Млекопитающие ощущают запахи благодаря детекции одорантов с помощью очень большого семейства G protein coupled receptors (GPCRs), которые у мышей кодируются приблизительно 1300 разными генами (Buck and Axel, 1991; Zhang et al., 2007). Эти обонятельные рецепторы (ORs) экспрессируются olfactory sensory neurons (OSNs) , располагающимися глубоко в носовой полости main olfactory epithelium (MOE). Ключевым свойством обонятельной системы млекопитающих является то, что каждый OSN экспрессирует только один из 2600 потенциальных OR аллелей (Chess et al., 1994; Malnic et al., 1999). Это обеспечивает избирательность запаха нейроном и маркирует его характерные особенности в виде единственного OR белка. ORs играют также инструктивную роль в центральной проекции OSNs (Ressler et al., 1994; Vassar et al., 1994; Mombaerts et al., 1996; Wang et al., 1998) и генерации топографической карты свойств реакции на запахи в обонятельных луковицах (Malnic et al., 1999; Belluscio and Katz, 2001).
Как OSN избирают одиночный OR аллель для экспрессии из этого большого семейства. Сначала было установлено. что короткая последовательность ДНК выше стартовой точки транскрипции OR обладает способностью управлять экспрессией ORs и репортерных генов в OSNs в виде паттернов, которые напоминают таковые для эндогенных ORs (Qasba and Reed, 1998; Vassalli et al., 2002). Во-вторых, экспрессия гена OR предупреждает активацию др. эндогенных OR , используя механизм от OR белка зависимой обратной связи (Serizawa et al., 2003; Lewcock and Reed, 2004; Shykind et al., 2004). Недавно было предположено, что предполагаемый трансактивирующий элемент (H) может участвовать в инициации экспрессии одиночного OR (Lomvardas et al., 2006). Согласно этой модели уникальный комплекс, содержащий H элемент д. также служить в качестве мишени для механизма обратной связи, который распознает экспрессию функционального OR белка, предупреждая тем самым активацию дополнительного OR аллеля (Serizawa et al., 2003; Lewcock and Reed, 2004; Shykind et al., 2004). Однако сравнительно недавние данные продемонстрировали, что H регион не является существенным для большинства ORs, а скорее функционирует в цис-положении, скорее всего, подобно locus control region (LCR) кластера глобиновых генов, контролирующего экспрессию локальной группы OR генов (Serizawa et al., 2000, 2003; Fuss et al., 2007). Поэтому было предположено, что д. существовать множество таких LCR-подобных элементов в геноме (Serizawa et al., 2004; Fuss et al., 2007).
DISCUSSION
Обонятельные нейроны млекопитающих экспрессируют одиночный обонятельный рецептор из более 2500 потенциальных OR аллелей. Недавние исследования на мышах открыли два важных момента контроля OR генов. Во-первых, законсервированная последовательность ДНК, расположенная выше гена MOR28, элемент H, как было установлено, работает в цис-положении, чтобы активировать любой один (и только один в данное время) из группы нижестоящих OR генов (Serizawa et al., 2000, 2003; Fuss et al., 2007). Удивительно, в ядре OSN, этот же самый элемент ассоциирует с хромосомным комплексом с активно экспрессируемым OR аллелем, даже если OR из др. геномного местоположения. Эти результаты привели Lomvardas с сотр. к предположению, что H элементы могут также действовать в транс-положении, чтобы вызвать экспрессию одиночного OR на нейрон (Lomvardas et al., 2006). Во-вторых, некоторые исследования, изучающие экспрессию OR псевдогенов с разными мутациями, все они предупреждают трансляцию обонятельного рецептора полной длины (Serizawa et al., 2003; Lewcock and Reed, 2004; Feinstein et al., 2004). Однако такоего типа OR псевдоген часто ко-экспрессировался с функциональным OR геном в OSN. Дополнительные эксперименты, которые непосредственно исследовали стабильность выбора рецептора, продемонстрировали, что обычно происходит переключение OR, хотя и с очень низкой частотой в незрелых OSNs, но оно драматически усиливается, когда OSN выбирает неспособный к трансляции мутантный OR (Shykind et al.. 2004). Поэтому было предположено (Serizawa et al., 2003: Lewcock and Reed, 2004; Shykind et al., 2004), что белок обонятельного рецептора необходим для инициации процесса регуляторной петли обратной связи, это гарантирует, что каждый OSN будет экспрессировать одиночный функциональный OR аллель скорее, чем OR псевдоген (важная проблема для мышей и людей, у которых приблизительно 20% и 70% из OR генов нефункциональны (Zhang et al., 2007).
В данном исследовании мы попытались проверить регуляторную иерархию экспрессии OR генов с помощью экспериментального диссоциациирующего процесса генной селекции путем ингибирования петли обратной связи. Используя гетерологические промоторы, чтобы экспрессировать трансгенные ORs в MOE, было показано, что хотя OSN может быть принужден экспрессировать два разных ORs, оперируют множественные слои контроля, которые обычно гарантируют экспрессию только одного OR в каждом обонятельном нейроне.
В целом наши результаты выявили несколько уровней контроля в выборе обонятельного рецептора. Во-первых, мы показали, что трансгенные ORs, управляемые синтетическим TetO промотором, способны супрессировать выбор и/или экспрессию эндогенных OR генов. Эта находка согласуется с OR-обеспечиваемым feedback ингибированием, описанным ранее (Serizawa et a!., 2003; Lewcock and Reed, 2004; Shykind et al., 2004). Какого типа сигнал важен для такого типа супрессии? Т.к.механизмы, лежащие в основе этого процесса, ещё не идентифицированы, то было обращено внимание на то, что регуляция OR и иммуноглобулиновых генов обладает общими свойствами, включая моноаллельную генную экспрессию и feedback ингибирование (Serizawa et al., 2003; Lewcock and Reed, 2004; Shykind et al., 2004). В иммунной системе развивающиеся В лимфоциты нуждаются в функциональном pre-B cell рецепторе, который инициирует тирозин киназный каскад, который передает сигнал, чтобы предупредить дальнейшую перестройку гена и гарантирует моноаллельную экспрессию (Nemazee, 2000). Следовательно, ожидается, что передача сигналов через обонятельный рецептор может играть важную роль в поддержании моноаллельной экспрессии функционального OR в каждом OSN (Serizawa et al., 2003; Lewcock and Reed, 2004; Shykind et al., 2004). Но наши данные показали, что супрессия эндогенных рецепторов всё ещё происходит даже с OR трансгеном, TetO-M72ALE, который содержит мутацию, делающую его неспособным активировать G protein путь (see also Imai etal., 2006). В комбинации эти находки указывают на то, что хотя OSN д. быть способен определять экспрессию OR белка полной длины, но передача сигналов через путь передачи обонятельных сигналов не обязательна для ингибирования с помощью петли обратной связи.
Во-вторых, мы продемонстрировали, что хотя экспериментально неосуществимо управлять экспрессией OR, используя обычные обонятельные промоторы, у преобразованных мышей такая супрессия может быть преодолена путем отделения промотора от OR кодирующей последовательности; это наиболее четко демонстрируется, когда сравнивается Gy8 непосредственно управляемый трансген OR по сравнению с Gy8 управляемым TTA. который в свою очередь управляет экспрессией TetO-OR трансгена. В-третьих, довольно неожиданно экспрессия эндогенного OR предупреждала экспрессию трансгенных ORs, даже если они управлялись полностью неродственными регуляторными последовательностями, подобными тем, что в бактериальной тетрациклиновой системе. В самом деле, хотя TTA обнаруживается в огромном большинстве OSNs у OMP-TTA knockin мышей, TetO-управляемые ORs экспрессируются лишь в части этих клеток. Следовательно, короткие (~1 kb) высоко вариабельные OR кодирующие последовательности сами по себе (Buck and Axel, 1991; Zhang et al., 2007) достаточны, чтобы пометить трансген как OR локус и сделать его одной из мишеней для ингибирования петлей обратной связи. Однако, наши данные не исключают существование др. мишеней, напр., на уровне выбора гена, как недавно было постулировано (Lomvardas et al., 2006; Serizawa et al., 2006). Наконец, нами было показано, что преждевременная экспрессия трансгенного OR гарантирует супрессию эндогенных рецепторов по принципу "first-takes-all/eariy-bird-gets-the-worm".
Обонятельные рецепторы млекопитающих выполняют. по крайней мере, три функции в OSNs: (1) предопределение избирательности запаха (sensory tuning) нейронами (Zhao et al., 1998), (2) выполнение инструктивной роли в наведении их аксональных соединений в обонятельной луковице (Ressler et a!., 1994; Vassar et al., 1994; Mombaerts et al., 1996; Wang et al., 1998), и (3) действие в качестве пускового механизма ингибирования с помощью петли обратной связи (Serizav>/a et a!., 2003; Lewcock and Reed, 2004; Shykind et al., 2004). Полученные результаты предоставляют новую информацию на контроль экспрессии OR генов и ставят ряд вопросов;напр., как OSN определяет, экспрессирует ли он OR ген? Какова природа механизма обратной связи, которая гарантирует непрерывную экспрессию одного OR, удерживая все остальные гены OR в молчании, даже если управляется синтетическим промотором? И какие свойства кодирующей последовательности OR позволяют OSN распознавать осуществление этой сложной регуляции?
and Leonardo Belluscio