKKβ (Schmidt-Supprian et al., 2000, Solt et al., 2007). Следовательно, более приличествует распределять по категориям пути NF-κB как канонические и неканонические, базируясь на потребности в NEMO или в специфическом IκB белке, который фосфорилируется и деградирует/превращается, напр., IκBα, IκBβ, и IκBε для канонического и p100 для неканонического, скорее, чем на потребности в IKKα or IKKβ.

The IKK Complex

Многие линии доказательств подчеркивают, что IKK киназный комплекс, который состоит только из IKKα, IKKβ и NEMO. Рекомбинантный NEMO плюс или IKKα или IKKβ собирается в комплекс с предполагаемым мол. весом, который сходен с очищенным комплексом (Krappmann et al., 2000, Miller et al., 2001). NEMO имеет крупные радиус Stoke's in vitro и поэтому NEMO тримеры с предсказуемым молекулярным весом 150,000 элюируются при кажущемся мол. весе в 550 kDa после гель-фильтрации (Agou et al., 2004). Однако необходимо посмотреть, собирается ли NEMO в ансамбль с IKK in vivo , обладающий сходным расхождением между предполагаемым и действительным мол. весом. Альтернативно, это расхождение может просто отражать IKKα/β/NEMO комплекс при стоихометрии высшего порядка. Рекомбинантный NEMO и IKKβ, по-видимому, ассоциируют в молярном отношении 2:2 и домены минимального взаимодействия формируют димер из димеров (тетрамер) , который дальше может собираться в октамеры и додекамеры (Drew et al., 2007). Эти ансамбли высокого порядка легко достигают мол. веса эндогенного комплекса. Следовательно, дополнительные субъединицы скорее всего не присутствуют в активном IKK комплексе, и они не нужны для объяснения большого кажущегося мол. веса комплекса. Вместо этого, базируясь на существующих биохимических доказательствах и наших собственных неопубликованных наблюдениях, становится очевидным, что описанные белки, чтобы ассоциировать с IKK комплексом ведут себя так преходяще и/или субстоихометрическим способом и не отражают дополнительных bona fide компонентов IKK комплекса. Поэтому мы ограничим нашу дискуссию, что IKK комплекс в основном состоит из стержневых IKK компонентов IKKα, IKKβ и NEMO. в

IKKα и IKKβ димеризуются посредством домена лейциновых застежек, который также необходим для киназной активности (Mercurio et al., 1997, Woronicz et al., 1997, Zandi et al., 1997). Кажется, что IKKα и IKK?β преимущественно формируют гетеродимеры in vivo и in vitro , но исследования показывают, что IKKα/IKKβ гетеродимеры обладают более высокой каталитической эффективностью, чем любой из гомодимеров (Huynh et al., 2000). Т.к. и IKKα и IKKβ гомодимеризуются в клетках, лишенных IKKβ или IKKα, соотв., имеется мало доказательств, что гомодимеры формируются в нормальных условиях. Исключение составляют описания IKKβ/IKKβ/NEMO комплексов в T клетках и IKKβ-только комплексов в TNFα-стимулируемых HeLa клетках (Khoshnan et al., 1999, Mercurio et al., 1999). Интересно, что T клетки были описаны, как экспрессирующие укороченные IKKα изоформы, лишенные лейциновых застежек, которые д. преимущественно способствовать формированию гомодимеров IKKβ (McKenzie et al., 2000). Кроме того, несмотря на отсутствие твердых доказательств, всё ещё общераспространено мнение, что IKKα гомодимеры, которые не связаны с NEMO, существуют in vivo , поскольку неканонический путь может действовать в отсутствие IKKβ или NEMO (Senftleben et al., 2001). в

IKKα и IKKβ соединяются с NEMO посредством С-терминального гексапептида NEMO-binding domain (NBD) (Leu-Asp-Trp-Ser-Trp-Leu) (May et al., 2000, May et al., 2002) (Figure 2). NEMO соединяется с IKKs, нуждаясь в минимум остатков 47-80, локализованных внутри первого coiled-coil мотива (Drew et al., 2007, Marienfeld et al., 2006, May et al., 2002). Эксперименты по конкуренции и биофизический анализ использования NBD пептида показывают, что IKKβ соединяется с NEMO со значительно более высоким сродством, чем IKK? (May et al., 2002 and unpublished data). Более того, IKK?α менее чувствительна к мутациям из двух остатков внутри NBD (Asp749 и Trp742), которые устраняют связывание IKKβ с NEMO, указывая тем самым, что связывание IKK?α менее строго. Различия в NEMO-связывающем сродстве может быть критическим для понимания различий в IKKα и IKKβ функции in vivo т.к. перестановка IKKα и IKKβ C концов дает IKKα, который обладает IKKβ-подобным поведением (Kwak et al., 2000). Более того, т.к. IKKα , лишенные лейциновой застежки, HLH домена и NBD, активны после избыточной экспрессии, точно также делеции устраняют активность IKKβ (McKenzie et al., 2000). Следовательно, C-терминальная область IKK, которая обеспечивает как связывание, так и димеризацию NEMO влияет на киназную активность и избирательность.

Хотя стержневой IKK комплекс наиболее вероятно состоит только из IKKα/IKKβ/NEMO, существуют два хорошо охарактеризованные взаимодействия, которые заслуживают обсуждения. Первый - это киназный хаперон HSP-90/Cdc37, который, как сообщалось, постоянно ассоциирует с IKK комплексом. HSP-90 ингибитор geldanamycin, как было показано, ингибирует активацию IKK с помощью TNF-α (Chen et al., 2002). Однако , HSP-90 ассоциирует также со множественными киназами, которые участвуют в NF-κB пути (Ghosh et al., 2002). Недавно было показано, что это скорее, чем существование в качестве компонента IKK комплекса per se, HSP-90 вместо этого рекрутируется с помощью Cdc37 на IKK, где он действует как хаперон во время сборки IKK комплекса, или во время его восстановления после передачи сигнала (Hinz et al., 2007). Второй взаимодействующий белок, который необходим, это ELKS, который, ка было предположено, является регуляторным компонентом IKK комплекса в дополнение к NEMO (Ducut Sigala et al., 2004). Поскольку исследования по RNAi нокдауну подтверждают роль ELKS в активации IKK , а анализ иммунодеплеции указывает на то, что ELKS является стоихометрическим компонентом комплекса IKK, но важность ELKS в функционировании IKK не была подтверждена генетически, а его регуляция ещё не охарактеризована детально (Ducut Sigala et al., 2004).

Activation of IKK

Активация комплекса IKK нуждается в фосфорилировании серинов T петли, по крайней мере, одной из субъединиц IKK subunits. Однако механизм, с помощью которого происходит это фосфорилирование, остается неясным. Активная IKKβ , фосфорилированная по двум серинам , Ser177 и Ser181, внутри активационной петли киназного домена, и IKKα сходным образом фосфорилиована по сериновым остаткам активационной петли 176 и 180. Мутация серинов активационной петли на glutamic кислоту дает конституитивно активную IKK, тогда как мутация в аланине устраняет чувствительность к сигналу (Hacker et al., 2006). Как регулируется ферментативная активность с помощью фосфорилировани этих серинов, может предположить, исходя из сравнения с др. киназами, но окончательно это станет ясно с выяснением кристаллической структуры комплекса IKK, которая пока неуловима. Независимо от точных конформационных изменений, индуцируемых этими ключевыми событиями фосфорилирования, остается фундаментальный вопрос, происходит ли фосфорилирование IKK с помощью transautophosphorylation или посредством фосфорилирования с помощью вышестоящей кинахзы (IKK-K).

Имеется несколько линий доказательств, которые могут быть использованы в подтверждение или IKK-K или transautophosphorylation механизмов: фактически, до некоторой степени могут быть использованы для подтверждения обе модели. Одним из общих элементов в активации IKK является потребность в членах семейства TRAF и индуцированная олигомеризация TRAFs вследствие передачи сигналов. Эта общность подчеркивает важность сборки комплексов signalosomes для активации IKK. Далее, олигомеризация является универсальной даже, когда TRAFs могут быть необязательны. При передаче сигналов AgR собирается также комплекс CBM в олигомер высшего порядка вследствие передачи сигналов (Schulze-Luehrmann et al., 2006). Т.о., очевидно, что все канонические NF-κB сигнальные пути ведут к сборке крупных кластеров сигнальных компонентов непосредственно выше IKK. Олигомеризация RIP белков, RIP1 стоящий ниже TRAFs и RIP2 стоящий ниже CARD-содержащих адапторов, могут также предоставлять каркас для олигомеризации комплексов IKK (Inohara et al., 2000). Сборка этих сигнальных комплексов указывает на то, что активация IKK может происходить посредством индуцированной proximity модели transautophosphorylation; однако также возможно, что эти же самые сигналосомы могут в то же самое время обеспечивать позицию IKK вблизи IKK-K.

С-терминальная область NEMO обеспечивает активацию IKK и взаимодействие с вышестоящими сигнальными адапторами, в то время как NEMO N конец ответственен за взаимодействие с IKKs (Makris et al., 2002, Rothwarf et al., 1998). Индуцибельная олигомеризация NEMO обеспечивается за счет RIP1 и, как полагают, активирует IKK, а искусственно форсированная олигомеризация NEMO ведет к активации IKK, тем самым подтверждая эту гипотезу (Inohara et al., 2000, Poyet et al., 2000). Как обсуждалось выше, NEMO может формировать тетрамеры in vitro и как сообщалось олигомеризуется in vivo, хотя стоихометрия эндогенного NEMO дискуссионна (Agou et al., 2004, Drew et al., 2007, Tegethoff et al., 2003). Несмотря на это, мутационные последовательности, необходимые для наблюдаемой олигомеризации, ведут к потере активности IKK, как и избыточная экспрессия только домена олигомеризации (Agou et al., 2004, Tegethoff et al., 2003). Без структурной информации трудно понять, как олигомеризация NEMO может вызывать активацию IKK; однако три недавних публикации проливают некоторый свет на механизм активации IKK (Marienfeld et al., 2006, Palkowitsch et al., 2008, Schomer-Miller et al., 2006).

Возможно, что олигомеризация NEMO необходима для transautophosphorylation серинов IKK T петли или даже для экспозиции серинов T петли для IKK-K. В самом деле, киназная активность дикого типа IKKβ , проявляющаяся в дрожжах увеличивается с помощью ко-экспрессии NEMO; однако активность IKK, в которой серины Т петли были мутированы на глютаминовую кислоту, высокая и неизменная при ко-экспрессии NEMO (Schomer-Miller et al., 2006). Следовательно, повышение киназной активности IKK с помощью NEMO скорее всего возникает благодаря облегчению фосфорилирования IKK T петли. Способность к воссозданию этого процесса у дрожжей строго подтверждает, что transautophosphorylation происходит как результат образования спонтанных структур высшего порядка NEMO и IKK, которые обладают кажущейся молекулярной массой, сходной с той, что у активированных IKK (Miller et al., 2001). Transautophosphorylation согласуется также с известной зависимостью димеризации IKK для активации IKK. Устранение образования гомо- и гетеродимеров за счет делеции или мутации IKK домена лейциновой застежки также блокирует активацию избыточно экспрессируемых IKKs (McKenzie et al., 2000, Tang et al., 2003, Zandi et al., 1997). Однако киназная активность может быть восстановлена путем форсированной олигомеризации IKK при использовании не имеющего отношения к делу интерфейса димеризации (Tang et al., 2003). Кроме того, активная по киназе IKKβ способна к transautophosphorylation kinase-dead IKKβ, и эта активация нуждается в зависимой от лейциновой застежки димеризации или в искусственно форсированной олигомеризации (Tang et al., 2003). Интересно, что фосфорилирование IKK NBD серинового остатка (Ser740) ингибирует активность IKK и предупреждает увеличение рекомбинантной активности IKK за счет ко-экспрессии NEMO (May et al., 2002, Schomer-Miller et al., 2006). IKK, лишенная NBD, с др. стороны, обладает постоянной активностью в отсутствие стимуляции (May et al., 2002). Т.к. IKK, содержащая Ser740, мутировавший в Ala, продолжает взаимодействовать с NEMO, то эти данные указывают на то, что природа NBD/NEMO взаимодействия важна для NEMO-опосредуемой активации IKK (May et al., 2002, Schomer-Miller et al., 2006). В дополнение к лежащей в основе индуцированной стимулами олигомеризации, NEMO постоянно образует стабильные димеры и как димеризация, так и связывание IKK независимо необходимы для активации NF-κB (Marienfeld et al., 2006). В то время как избыточная экспрессия димеризации NEMO и один только домен взаимодействия IKK (aa 1-197) может активировать IKK, одинаково с эффектом С-терминальной части, содержащей minimal oligomerization domain (MOD) (179-419), ни одна из конструкций не облегчает активацию IKK в отсутствие полной длины (FL) NEMO (Marienfeld et al., 2006).

Однако это взаимодействие может быть важным механизмом регуляции негативной петли обратной связи. NEMO становится фосфорилированным по Ser68 внутри домена IKK-связывания после стимуляции. Это фосфорилирование происходит стимул-зависимым образом и индуцирует разрушение димеров NEMO и взаимодействие между IKK и NEMO, приводя тем самым к завершению сигнализации (Palkowitsch et al., 2008). Это разделение IKK и NEMO в дальнейшем усиливается за счет фосфорилирования IKK NBD (Palkowitsch et al., 2008). Эти индуцированные конформационные изменения могут затем позволять распознавание с помощью HSP-90 kinase chaperone комплекса или предполагаемого IKK комплекса фосфатаз, приводя к результате к восстановлению компетентного к передаче сигналов IKK комплекса посредством или функции HSP-90 хаперона или дефосфорилирования NEMO по Ser68.

Базируясь на этих находках предложена следующая модель активации IKK (Figure 3). В покоящемся состоянии в (NEMO2IKKα1IKKβ1)2 комплексах, IKKs сохраняются неактивными в течение их взаимодействия с NEMO. После стимуляции, NEMO соединяется с RIP белком, вообще-то ubiquitin-зависимым способом, это индуцирует конформационные изменение, которое делает возможным transautophosphorylation или IKK-K фосфорилирование остатков серина IKK T петли. Активные IKK затем фосфорилируют как нижестоящие субстраты, такие как IκBs, также как и Ser740 в IKKβ и Ser68 в NEMO. Эти события фосфорилирования открывают комплекс, открывающий доступ фосфатазам, которые путем дефосфорилирования серинов IKK T петли вызывает прекращение киназной активности. Хапероновая активность HSP-90 и дефосфорилирование Ser740 в IKKβ могут быть необходимы для преодоления высокого сродства взаимодействия IKKβ NBD-NEMO. Низкое сродство IKKα NBD для NEMO может делать активным IKKα, чтобы выйти из фосфорилированных по Ser68 NEMO/IKK комплексов и далее увеличить активацию NF-κB за счет фосфорилирования дополнительных нижестоящих мишеней.

Олигомеризация, по-видимому, является общей темой в преедаче сигналов к NF-κB. Многие сообщения описывают олигомеризацию TRAF белков во множественных путях, которые предают сигналы к NF-κB. RIP белки, которые существенны для канонических путей, также образуют в определенной степени структуры высшего порядка, скорее всего, как результат агрегации комплексов из рецепторов и/или адапторов. Более того, в определенных путях, таких как NOD-LRRs, олигомеризация рецепторов и RIP особенно хорошо охарактеризованы (Inohara et al., 2003). RIP взаимодействие с NEMO может быть таким образом предсказано по непосредственной индукции образования кластеров IKK комплексов. RIP также быстро убиквитинируется вследствие TNFα стимуляции и было предположено, что это осуществляется посредством посттрансляционной модификации, которая связывает RIP1 с NEMO (Wu et al., 2006). Если это действительно так, то тогда одиночная молекула RIP или убиквитинированные TRAF, IRAK-1 или MALT1 могут предоставлять олигомерный ubiquitin каркас, обеспечивающий олигомеризацию или конформационные изменения в IKK комплексе. Анализ взаимодействия осложняется перекрыванием последовательностей между доменом олигомеризации NEMO и NEMO K63-ubiquitin-binding domain (UBD). В дополнение к RIP, NEMO также убиквитинируется во множественных NF-κB путях. K63-сцепленное убиквитинирование NEMO вообще-то было продемонстрировано значительно четче в передаче сигналов AgR, где было показано, что мутация одиночного акцепторного сайта лизина предупреждает убиквитинирование NEMO, хотя это изменение не полностью ингибирует активацию NF-κB (Zhou et al., 2004). NEMO убиквитинирование было также установлено как важное для реакции на повреждения ДНК, это открывает возможность, что этот феномен может быть связан с TRAF независимостью этих путей.

Т.к. стало ясно, что разные пути нуждаются в олигомеризации и/или убиквитинировании вышестоящих сигнальных компонентов для активации IKK, эти наблюдения не противоречат дополнительной потребности в IKK-Ks. Эти два механизма могут действовать отдельно в независимых NF-κB путях. Фактически необходимость в NIK для активации IKKα хорошо известна и, по-видимому, не зависит от RIP белков. Следовательно, в неканонических сигнальных путях, где RIP-опосредованная олигомеризация NEMO не происходит, активация IKKα может обеспечиваться за счет прямого фосфорилирования Т петли с помощью NIK. Низкое сродство IKKα к NEMO может облегчать доступ NIK к IKKα T петле, но не таковое для IKKβ, или как часть IKKα-only комплексов или благодаря конформационным отличиям между IKKα и IKKβ , когда связаны с NEMO. Как результат активация IKKα может быть независимой RIP-опосредованной олиогомеризацией NEMO, т.к. IKKα не регулируется с помощью NEMO тем же самым способом, что и IKKβ.

Активация активности IKK является преходящим событием и поэтому IKK также д. быть предметом регуляции с помощью петли обратной связи. Существуют многочисленные механизмы негативной обратной связи, которые затрагивают вышестоящие сигнальные компоненты, наиболее заметны deubiquitinases A20 и CYLD (Chen et al., 2006, Hacker et al., 2006). Однако имеются также доказательства механизмов IKK прирожденных негативной обратной связи (Figure 3). Фосфорилирование C-терминального NBD в IKK может быть важным компонентом такой петли обратной связи (May et al., 2002, Schomer-Miller et al., 2006). Согласуется с этой гипотезой и то, что protein phosphatase 2A (PP2A) , как было установлено, ассоциирует с IKK и потенциирует активацию IKK в клетках (Kray et al., 2005, Li et al., 2006).Напротив, in vitro PP2A блокирует активность IKK путем устранения фосфорилирования Т петли (DiDonato et al., 1997). Кроме того, структурные изменения, индуцированные с помощью фосфорилирования NEMO Ser68 и IKK NBD, делает возможным дефосфорилирование серинов активационной петли в IKKs, а также N-терминалтьных сайтов фосфорилирования в NEMO с помощью PP2A или PP2C? (Kray et al., 2005, Palkowitsch et al., 2008, Prajapati et al., 2004).

IKK Substrates

При избыточной экспрессии или анализируемые in vitro, IKKα и IKKβ способны фосфорилировать многочисленные члены IκB семейства, хотя и с разной специфичностью. Напр., IKKα и IKKβ фосфорилируют IκBα по Ser32 и Ser36 и IκBβ по Ser19 и Ser23; однако IKKα менее эффективна и, следовательно, не может комплементировать IKKβ нокаутные клетки (Hacker et al., 2006, Hayden et al., 2004). Более того, и IKKα и IKKβ предпочитают IκB?α в сравнении с IκBβ, это согласуется с различием в кинетике деградации IκBα и β - деградация IκBβ существенно медленнее, чем IκB?α в большинстве канонических путей, в которых обе деградируют (Wu et al., 2003). IκBα соединяется с NF-κB, который, как полагают является предпочтительным субстратом по сравнению со свободным IκBα (Zandi et al., 1998). Это может снижать деградацию вновь синтезированных IκBα, позволяя тем самым собственно функционировать этой ключевой петле негативной обратной связи. Фосфорилирование p100 с помощью IKK? происходит по Ser872 также как и по некоторым N-терминальным остаткам серина. Т.к. серины необходимы также для процессинга p100, то считается. что эти остатки прежде всего действуют как сайты доки для NIK и IKKα (Liang et al., 2006, Xiao et al., 2004). Фосфорилирование др. членов семейства IκB менее охарактеризовано. Наконец, IKKs также, как было установлено. могут фосфорилировать множество др. белков помимо семейства IκB. В частности, роль IKKα в регуляции транскрипционной реакции NF-κB с помощью таргетинга транскрипционных кофакторов, самого NF-κB и др. мишеней обсуждается в контексте транскрипционной регуляции.

Expanding Functions for IκBs

Наше понимание того, как IκB белки действуют, претерпело существенные изменения. Помимо роли ингибиторов функции NF-κB как с помощью предупреждения ядерной локализации, так и связывания ДНК, описаны различные функции IκBs. Наиболее важно, что множественные белки IκB семейства позитивно регулируют транскрипцию, действуя как коактиваторы.

The "Typical" IκBs-IκBα, IκBε, and IκBβ

IκBa; является членом прототипом семейства IκB, обладающим определенными свойствами, которые характеризуют IκB белки. Канонический p65/p50 гетеродимер является крупным, хотя не исключительно, он соединяется с IκBα и необходима быстрая сигналом-индуцированная протеосомная деградация IκBα для импорта в ядро и связывания ДНК с помощью NF-κB p50/p65. Ядерный NF-κB управляет экспрессией IκBα , генерируя петлю негативной обратной связи. Следовательно, в отсутствие IκBα завершение активации NF-κB в ответ на канонические стимулы, такие как TNF-α существенно задерживается (Gerondakis et al., 2006, Pasparakis et al., 2006). Продолжительность NF-κB реакции тяжело отражается на кинетике пути обратной связи и, напр., кинетика инактивации NF-κB может быть в основном восстановлена путем помещения разных IκB, напр., IκBβ, под контроль промотора IκBα (Cheng et al., 1998). в

IκBα, IκBβ и IκBε , как полагают, действуют как традиционные IκB белки: т.е. они секвестрируют NF-κB димеры от κB элементов, ингибируя тем самым транскрипцию. Хотя нокаутированный IκBβ, в геноме замещенный на IκBα , может действовать аналогично IκBα, существует достаточно различий между этими ингибиторами, так что маловероятно, что IκBα и IκBβ полностью взаимозаменяемы. В самом деле, NF-κB отвечает в MEFs, лишенных одного, двух или всех трех IκB белков, демонстрирует, что они обладают уникальными функциями, даже внутри данного сигнального пути. Функциональные характеристики IκBα, IκBβ и IκBε скорее всего результат временных различий в их деградации и ресинтезе (Hoffmann et al., 2002). Сравнительно недавно, используя клетки дефицитные по всем трем традиционным IκB белкам, было показано, что давнишняя модель цитоплазматической секвестрации с помощью IκBs верна лишь частично (Tergaonkar et al., 2005). В частности, клетки, которые лишены всех трех субъединиц, обнаруживают относительно нормальное ядро/цитоплазма распределение p65, но у них достоверно увеличена базовая NF-κB-зависимая экспрессия генов, это указывает на то, что регуляция транскрипционной активности NF-κB с помощью IκBs частично независима от цитоплазматической секвестрации. Эта работа также определенно подтвердила, что стимулами индуцированная активация канонического NF-κB нуждается в трех типичных IκB белках (Tergaonkar et al., 2005). в

Подобно IκBα, IκBε деградирует IKK-зависимым способом и его экспрессия позитивно регулируется с помощью NF-κB. Однако деградация и ресинтез IκBε происходит с существенно замедленной кинетикой по сравнению с IκBα. Различия в кинетике деградации IκBε и IκBα оказывает выраженный эффект на природу транскрипционной реакции на TNF (Kearns et al., 2006). IκBε преимущественно экспрессируется в гематопоэтических клетках, а потеря IκBε вызывает избирательные дефекты в гематопоэтических клонах, хотя очевидно, что потеря IκBε в основном компенсируется за счет IκBα (Goudeau et al., 2003, Samson et al., 2004). Временная и зависимая от типа клеток деградация IκBε подтверждает гипотезу, что разные IκBs могут выполнять уникальные функции в NF-κB реакциях.

Уникальность функции IκBβ, однако трудно установить. Хотя IκBβ?, подобно IκBε, подвергается медленной деградации и ресинтезу, делеция IκB? не затрагивает драматически кинетику NF-κB реакций, как это видно при делеции IκBα или ε (Hoffmann et al., 2002, Kearns et al., 2006). Однако как ядерно/цитоплазматическая локализация, так и посттрансляционные модификации IκBβ , по-видимому, уникальны и IκBβ способна ассоциировать с NF-κB димерами. которые связываются с ДНК (Suyang et al., 1996, Thompson et al., 1995). Эти данные указывают на то, что IκBβ может действовать? регулируя связывание NF-κB димеров с κB сайтами в ядре.

The Precursor IκBs-p100 and p105

IκB/NF-κB белок предшественник p105 подвергается процессингу с помощью протеосом и дает p50. Многие исследования продемонстрировали, что IKKβ-зависимое фосфорилирование С-терминальной области p105 по Ser923 и Ser927 (Ser933 в p105 человека) ведет к полной деградации белка аналогично IκBα (Hayden et al., 2004, Perkins, 2006). Недавно было показано, что SCFβTrCP не является ответственным за индуцированный сигналом процессинг p105, и было предположено. что это событие не зависит от убиквитинирования (Cohen et al., 2004). Конструктивный процессинг p105 в p50 как было установлено, происходит одновременно с трансляцией, хотя недавний анализ продемонстрировал, что процессинг p105 может происходить посттрансляционно (Lin et al., 1998, Lin et al., 2000, Moorthy et al., 2006). Обычно превращение p105 в p50 в в клеточной линии, дефицитной по E1 Ub-активирующему энзиму, дополняемое с помощью анализа in vitro, строго указывает на то, что процессинг p105 может происходить посредством 20S протеосом, независимого убиквитинирования и способом, который не согласуется с ко-трансляционным процессингом (Moorthy et al., 2006). Когда p105 связан с NF-κB комплексами, то создается впечатление, что процессинг ингибируется и индуцированная деградация ускоряется (Cohen et al., 2001, Harhaj et al., 1996). Т.о., p105 без процессинга действует как IκB белок, который связывает NF-κB димеры и может быть индуцибельно деградирован после активации IKK. Кроме того, 3' конец гена p105 также кодирует независимо регулируемый транскрипт, IκBγ, который обнаруживает отличное тканевое распределение и может функционировать как независимый IκB белок в клетках мышей (Hayden et al.,

Процессинг p100 нуждается в IKKα и является преимущественно зависимым от стимулов (Senftleben et al., 2001). NIK необходим для активации IKKα и также может быть необходим для фосфорилирования p100 с помощью активной IKKα (Xiao et al., 2001, Xiao et al., 2004). Фосфорилирование p100 по серинам 866, 870 и 872 (Ser865, 869, и 871 в p100 человека) ведет к рекрутированию SCFβTrCP, polyubiquitination Lys855 в области с последовательностью, гомологичной Lys22 в IκBα, и к последующей деградации или процессингу в p52 (Amir et al., 2004, Fong et al., 2002, Liang et al., 2006). Однако, было предположено, что IKKα, хотя и необходим, но может не быть ответственным за фосфорилирование этих ключевых остатков серинов (Liang et al., 2006, Xiao et al., 2004). Конституитивный процессинг p100 в p52, который происходит на низком уровне в клетках тип-специфическим образом, также зависит от IKKα и NIK (Qing et al., 2005, Xiao et al., 2004). Регуляция RelB с помощью p100 является особенно критической, т.к. RelB-содержащие димеры ассоциируют только с p100, и было предположено, что они нуждаются в p100 связывании для стабилизации (Solan et al., 2002). Т.к. p100 подвергается конституитивному процессингу в определенных тканях, то RelB/p52 гетеродимеры могут обладать конституитивной активацией, а RelB-дефицитные мыши обнаруживают пониженную базовую активность NF-κB в тимусе и селезенке (Gerondakis et al., 2006, Pasparakis et al., 2006). Т.к. RelB регулируется исключительно с помощью p100, то сам p100 может действовать более широко. В дополнение к IκBα/β/ε, p100 может также действовать как традиционный IκB регулируемый p65-содержащий комплекс, стоящий ниже IKKα (Basak et al., 2007). Сходным образом было показано, что в Т клетках p100 также ограничивает p65-опосредуемую активность NF-κB с помощью петли негативной обратной связи вследствие активации T клеток (Ishimaru et al., 2006). Следовательно, p100 может действовать, индуцируя канонические и неканонические NF-κB комплексы, также как и участвовать в позитивной и негативной регуляции конституитивной активности NF-κB. Следовательно, p100 обладает несколькими ключевыми свойствами, которые скорее всего важны для регуляции NF-κB: (1) избирательная регуляция специфических NF-κB комплексов, так что в его отсутствие субнабор индуцибельных NF-κB реакций, т.e., RelB-зависимая генная экспрессия, теряется; (2) избирательная функция IκB субъединиц, стоящих ниже специфических сигнальных путей; (3) наконец, регуляция базовой активности специфических NF-κB димеров.

The "Atypical" IκBs-IκBζ and Bcl-3

IκBζ и Bcl-3 являются оставшимися двумя членами семейства IκB и, по-видимому, регулируют передачу сигналов NF-κB посредством иного механизма. Bcl-3 является уникальным тем, что содержит TAD. Bcl-3 находится в ядре, ассоциированным с p50- и p52-содержащими гомо- и гетеродимерами. Механизм действия Bcl-3 до конца не понят. Bcl-3 может обеспечивать освобождение от транскрипционной репрессии путем удаления p50 гомодимеров из κB сайтов, т.о., действуя как традиционный IκB, но обеспечивающий активацию путем действия на репрессивные NF-κB димеры и позволяя образовываться p65:p50 или др. TAD-содержащим димерам, достигающих κB элементов (Hayden et al., 2004, Perkins, 2006). Альтернативно, Bcl-3 может также стабилизировать репрессивные p50 гомодимеры и ингибировать активацию NF-κB, предупреждая доступ TAD-содержащих димеров к κB сайтам (Carmody et al., 2007). Как результат, индукция экспрессии Bcl-3 ингибирует последующую активацию NF-κB и может вносить вклад в толерантность к LPS у макрофагов. Напротив, в случае p52 гомодимеров считается, что Bcl-3 обеспечивает транскрипционный потенциал индуцибельным способом (Bours et al., 1993). Cyclin D1 является Bcl-3-регулируемым геном, который особенно интересен благодаря своей роли в клеточной пролиферации и раке (Rocha et al., 2003, Westerheide et al., 2001). Недавно было продемонстрировано, что deubiquitinase CYLD, ранее известная как действующая в петле негативной обратной связи, управляемой NF-κB, негативно регулирует функцию Bcl-3 путем предупреждения его накопления в ядре и ко-активации посредством p50 и p52 гомодимеров (Massoumi et al., 2006, Simonson et al., 2007). Bcl-3 , как недавно было показано, участвует также в регуляции p53 путем усиления транскрипции Hdm2 в нормальных и раковых клетках (Kashatus et al., )

IκBζ обладает относительно слабой гомологией с др. IκBs и больше сходен с Bcl-3, чем с остальными членами семейства. IκBζ не экспрессируется постоянно, а скорее позитивно регулируется в ответ на IL-1 и TLR4 лиганды, но не TNF, и во время экспрессии локализуется в ядре (Hayden et al., 2004). Наиболее интересно, что в отсутствие IκBζ, LPS- или IL-1-индуцированная экспрессия субнабора NF-κB-регулируемых генов теряется (Yamamoto et al., 2004). IκBζ индуцибельно экспрессируется вследствие активации NF-κB и будучи экспрессированным ассоциирует прежде всего с p50 гомодимерами. Более того, IκBζ обнаруживается ассоциированным с p50 на промоторе IL-6, который не экспрессируется индуцибельно в клетках, нокаутных по IκBζи поэтому предполагается, что IκBζ действует как коактиватор для p50 гомодимеров (Yamamoto et al., 2004). Хотя IκBζ не обладает четкой TAD или трансактивационной активностью, он обладает трансактивационным потенциалом, когда ко-экспрессируется в виде GAL4 слитого белка с GAL4-p50 (Motoyama et al., 2005). IκBζ , как сообщалось, негативно регулирует p65-содержащие NF-κB комплексы и легкое повышение активности NF-κB наблюдается у IκBζ нокаутов, что согласуется с этим предположением (Motoyama et al., 2005, Yamamoto et al., 2004). Т.о., IκBζ, подобно Bcl-3, может также быть способным избирательно ингибировать или активировать специфические NF-κB димеры.

Базируясь на недавних достижениях в понимании функций IκB functions, больше нельзя в целом характеризовать IκB белки как ингибиторы NF-κB. Белки IκB могут также действовать и как NF-κB кофакторы, которые избирательно взаимодействуют с разными NF-κB димерами. Посредством подобных взаимодействий обычно IκBs ингибируют связывание NF-κB с ДНК, тогда как белок предшественник p100 может стабилизировать образование в общем-то нестабильных NF-κB димеров. Атипические IκBs путем стабилизации связанных с промоторами NF-κB димеров могут или ингибировать или усиливать управляемые NF-κB транскрипционные реакции (Figure 4).

Regulation of Transcription by NF-κB

Пять членов семейства NF-κB обладают уникальными функциями; однако анализ этих функций чрезвычайно осложнен их склонностью формировать гомо- и гетеродимеры, маскируя т.о. их уникальные роли у нокаутных животных. Исторически, большая часть, того, что мы знаем о всем NF-κB пути было открыто с использованием модельных систем, со стимулами и методами, которые были сфокусированы на передаче сигналов посредством IκB? в p65-содержащие комплексы. Поиски NF-κB расширялись на всё боле разнообразные системы, и стало возможным описать специфические функции индивидуальных субъединиц NF-κB и специфических пар димеров (Hoffmann et al., 2006, Natoli et al., 2005). Не будем останавливаться на этих специфических функциях, а обсудим более общую информацию о том, как инициируется и заканчивается NF-κB-зависимая транскрипция. в

Существует несколько ступеней в дополнение к деградации IκB , которые необходимы для завершения активации NF-κB-зависимой экспрессии генов. Описаны многочисленные пост-трансляционные модификации NF-κB. Эти модификации могут быть непосредственно индуцированы компонентами сигнального NF-κB пути, напр., IKK, и они являются также важными узлами для взаимодействий с разными сигнальными путями. По сравнению с др. аспектами передачи сигналов NF-κB пост-трансляционные модификации p65 изучены лучше всего (Figure 2). Поэтому мы сфокусируемся на некоторых примерах того, как пост=трансляционные модификации p65 изменяют связывание IκB, сродство с κB сайтами и взаимодействие с транскрипционными коактиваторами/корепрессорами. Мы рассмотрим, как передача сигналов NF-κB меняет транскрипцию, путем воздействия на активность коактиваторов/репрессоров и модификации хроматина, коротко затронув окончание NF-κB-зависимой транскрипции.

Regulation of Coactivator Binding

Индуцибельное фосфорилирование p65 с помощью protein kinase A (PKA) впервые было распознано более 10 лет тому назад и с тех пор было продемонстрирована его важность для NF-κB транскрипционной активности ниже ступени деградации IκB (Chen et al., 2004). PKA находится в комплексе с цитозольными NF-κB:IκB комплексами и после деградации IκBα фосфорилирует p65 по Ser276, способствуя взаимодействию p65 с транскрипционными коактиваторами CBP (CREB-связывающим белком) и p300 (Zhong et al., 1998). Помимо PKA, др. киназы, особенно заметно MSK1 и MSK2 (mitogen- и stress-activated protein kinase), как m,skj установлено, фосфорилируют Ser276 в p65. MSK1 и MSK2 обладают общей субстратной специфичностью с PKA и MSK1-/-MSK2-/- клетки обладают уменьшенной транскрипционной активностью в ответ на TNF (Vermeulen et al., 2003). MSK1/2 являются ядерными киназами, которые активируются с помощью множественных путей, включая ERK и p38/MAPK и это может обеспечивать взаимодействие на уровне p65 или c-Rel, который также содержит PKA/MSK1/2 консенсусный сайт фосфорилирования (Perkins, 2006).

Хотя и описанны события фосфорилирования p65, но их механическое значение менее ясно. IKKα и IKKβ участвуют в непосредственном фосфорилировании p65 по Ser536 (Chen et al., 2004, Perkins, 2006). мутации Ser536 в аланин, как известно, устраняют взаимодействие p65 с CBP/p300 (Chen et al., 2005). Ser529 в p65 также может быть индуцибельно фосфорилирован с помощью CK2 вследствие стимулирования IL-1 или TNF-α, однако неясно влияет ли фосфорилирование Ser529 на транскрипцию (Bird et al., 1997, Wang et al., 2000). PKCζ может фосфорилировать p65 по Ser311, а CBP не способен ассоциировать с p65 после стимуляции PKCζ-дефицитных клеток (Duran et al., 2003). Среди обсуждаемых p65 фосфоакцепторных сайтов два возникают в домене димеризации RHD (serine 276 и serine 311) и два в C-терминальной TAD области (serines 529 и 536). Возможно, что каждое из этих событий фосфорилирования может вносить вклад в завершение активации p65 путем индукции конформационных изменений, которые облегчают CBP/p300 связывание. в

Ацетилирование p65, возможно с помощью CBP/p300 и ассоциированных HATs, происходит в ядре и ассоциирует с повышенной транскрипцией (Chen et al., 2004). Ацетилирование множественных lysines в p65 было продемонстрировано, но лишь ацетилирование Lys310, как было четко показано, усиливает транскрипционную активность не нарушая связывания с ДНК или IκB (Chen et al., 2002). Ацетилирование Lys310 блокируется или в отсутствие фосфорилирования Ser276 или за счет избыточной экспрессии каталитически неактивной PKAc (Chen et al., 2005). Т.о., фосфорилирование p65 необходимо для рекрутирования CBP/p300, позволяющего ацетилировать Lys310. Фосфорилирование Ser536 phosphorylation, пока не полностью необходимое, существенно усиливает ацетилирование Lys310 (Chen et al., 2005). Одной из возможностей является то, что фосфорилирование Ser536 изменяет взаимодействие p65 с SMRT (silencing mediator of retinoic acid and thyroid hormone receptor) корепрессорным комплексом, так что уровень HDAC3 снижается , а CBP/p300 возрастает (Hoberg et al., 2006). Помимо фосфорилирования p65, IKKα может также способствовать ацетилированию Lys310 за счет прямого фосфорилирования SMRT, которое ведет к удалению HDAC3 из SMRT корепрессорного комплекса (Hoberg et al., 2006). IKKα регулирует транскрипцию благодаря нескольким дополнительным ядерным субстратам. IKKα , как было установлено. ассоциирует с κB сайтами некоторых чувствительных к NF-κB генов,, а стимулами индуцированное фосфорилирование гистона H3 по серину 10 не происходит в отсутствие IKKα (Anest et al., 2003, Yamamoto et al., 2003). Помимо SMRT и N-CoR (nuclear receptor corepressor) комплексов IKKα фосфорилирует также CBP коактиватор (Huang et al., 2007).

Белок p53 участвует на многих уровнях пути NF-κB. Важность как NF-κB, так и p53 при раке продемонстрирована важным исследованием взаимосвязи между этими двумя транскрипционными факторами. p53 и p65 , как известно, непосредственно конкурируют за CBP/p300 (Webster et al., 1999), который , как полагают, способствует из корепрессии. Однако CBP/p300 используется широким кругом разнообразных транскрипционных факторов, это делает неясным, как два противоположных фактора, непосредственно конкурирующие за такой критический рессурс, могут объяснить специфической взаимодействие между двумя путями. Модификация самого кофактора может оказаться более важной. Недавно сообщалось, что IKKα фосфорилирует CBP стимул-зависимым образом, индуцируя усиление активности CBP, повышение связ с p65 и снижение связи с p53 (Huang et al., 2007). Реципрокный механизм, с помощью которого p53 может репрессировать NF-κB менее ясен, хотя аналогичное улучшение состояния CBP может происходит во время передачи сигналов p53, что не благоприятствует связи NF-κB/CBP. Ещё предстоит показать, что таргетинг CBP с помощью IKK может влиять на транскрипционные факторы слишком широко; однако существуют дополнительные элементы, такие как конформация CBP, связанного со специфическими транскрипционными факторами или с существованием адапторов, которые могут ограничивать эффект такой модификации определенной группой транскрипционных факторов.

Сходная регуляция CBP/p300 может лежать в основе др. примеров взаимодействия транскрипционного фактора с NF-κB. GSK3β-дефицитные эмбриональные фибробласты дефицитны по NF-κB-зависимой транскрипционной активности, несмотря на нормальную транслокацию в ядро и связывание ДНК (Bonnard et al., 2000, Hoeflich et al., 2000). Пока предполагается, что GSK3β может фосфорилировать p65, эффект GSK3?β is скорее всего более косвенный. GSK3β обычно конституитивно активен, фосфорилирует и инактивирует CREB разрушающее взаимодействие между CREB и CBP. Т.о., инактивирование GSK3β высвобождает репрессию CREB, который соединяется CBP, редуцируя его доступ к NF-κB (Martin et al., 2005). Интересно, что в IKKα-/- клетках соединение CBP с CREB усиливается (Huang et al., 2007). Одним из возможных объяснения является то, что CBP соединённый с CREB, является чистым субстратом для IKKα фосфорилирования и что CBP, фосфорилированный с помощью IKKα плохо соединяется с CREB. Помимо p53 и CREB, существуют важные взаимодействия между NF-κB и широким набором транскрипционных факторов. Взаимодействие между ядерными рецепторами и NF-κB, которое скорее всего имеет важное физиологическое значение для понимания регуляции воспаления и рака, является одной из областей, в которой недавно достигнут определенный прогресс (De Bosscher et al., 2006).

Неожиданным аспектом NF-κB-зависимой экспрессии генов, который возник недавно, является то, что NF-κB-регулируемые гены могут быть подразделены на две группы в зависимости от их потребности в модификации хроматина для экспрессии (Natoli et al., 2005). Первое сообщение об этом феномене классифицировало NF-κB-зависимые гены на constitutively and immediately accessible (CIA) промоторы, которые не нуждаются в модификациях хроматина, и промоторы, с regulated and late accessibility (RLA) , которые зависят от индуцированных стимулами модификаций хроматина (Saccani et al., 2001). Эта базовая классификация была расширена после демонстрации, что хроматин-ремоделирующие комплексы используются дифференциально для экспрессии воспалительных генов (Ramirez-Carrozzi et al., 2006). Наиболее вероятно, что непосредственно ранние гены обладают открытой конформацией, хотя , хотя что обусловливает это состояние модификации хроматина ещё предстоит определить. Недавно сообщалось, что мутации определенных сайтов фосфорилирования в p65 влияют на экспрессию генов разными способами. Мы недавно нашли у нокаутных мышей, экспрессирующих S276A мутантную форму p65, что затрагивается экспрессия субнабора NF-κB-регулируемых генов (unpublished data). Т.к. Ser276 является критическим для рекрутирования CBP, то это указывает на то, что разные регулируемые NF-κB гены отличаются своими требованиями к ацетилированию гистонов, хотя основы этих различий остаются неясными. Хотя было показано, что последовательность κB сайта может в некоторых случаях предопределять связывание кофактора, однако более общее правило управления связывания кофакторов ещё предстоит выяснить (Leung et al., 2004). В дополнение к традиционным кофакторным и корепрессорным комплексам, растет список белков. которые взаимодействуют с NF-κB димерами и влияют на связывание и транскрипцию ДНК (Natoli et al., 2005). Одно недавнее интригующее добавление к этому списку - это рибосомный белок S3 (RPS3), который . по-видимому, необходим для связывания NF-κB со специфическим сайтом κB (Wan et al., 2007).

В дополнение к потребности в коактиваторах повышенное внимание привлечено к специфической функции индивидуальных NF-κB димеров (Hoffmann et al., 2003, Hoffmann et al., 2006). Напр., недавно было показано, что определенные димеры обнаруживают отличия по сродству κB связывающего сайта in vitro, анализ связывания промоторов in vivo указывает на то, что отбор димеров не может быть снижено только за счет последовательности κB (Bonizzi et al., 2004, Britanova et al., 2008, Schreiber et al., 2006). Временные различия в высвобождении димеров, обусловлены частично селективностью связывания IκB; специфичные для пути и типа клеток пост-трансляционные модификации субъединиц NF-κB ; координация с др. путями индуцибельных транскрипционных факторов; и сложная природа промоторных структур среди др. факторов возможно являются важными. Возможно, однако , что исследование механизмов, с помощью которых интерфейсы NF-κB димеров с хроматином влияют не генную экспрессию, станет большим полем для исследований в будущем.

Shutting off NF-κB

Механизмы. с помощью которых завершается активность NF-κB остаются в основном неизвестными. Кстати большинство усилий в этой области сфокусировано на механизмах, которые вовлекают IκB белки и вышестоящие сигнальные промежуточные образования (Hacker et al., 2006, Hayden et al., 2004). Однако ни один из этих механизмов не объясняет, как активные, связанные с ДНК NF-κB супрессируются, как только завершается передача сигналов. По-видимому, ресинтез IκB и индукция др. генных продуктов, сказывающиеся на вышестоящих сигнальных компонентах, безусловно являются критическими элементами для подавления NF-κB , возможно существуют дополнительные механизмы, которые функционируют поздней на путях. Одна из возможностей заключается том, что связанный с промотором p65 может стать предметом протеосомной деградации (Saccani et al., 2004). При передаче сигналов LPS suppressor of cytokine signaling-1 (SOCS-1), помимо своих эффектов на вышестоящие JAK-STAT сигнальные компоненты, снижает транскрипционную активность NF-κB (Kinjyo et al., 2002, Nakagawa et al., 2002). Хотя точный механизм действия остается неясным, но недавно было показано, что таргетинг SOCS-1-containing ubiquitin ligase complex (ECSSOCS1) на p65-содержащие димеры осуществляется с помощью COMMD1 (Copper Metabolism MURR1 Domain containing-1) белков (Maine et al., 2007). IKKα также участвует в завершении воспалительных транскрипционных реакций у макрофагов, возможно способствуя ядерной деградации p65 и c-Rel (Lawrence et al., 2005, Li et al., 2005). Т.к. IKKα необходим для активации NF-κB-зависимых транскрипционных реакций, остается неясным, действует ли IKKα непосредственно на NF-κB, чтобы репрессировать последнюю стадию транскрипции или действует за счет поддержки экспрессии продуктов генов, которые действуют в путях обратной негативной связи. Однако недавно было продемонстрировано, что IKKα репрессирует транскрипцию опухолевого супрессора Maspin за счет воздействия на промотор maspin, это строго подтверждает прямой механизм действия IKKα, который не зависит от NF-κB (Luo et al., 2007). Эти находки вместе с некоторыми др. недавними сообщениями, сфокусированные на негативной регуляции ядерных NF-κB, указывают на то, что этот аспект регуляции NF-κB станет областью активных исследований в будущем.

Concluding Remarks

As a result of the tremendous progress made over the past 20 years or so, several common themes have emerged as being essential to all NF-κB signaling. Yet, there are still major unanswered questions about the biology and regulation of NF-κB. These include questions about the regulation of different NF-κB dimers, the exact role of ubiquitination as a regulatory event in signaling, the additional roles of different IκB isoforms, and novel roles for IKKs in pathways other than NF-κB. The interaction between chromatin and NF-κB in regulating gene expression programs is also likely to be an area of intense investigation, as are the events that terminate NF-κB signaling. Several of these areas promise to provide significant insight into signaling and transcriptional regulation that will impact our understanding of these processes both within and beyond the field of NF-κB. Although we have not been able to discuss it the current Review, the link between NF-κB and different aspects of physiology keep emerging. For exle, a recent report (Adler et al., 2007) has provided evidence that NF-κB plays an important role in aging of the skin. As inflammatory processes are believed to contribute to aging phenomenon in general, it will probably not be surprising that one method of slowing aging may lie in selectively blocking NF-κB-dependent inflammatory processes. Along with the already well-established links between NF-κB and diseases such as cancer, asthma, and muscular dystrophy (Acharyya et al., 2007), it is clear that the major advances in the near future will come from the ability to develop effective inhibitors of the NF-κB pathway that can act selectively, thereby avoiding the risk of undesired side effects. The overlapping roles played by NF-κB pathway components in varied physiological settings suggest that this task will be both crucial and difficult. However, it is not too far-fetched to imagine a future where we will have a series of NF-κB inhibitors aimed at different diseases, based on their ability to target specific pathways or cells, and therefore we anticipate that interest and excitement in this most versatile of transcription factors will continue at the same pace.

Shared Principles in NF-κB Signaling Matthew S. Hayden and Sankar Ghosh Cell, Vol 132, 344-362, 08 February 2008

Shared Principles in NF-κB Signaling
Matthew S. Hayden and Sankar Ghosh
Cell, Vol 132, 344-362, 08 February 2008