SUMMARY
During heart development the second heart field (SHF) provides progenitor cells for most cardiomyocytes and expresses the homeodomain factor Nkx2-5. We now show that feedback repression of Bmp2/Smad1 signaling by Nkx2-5 critically regulates SHF proliferation and outflow tract (OFT) morphology. In the cardiac fields of Nkx2-5 mutants, genes controlling cardiac specification (including Bmp2) and maintenance of the progenitor state were upregulated, leading initially to progenitor overspecification, but subsequently to failed SHF proliferation and OFT truncation. In Smadl mutants, SHF proliferation and deployment to the OFT were increased, while Smadl deletion in Nkx2-5 mutants rescued SHF proliferation and OFT development. In Nkx2-5 hypomorphic mice, which recapitulate human congenital heart disease (CHD), OFT anomalies were also rescued by Smadl deletion. Our findings demonstrate that Nkx2-5 orchestrates the transition between periods of cardiac induction, progenitor proliferation, and OFT morphogenesis via a Smadl-dependent negative feedback loop, which may be a frequent molecular target in CHD.
Взаимодействия разнообразных транскрипционных факторов обеспечивают молекулярные программы, которые регулируют развитие сердца млекопитающих. Среди них, Nkx2.5 и Mef2c регулируют общие нижестоящие мишени и обнаруживают поразительное фенотипическое сходство, будучи нарушенными, указывая тем самым на потенциальное взаимодействие во время развития сердца. Ко-иммунопреципитация и двугибридные эксперименты на млекопитающих выявили непосредственное молекулярное взаимодействие между Nkx2.5 и Mef2c. Оценка экспрессии мРНК выявила их пространственно-временную ко-экспрессию в сердце. Наконец, изучение генетического взаимодействия с использованием гистологического и молекулярного анализа показало, что хотя Nkx2.5-/- and Mef2c-/- индивидуальные мутанты обладают обнаружимыми желудочками, но двойные мутанты, Nkx2.5-/-;Mef2c-/- не обладают и что мутантные кардиомиоциты экспрессируют только атриальные и вторичного поля сердца маркеры. Анализ молекулярных маркеров, клеточной гибели и пролиферации предоставили доказательства, что гипоплазия желудочков является результатом нарушения дифференцировки клеток желудочков. Итак, эти данные подкрепляют гипотезу, согласно которой физические. функциональные и генетические взаимодействия между Nkx2.5 и Mef2c необходимы для образования желудочков сердца.
Кардиальный серп и первичная сердечная трубка происходят из клеток первичного поля сердца (FHF), которое начинает дифференцироваться на стадии полумесяца. Вторичное поле сердца (SHF) является популяцией недифференцированных мультипотентных кардиальных клеток предшественников, которые пролиферируют и вносят вклад динамически в рост сердечной трубки как на полюсе притока, так и оттока, предоставляя большую часть миоцитов для правого желудочка и тракта оттока (OFT), внося также вклад в левый желудочек и предсердие (Buckingham et al., 2005).
Ряд факторов участвует в развитии предшественников SHF, включая транскрипционные факторы Еич1б Islet-1 (Isl1), Foxh1, Mef2c и Hand2 и Fgf8 c Fgf10 (Buckingham et al., 2005). Эти гены экспрессируются в клетках SHF и большинство из них подавляются после дифференцировки клеток SHF, что указывает на их специфичную для предшественников роль (Kelly, 2005). T-box транскрипционный фактор Tbx1 является позитивным регулятором пролиферации SHF (Xu et al., 2004), по-видимому, путем непосредственного контроля генов Fgf8 и Fgf10 9Hu et al., 2004; Vitelli et al., 2002; Xu et al., 2004). Isl1 вместе с Gata4 и Foxh1 контролирует экспрессию Mef2c, важные для спецификации как кардиомиоцитов, так эндотелиальных клонов (Dodou et al., 2004; von Both et al., 2004).
Гомеодоменовый фактор Nkx2-5 располагается высоко в кардиальной регуляторной иерархии и экспрессируется в клетках как FHF, так и SHF (Stanley et al., 2002). У человека ген NKX2-5 является одним из наиболее часто мутируемых одиночных генов при ВПС, составляя 1-4% от специфически х пороков, включая прорыв межпредсердной стенки (atrial septal defect; ASD), неправильное расположение сосудов тракта оттока (double-outlet right ventricle; DORV) и сложное врожденное заб олевание, возникающее при стенозе легочной артерии, назв. тетрада Фалло. Исследования на мышах показали, что Nkx2-5 необходим для спецификации и пространственного предопределения миокарда камер и для образования и поддержания элементов проводящей системы. Однако, экспрессия Nkx2-5 в клетках кардиальных предшественников указывает на не охарактеризованную роль этого гена на самых ранних стадиях кардиогенеза.
DISCUSSION
У мутантов Nkx2-5 позитивная регуляция генов сигнатуры предшественников в SHF и аномальная персистенция экспрессии в дифференцирующихся миоцитах указывает на большую раннюю роль Nkx2-5 в модулировании экспрессии генов, ассоциированных с кардиальной индукцией и статусом клеток предшественников. Большинство генов предшественников, затрагиваемых потерей Nkx2-5, экспрессировались в FHF и SHF. Экспрессия в FHF чрезвычайно временная, отражает раннюю дифференцировку этих предшественников в кардиальный серп. Напр., Isl1, ранее считавшийся специфичным для SHF, экспрессируется во всей внутриэмбриональной целомной выстилке на Е7.5, которая содержит компоненты обоих полей предшественников и поэтому скорее всего является pan-cardial маркером клеточных предшественников у мышей. Преходящая экспрессия Isl1 в FHF может объяснить нехватку маркированных производных FHF при Cre картировании судеб (Cai et al., 2003). Паттерны экспрессии маркеров предшественников определяют новые субпопуляции и/или их состояния поведения. В SHF гены Tnc, Pdgfra и igfbp5 экспрессируются на более высоком уровне в каудальных клетках, тогда как впереди экспрессия Pdgfra ограничивается его медиальной частью (дорсальный мезокардий), а Tnc в более латеральных регионах. В противоположность развитию скелетных мышц, где пролиферация затухает с началом дифференцировки и для которых довольно ясны молекулярные сигнатуры предшественников (Рах3/7), миобластов(MyoD, Myf5) и миоцитов (myogenin и контрактильные белки), кардиальные клетки продолжают пролиферировать во время дифференцировки. Возможно, что некоторые из идентифицированных маркеров будут отражать аналогичную прогрессию и в кардиальном клоне, хотя различия между предшественниками, кардиобластами и дифференцированными состояниями кажутся менее выраженными в кардиальной мышце.
An Nkx2-5/Bmp2/Smad1 Negative Regulatory Circuit Limits Cardiac Specification
Мы предписываем как избыточную спецификацию, так и неспособность к пролиферации клеток кардиальных предшественников у мутантов Nkx2-5 избыточной активности пути Bmp2/Smad1. Некоторые наблюдения указывают на вовлечение дально-дейстующего диффузионного морфогена в спектр дефектов, обнаруживаемых у мутантов Nkx2-5, включая позитивную регуляцию Bmp2 в кардиальных полях и повышенные уровни phosph-Smad1/5/8 внутри и за пределами полей. Bmp2-родственные факторы являются сердце-индуцирующими молекулами у позвоночных и беспозвоночных, с Nkx2-5 и его гомологом tinman у дрозофилы являющимися прямыми транскрипционными мишенями для Bmp-Smads (Liberatore et al., 2002; Lien et al., 2002). Следовательно, ранней и возможно непосредственной функцией Nkx2-5 в программе кардиального развития является снижение экспрессии Bmp2, своего непосредственного вышестоящего индуктора. Предварительные данные показывают, что множественные предсказываемые энхансеры Bmp2 обычно оккупируются Nkx2-5 в кардиальных клетах и это требует дальнейшего исследования.
Bmp репрессор noggin может стимулировать пролиферацию клеток SHF in vitro (Waldo et al., 2001) и как показано здесь генетически, Smad1 является критическим негативным регулятором пролиферации SHА in vivo / В противоположность FHF клетки SHF подвергаются продолжительному периоду митотической экспансии, длящейся несколько дней прежде чем начнется и будет перекрываться с образованием OFT/RV и дифференцировкой. Снижение пролиферации в SHF у мутантов Nkx2-5 скорее всего объясняет прогрессивную нормализацию в количествах Nkx2-5-GFP+ клеток вследствие их инициальной избыточной спецификации. Модель петли обратной связи с участием Nkx2-5, Bmp2 и Smad1 и её роль в кардиальной спецификации, экспрессии генов предшественников и пролиферации представлена на . В контексте времени развития репрессивное действие Nkx2-5 на Bmp2/Smad1 контролирует переход между периодом кардиальной индукции и периодом пролиферации предшественников, негативная петля обратной связи, которая скорее всего является фундаментальным признаком цепи (circuitry) кардиального развития у всех позвоночных. Учитывая, что уровни Nkx2-5 увеличиваются от предшественников к дифференцированному состоянию, путь негативной петли обратной связи может быть примером того, как количество клеток предшественников в поле контролируется с помощью степени дифференцировки - парадигма, которая может быть приложима ко взрослым стволовым клеткам и регенерации органов. В этой парадигме Nkx2-5 действует как сенсор дифференцировки и как арбитр репрессии. С помощью негативной петли обратной связи балансируется количество кардиальных предшественников благодаря противоположным эффектам на индукцию и пролиферацию, это является само-регуляцией и и в этом проявляется свойство устойчивости, существенного компонента системы развития.
Коэкспрессия генов, определяющих клетки кардиальных предшественников, включая Isl1 с кардиомиогенными генами в Nkx2-5-нулевой сердечной трубке демонстрирует, что Nkx2-5 играет также критическую роль как молекулярный переключатель, гарантирующий пространственную и временную дискриминацию между предшественниками и дифференцированными состояниями. Однако, сохранение экспрессии Isl1 (и возможно др. генов предшественников) при образовании сердечной трубки у мутантов Nkx2-5 не восстанавливается делецией Smad1, указывая тем самым, что Nkx2-5- зависимая петля обратной связи затрагивает множественные набры генов с разными функциональными последствиями для развития сердца.
A Cardiac Progenitor Cell Defect May Underlie NKX2-5-Related CHD
Снижение пролиферации в SHF у Nkx2-5-нулевых эмбрионов имеет потенциальные последствия для нашего понимания связанных с NKX2-5 ВПС у человека. Мы описали гипоморфную Nkx2-5 модель, в которой животные доживают до рождения со спектром кардиальных аномалий, перекрывающихся с более тяжелыми пороками, наблюдаемыми у некоторых людей с мутациями NKX2-5. Отметим высокую пенетрантность дефектов OFT, сопровождаемых крупным VSD (дефектом межжелудочковой перегородки). Они не видны у гетерозиготных Nkx2-5-нулевых мутантных мышей (Biben et al., 2000) или в спорадических случаях у пациентов (McElhinney et al., 2003), но полностью пенетрантны у гетерозиготных доминантно-негативных моделей дефицита Nkx2-5 (Elliot et al., 2006). Эти находки проливают свет н тонкий баланс между эффективной активностью Nkx2-5 и результатом в виде ВПС. У людей легкие эффекты генов модификаторов на уровни NKX2-5 могут объяснить, в некоторых случаях, изменчивость фенотипа, наблюдаемую у пациентов с мутациями NKX2-5.
Наши данные подтверждают доказательства, что SHF пролиферация являются критическим детерминантом образования SHF и размера и морфологии OFT/RV. У эмбрионов кур физическое устранение или SHF или нервного гребня, который поддерживает развитие SHF? ведет к тяжелому снижению вклада клеток в OFT (Ward et al., 2005; Yelbuz et al., 2002). Это вызывает аномальное петлеобразование и смещение в правую строну OFT, проявляющееся позднее как ОА (overriding aorta). Nkx2-5 гипоморфы обнаруживают уменьшение пролиферации SHF и размера OFT, выявляющиеся на ст. Е8.5 и ведущее к аномальному смещению сосудов тракта оттока вправо, ОА и в более тяжелых случаях DORV. Эти нарушения OFT/RV частично устранялись делецией обоих аллелей Smad1. Однако, не все кардиальные дефекты нормализовались у Nkx2-5 гипоморфов с помощью Smad1 делеции. В частности сохранялись небольшие МЫВы и дефекты камер желудочков. Они скорее всего вызывались снижением дифференцировки камер, в котором как известно Nkx2-5 играет непосредственную роль (Pashmforoush et al., 2004).
Дефекты OFT относятся к наиболее тяжелым ВПС и часто требудт хирургического вмешательства в первые годы жизни. Наше исследование подтверждает, что SHF гены и те, что участвуют в негативной петле обратной связи Nkx2-5/Bmp2/Smad1 могут быть молекулярными мишенями и модификаторами при ВПС. Открытие этого пути, который обеспечивает баланс между спецификацией кардиальных предшественников и пролиферацией сегодня составляет базу для дальнейших механистических исследований в этом патологическом контексте, а также в становлении стволовых клеток, которые лежат в основе формирования сердца и его репарации.
