P bodies: at the crossroads of post-transcriptional pathways Ana Eulalio, Isabelle Behm-Ansmant and Elisa Izaurralde Nature Reviews Molecular Cell Biology 8, 9-22 (January 2007) | doi:10.1038/nrm2080
Post-transcriptional processes have a central role in the regulation of eukaryotic gene expression. Although it has been known for a long time that these processes are functionally linked, often by the use of common protein factors, it has only recently become apparent that many of these processes are also physically connected. Indeed, proteins that are involved in mRNA degradation, translational repression, mRNA surveillance and RNA-mediated gene silencing, together with their mRNA targets, colocalize within discrete cytoplasmic domains known as P bodies. The available evidence indicates that P bodies are sites where mRNAs that are not being translated accumulate, the information carried by associated proteins and regulatory RNAs is integrated, and their fate — either translation, silencing or decay — is decided.
Рис.1. | P bodies in Drosophila melanogaster Schneider cells.
Табл.2Common and unique components of mRNP granules
Links
FURTHER INFORMATION
DATABASES
Экспрессия эукариотических генов связна с несколькими пост-транскрипционными событиями, которые в качестве общего субстрата имеют мРНК1-3. Первичный транскрипт превращается в результате удаления интронов и добавления poly(A) хвоста в зрелую мРНК, которая экспортируется из ядра в цитоплазму для трансляции. Не все мРНК транслируются немедленно; некоторые сохраняются в трансляционно репрессированном состоянии и могут транспортироваться в специфические цитоплазматические места, где может быть активирована трансляция. В цитоплазме мРНК являются также объектом для контроля качества и для регуляторных механизмов, которые или способствуют деградации мРНК или репрессируют трансляцию мРНК. Оба процесса могут запускаться с помощью специфических РНК-связывающих белков, а также с помощью малых, комплементарных регуляторных РНК в процессе, известном как РНК-обусловленное молчание генов. В конечном итоге мРНК деградируют.
У эукариот, сотни белков и малых некодирующих РНК участвуют в пост-транскрипционных процессах и их регуляции. Многие действуют на всю мРНК, тогда как др. регулируют специфические транскрипты. Субнабор таких факторов, с функциями репрессии трансляции, мРНК молчания, надзора за мРНК (или контроля качества) и деградации, ко-локализуется в дискретных цитоплазматических доменах, обозначаемых как mRNA-processing тельца (теперь известные как P тельца), которые демонстрируют фундаментальные взаимоотношения между этими процессами.
Будет рассмотрена роль P телец в надзоре за мРНК и в распаде мРНК, РНК-обусловленном молчании и трансляционном контроле. Будут обсуждены модели функции P-телец и связь между Р телами и др. messenger ribonucleoprotein (mRNP) гранулами, которые присутствуют в клетках млекопитающих в условиях стресса, в поляризованных клетках, таких как нейроны и во время оогенеза у разных организмов.
Discovery and rediscovery of P bodies
В 1997, Bashkirov et al.4 описали, что , главная цитоплазматическая в клетках эукариот, локализуется в небольших гранулярных структурах и "highly enriched in discrete, prominent foci" в цитоплазме клеток млекопитающих. Это наблюдение, биологическая важность которого оставалась не оцененной в течение почти 5 лет, вымостило дорогу к фундаментальному открытию в области метаболизма РНК и пост-транскрипционной регуляции генов. Информация о роль XRN1 фокусов как местах, где может происходить деградация мРНК эукариот, получена благодаря открытию, что энзимы, которые расщепляют мРНК ( enzyme ) и его кофакторы колокализуются с XRN1 в этих фокусах в клетках млекопитающих и дрожжей5-9. Decapping энзим функционирует выше XRN1 на 5'→3' пути распада мРНК (Box 1); он гидролизует структуру шапочки, открывая на мРНК 5' монофосфат, который является предпочтительным субстратом для XRN1. Фокусы были названы P тельцами, DCP тельцами или фокусами распада мРНК.
Фокусы XRN1 были открыты снова в 2002 Eystathioy et al.10 благодаря аутоиммунной сыворотке от пациента, который страдал от моторной и сенсорной нейропатии. Эта сыворотка окрашивала дискретные цитоплазматические домены и распознавала новый белок человека с неизвестной функцией, (названный так из-за своего мол. веса и присутствия повторов glycine и tryptophan)10 (Box 2). GW182-содержащие фокусы стали известны как GW bodies (GWBs)10. Вскоре было установлено, что GWBs являются XRN1 или DCP фокусами11. Пациенты с аутоиммунным заболеванием primary biliary cirrhosis также имели антитела против компонентов Р телец и это привело к идентификации двух дополнительных белков Р телец, RAP55 (RNA-associated protein of 55 kDa, также известный как LSm14) и Ge-1 (также известный как Hedls (human enhancer of decapping large subunit) или RCD-8), которые участвуют в decapping мРНК12-17.
RAP55, Ge-1 и GW182 являются маркерами Р телец у многоклеточных организмов (Fig. 1) и являются важными для интеграции Р телец, т.к. их истощение велет к потере Р телец12-14,18. Нет Ge-1 или GW182 ортологов у почкующихся дрожжей Saccharomyces cerevisiae, это явилось первым указанием на увеличивающуюся сложность состава и функции Р телец у высших эукариот. Р тельца легко выявляются в клетках многоклеточных организмов (Fig. 1). Их размеры находятся в пределах 100 - 300 nm в клетках млекопитающих10,18, тогда как у S. cerevisiae, визуализация Р телец часто улучшается в результате избыточной экспрессии или делеции некоторых компонентов Р телец или в результате воздействия на дрожжевые клетки стрессов, таких как устранение глюкозы или гипотонический шок19-21.
В последние несколько лет количество белков, обнаруживаемых в Р тельцах растет экспоненциально (Table 1). В дополнение к белкам, которые участвуют в дегарадации мРНК, компоненты Р телец включают белки надзора за мРНК, RNA interference и трансляционной репрессии. Рибосомальные белки и белки, которые участвуют в инициации трансляции19-22, отсутствуют, за исключением cap-связывающего белка eukaryotic translation-initiation factor-4E и его партнера по связыванию, eIF4E-transporter , которые обнаружены в Р тельцах млекопитающих22,23. Присутствие белков. которые действуют в таких широких пределах пост-транскрипционных процессов, указывает на центральную роль Р телец в регуляции экспрессии генов.
P bodies are sites of mRNA decay
В клетках эукариот деградация основной массы мРНК происходит двумя альтернативными путями, в обоих случаях этому предшествует удаление poly(A) хвоста с помощью (Box 1; rev. Ref. 24). После этой первой скорость-ограничивающей ступени, мРНК подвергаются 3'→5' экзонуклеолитическому распаду, который катализируется с помощью экзосом, а активность регулируется с помощью SKI комплекса1,24,25. Альтернативно, после деаденилирования, структура шапочки удаляется с помощью decapping энзима DCP2, что делает мРНК чувствительной к 5'→3' перевариванию с помощью XRN1.
Устранение шапочки с мРНК является необратимым и поэтому это высоко регулируемый процесс, нуждающийся в участии нескольких белков. Эти белки известны как decapping ко-активаторы. хотя точная молекулярная функция большинства этих ко-активаторов неясна. Подобно DCP2 и XRN1, decapping ко-активаторы высоко законсервированы у эукариот и включают , (enhancer of decapping-3, известный также как LSm16), Ge-1, гектамерный LSm1-7 комплекс, DExD/H-box RNA helicase Dhh1 (известна также как , Me31B или CGH-1) и Pat1 (известен также как CG5208), который является белком с неизвестной функцией и который взаимодействует с гептамерами LSm1-7, с XRN1 и Dhh113, 14,24,26-31. Поразительно, все белки, которые действуют на пути 5'→3' распада мРНК, располагаются в Р тельцах4-35 (Table 1). Напротив, компонеты экзосом и SKI-комплекса не выявляются в Р тельцах8,20, это указывает на определенную степень компартментализации путей деградации мРНК в цитоплазме.
Присутствие энзимов распда мРНК в Р тельцах ставит вопрос, представляют ли собой Р тельца места деградации мРНК или они служат местами хранения этих энзимов. Несколько линий доказательств указывает на то, что деградация мРНК происходит в Р тельцах. Во-первых, ингибирование транскрипции с помощью actinomycin D или с помощью обработки клеток ribonuclease A, ведет к потере Р телец, это указывает на то, что сборка Р телец зависит от РНК9,19. Во-вторых, когда распад мРНК блокируется на ранней стадии - напр., путем предупреждения деаденилирования в клетках, которые лишены deadenylase CCR4 - P тельца исчезают8,22. Напротив, блокирование распада мРНК на более поздней стадии в клетках, которые лишены XRN1 или decapping ко-активатора DCP1, ведет к увеличению размера и количества Р телец8,9,19,22. Размер и количество Р телец, следовательно, зависимт от количества мРНК, которая подвергается decapping. Наконец, в Р тельцах выявляются промежуточные образования распада мРНК. В само деле, блокирование прогрессии XRN1 вдоль мРНК с помощью инсерции специфических РНК последовательностей или с помощью деплеции XRN1 ведет к увеличению Р телец благодаря накоплению промежуточных образований распада внутри телец8,9,19. Итак, эти наблюдения определенно указывают на то, что распад мРНК может происходить внутри Р телец. Они показывают, что существование Р телец базируется на присутствии mRNPs, которые предназначены для или подвергаются деградации.
Происходит ли распад мРНК вне Р телец в диффузной цитоплазме? Большинство компонентов Р телец распределено диффузно по всей цитоплазме и локализуется в Р тельцах4-13 (Fig. 1). Количественная информация относительно фракционирования этих белков между цитоплазмой и Р тельцами всё ещё отсутствует, но учитывая объем Р телец по сравнению с цитоплазмой, можно предположить, что диффузная цитоплазматическая фракция может быть значительно больше, хотя концентрация факторов распада мРНК может быть выше в Р тельцах. Кроме того, компоненты Р телец динамически обмениваются с цитоплазматическим пулом35, это указывает на то, что энзимы распада и ко-активаторы не ограничены Р тельцами. Итак, возможно, что распад мРНК также происходит и может даже инициироваться в диффузной цитоплазме и что Р тельца возникают в результате ассоциации промежуточных образований распада мРНК, индуцированных в результате взаимодействий между энзимами распада и кофакторами. Концентрация промежуточных образований и энзимов распада мРНК в Р тельцах д. увеличиваться со скоростью деградации и, в свою очередь, д. уменьшать любую потенциальную конкуренцию между этими фрагментами РНК и нормальными мРНК для ограничения клеточных белков, участвующих в регуляции мРНК.
P bodies in mRNA surveillance
В клетках эукариот надзор за мРНК или механизмы контроля качества необходим ы для гарантии, что только мРНК после полного процессинга и свободные от ошибок будут транслироваться2. Среди них, путь (NMD) распознает и деградирует мРНК, которые содержат (PTCs, известны также как nonsense кодоны), лимитируя тем самым синтез потенциально токсичных фрагментов белков36-38. NMD запускается в результате события преждевременного окончания трансляции и это ведет к сборке т. наз. комплекса надзора на мРНК36-38. Комплекс надзора представлен UPF1-3 белками, которые законсервированы от дрожжей до человека, и 4 дополнительными NMD эффекторами ( и SMG5-7), которые законсервированы в большинстве многоклеточных организмов, но не имеют ортологов у S. cerevisiae36-38.
является РНК helicase, активность которой регулируется с помощью циклов фосфорилирования и дефосфорилирования, которые нуждаются в дополнительных NMD факторах (Fig. 2). Фосфорилирование UPF1 катализируется с помощью SMG1, протеин киназы, которая родственна phosphoinositide-3-kinase, и нуждается в UPF2 и UPF3. Это указывает на то, что образование тримерных комплексов UPF1-UPF2-UPF3 способствует фосфорилированию UPF1. Дефосфорилирование UPF1 обеспечивается с помощью SMG5, SMG6 и SMG7, которые являются тремя родственными белками, действующими как адапторы между фосфорилированным UPF1 и protein phosphatase-2A (PP2A)36-38 (Fig. 2).
Хотя сегодня не ясно. как NMD эффекторы собираются на мРНК, которая заканчивает трансляцию преждевременно, хорошо известно, что будучи собранным комплекс надзора рекрутирует энзимы, которые участвуют в распаде любой мРНК, тем самым купируется преждевременное окончание трансляции с ускоренной деградацией мРНК. У S. cerevisiae, комплекс надзора рекрутирует decapping энзимы и XRN1, но может также ускорять деаденилирование и 3'→5' деградацию с помощью экзосом и SKI комплекса39,40 (Box 3). Сходный путь распада мРНК из NMD субстратов, как полагают, имеет место и у людей41-43. Напротив. у Drosophila melanogaster, деградация nonsense транскриптов инициируется с помощью эндонуклеолитического расщепления вблизи PTC (Box 3). Возникающие в результате фрагменты РНК деградируют с вновь созданных 3' и 5' концов с помощью экзосом и XRN1, соотв.44.
Итак, энзимы, кот орые участвуют в генеральном распаде мРНК. функционируют также в NMD (Box 3). Эти находки ставят вопрос, может ли распад субстратов NMD происходить в цитоплазме или весь комплекс надзора эскортирует nonsense мРНК в Р тельца, где она и подвергается быстрому распаду. Что запускает накопление мишеней NMD в р тельцах? Информация по этим вопросам получена с помощью наблюдений, что клетки человека локализуют SMG7 в Р тельцах и вызывают накопление SMG5 и UPF1 в этих тельцах45,46. Это, вместе с находкой, что SMG7 соединяется с фосфорилированным UPF1 и запускает его дефосфорилирование (Fig. 2), указывает на механизм, который связывает ансамбль из комплекса надзора с мишенями NMD деградации в Р тельцах. Соотв., UPF1 фосфорилируется во время сборки комплекса надзора на мРНК, содержащих PTC. Фосфорилированный UPF1 рекрутирует SMG7 (наиболее вероятно в комплексе с SMG5 и PP2A)47,48, который, в свою очередь, находит транскрипты. содержащие PTC, чтобы направить их на деградацию в Р тельца45,46. Альтернативно, SMG7 может рекрутировать компоненты Р телец на мРНК, которая маркирована с помощью комплекса надзора; локализация на Р тельцах тогда может быть следствием этого рекрутирования. Ассоциация SMG7, SMG5 и PP2A д. также запускать дефосфорилирование UPF1, которое может участвовать в высвобождении NMD факторов, чтобы обеспечить дальнейшие раунды NMD. Пока неясно, как SMG6 участвует в этом процессе.
Приведенная выше модель вряд ли приложима к S. cerevisiae или D. melanogaster, которые, по-видимому, лишены SMG7 ортолога49. Тем не менее, UPF1 и NMD мишени локализуются в Р тельцах дрожжевых клеток, лишенных UPF2, UPF3 или DCP1 (Ref. 21). UPF2 и UPF3 также концентрируются в Р тельцах в клетках. которые лишены DCP1, но это накопление зависит от UPF1 (Ref. 21). Следовательно, UPF1 обеспечивает образование Р телец и накопление NMD эффекторов и мишеней в этих тельцах, когда NMD блокируется на стадии после связывания UPF1, но до деградации мишеней. Это указывает на то, что в таких условиях формирование Р телец запускается накоплением и агрегацией mRNPs, которые предназначены для NMD, т.к. они ассоциируют с UPF1, но не могут больше деградировать. В согласии с ролью UPF1 в инициации сборки Р телец является взаимодействие между UPF1 и decapping энзимами, описанное как у дрожжей, так и в клетках человека14,50.
Важно отметить, что деградация NMD субстратов вряд ли нуждается в крупных Р тельцах у дикого типа S. cerevisiae при нормальных условиях роста, т.к. Р тельца едва обнаружимы в этих клетках21. Сходным образом интеграция Р телец может не быть необходимой для NMD у D. melanogaster51, т.к. NMD не затрагивается в клетках D. melanogaster, в которых Р тельца разрушены за счет деплеции GW182. Учитывая разные механизмы, с помощью которых бессмысленные мРНК деградируют у разных видов, всё ещё возможно, что Р тельца играют активную роль в NMD у др. организмов.
P bodies and gene silencing
(siRNAs) и (miRNAs) представляют два новых класса малых РНК, которые регулируют экспрессию генов после транскрипции52,53. Хотя siRNAs и miRNAs отлияаются своим механизмом биогенеза, регуляторные функции каждого класса затрагиваются членами законсервированного семейства , с которыми они ассоциируют как часть (RISCs)52,53.
Argonaute белки способствуют распаду и/или репрессии трансляции мРНК, которые полностью или частично комплементары имеющимся siRNAs и miRNAs52,53 (Box 4). siRNAs полностью комплементарны своим мишеням и и заставляют белки Argonaute расщеплять mRNA в области, которая имеет спаренные основания с siRNA. Сходным образом растительная miRNAs обычно способствует эндонуклеолитическому расщеплению родственных мРНК.
Эндонуклеолитическое расщепление siRNA или растительных miRNA мишеней катализируется с помощью C-terminal белков Argonaute, который адаптируется к ribonuclease H (RNase H)-подобной складке54. Вследствие этого эндонуклеолитического расщепления возникающие фрагменты мРНК передаются в генеральную кухню разложения мРНК. У D. melanogaster, 5' и 3' фрагменты мРНК, которые образуются в результате Argonaute-обусловленного эндонуклеолитического расщепления, деградируются с помощью экзовом в содружестве с комплексом SKI complex,и с помощью XRN1, соотв.55 (Box 4). Arabidopsis thaliana имеет несколько XRN1 паралогов и только один цитоплазматический паралог XRN4, которые участвуют в экзонуклеолитическом удалении 3'-мРНК фрагментов, полученных с помощью эндонуклеолитического расщепления с помощью Argonaute белков56.
В противоположность растениям большинство miRNAs животных лишь частично комплементарны своим мишеням и замалчивается экспрессия генов с помощью, по крайней мере, двух механизмов: с помощью репрессии трансляции путем и/или с помощью облегчения разложения мРНК34,57 (Box 4). В большинстве случаев, однако, распад мРНК с помощью животных miRNAs не происходит с помощью эндонуклеолитического расщепления белками Argonaute, а вместо этого путем направления мРНК на общую кухню деградации мРНК34,57-60. Недавние исследования на эмбрионах рыбок данио, D. melanogaster и клетках человека показали, что miRNAs ускоряют аденилирование своих мишеней34,57-59.
Деаденилирование и ускоренный распад мишеней для miRNA нуждается в белках Argonaute, компоненте Р телец GW182, CCR4-CAF1-NOT deadenylase комплексе, decapping DCP1-DCP2 комплексе и в XRN1 (Refs 34, 57, 60) (Box 4). Все эти белки располагаются в Р тельцах. Более того, белки Argonaute взаимодействуют с GW182, DCP1, DCP2 и RCK/p54 и могут присутствовать в комплексах в Р тельцах33,34,61- 67. Помимо белков Argonaute, miRNAs и miRNA мишени также выявлены в Р тельцах61,67-69, это строго подтверждает роль этих телец в молчании РНК.
Имеется дополнительное подтверждение участия компонентов Р телец в путях замалчивания генов. Во-первых, деплеция GW182 в клетках людей и D. melanogaster ослабляет молчание с помощью miRNAs и в меньшей степени с помощью siRNAs33,34,57,62,63,65. Во вторых, человеческий ортолог Dhh1, RCK/p54, необходим для miRNA-обусловленной репрессии трансляции33. В-третьих, белок Caenorhabditis elegans AIN-1 (который родственен GW182) необходим для регуляции генов с помощью, по крайней мере, субнабора miRNA мишеней66. Наконец, miRNA функция нарушается в клетках D. melanogaster и людей, которые истощены по decapping DCP1-DCP2 комплексу34,51,57,62.
Хотя эти результаты четко показывают связь между путями РНК-молчания и Р тельцами, они не решают вопроса, являются ли пространственные условия Р телец необходимыми для молчания. Недавние исследования показали, что интеграция Р телец (детекция этих структур с помощью светового микроскопа), необязательна для siRNA-обусловленного молчания. В клетках людей деплеция LSm1 или RCK/p54 ведет к потере Р телец и диффузии Argonaute protein-2 (AGO2) по всей цитоплазме, причем это не влияет на siRNA-обусловленное расщепление мРНК33. Соотв., эндонуклеолитическое расщепление с помощью AGO2 лишь слегка ингибировано в клетках человека и D. melanogaster, которые истощены по GW18233,51,62,63. Более того, обработка cycloheximide, которые также разрушает Р тельца, не влияет на функцию siRNA33. Сходным образом, miRNAs репрессируют свои мишени в клетках, в которых Р тельца разрушены деплецией LSm1 (Ref. 33). Итак, хотя компонетты Р телец и играют роль на путях молчания, siRNAs и miRNAs могут функционировать и в отсутствие видимых Р телец. Следовательно, накопление белков Argonaute, siRNAs, miRNAs и их мРНК мишеней в Р тельцах может быть следствием скорее, чем причиной молчания.
Role of P bodies in translational repression
miRNAs не только способствует деградации мРНК, но также репрессирует трансляцию своих мишеней и во многих случаях делает это, не нарушая количеств мРНК, это указывает на то, что репрессия трансляции происходит независимо от распада мРНК в этих случаях3. Как miRNAs регулируют трансляцию не очень понятно, но компоненты Р телец участвуют в этом процессе. В частности, деплеция GW182 в клетках людей и D. melanogaster ослабляет репрессию трансляции с помощью miRNAs33,34,57,62. Это наблюдалось не только для мишеней, которые регулируются на уровне мРНК, но и также для тех, которые регулируются в основном на уровне трансляции34,57,62. Сходным образом, RCK/p54 также необходим для функционирования miRNA33.
Роли компонентов Р телец в репрессии трансляции и деградации с помощью miRNAs связаны. Вклад каждого из этих процессов в miRNA-обусловленное молчание генов, по-видимому, отличен для каждой miRNA-мишень пары и он, по-видимому, зависит от дополнительных белков, которые ассоциированы с мРНК (которые могут наделять различной восприимчивостью к нуклеазам)57. В согласии с этим и связывание специфического РНК-связывающего белка человеческого антигена R (HuR) с 3'-untranslated region (3' UTR) мишени miR-122, которое может обращать miRNA-обусловленное молчание в условиях стресса68.
Компоненты Р телец не только играют роль в репрессии трансляции с помощью miRNAs, но также участвуют в репрессии трансляции, обнаруживаемой при разных патологических условиях. Напр., у S. cerevisiae, потеря глюкозы ведет к быстрой потере , увеличению размеров и количества Р телец и накоплению репрессированных мРНК в Р тельцах19,20,32, эти события нуждаются в Dhh1 и Pat1. У млекопитающих белки с установленными ролями в репрессии трансляции, которые локализуются в Р тельцах, включают RCK/p54, cytoplasmic polyadenylation element-binding protein (CPEB) и eIF4E-T22,23,33,35,70. Взаимодействие между репрессией трансляции и образованием Р телец подчеркивается наблюдением, что стабилизация мРНК на полисомах путем обработки cycloheximide (который ингибирует трансляционную элонгацию) ведет к потере Р телец8,9,19,20,22,71, в то время как химические соединения или мутации, которые ингибируют инициацию трансляции, усиливают сборку Р телец19,70,71. Следовательно, мРНК д. выходить из трансляции, чтобы вступить в Р тельца, это предоставляет дополнительно е подтверждение гипотезы, что Р тельца формируются путем накопления не-транслируемых mRNPs и, , следовательно, базируют своё существование на них.
Interplay between P bodies and mRNP granules
Помимо Р телец крупные RNP частицы, которые содержат дремлющие мРНК, обнаруживаются в клетках высших эукариот при стрессах, во время оогенеза и в нейрональных клетках71,72 (Table 2). Поразительно, но эти частицы обладают общими с Р тельцами некоторыми компонентами и одной общей функцией - хранение не-транслируемых мРНК. Хотя детальное обсуждение этого вопроса вну задач данного обзора, но в след. параграфе мы суммируем общности и отличия между этими частицами и Р тельцами (rev. Refs 71,72; see Table 2).
Stress granules. В клетках млекопитающих разного типа стрессы. включая УФЛ, тепловой шок и оксидативные стрессы, ингибируют трансляцию основной массы мРНК, которая агрегирует в цитоплазматические структуры, известные как стрессовые гранулы (stress granules (SGs))35,70-74. SGs являются динамичными и обратимыми; они собираются в ответ на средовые стрессы и распадаются после восстановления. Важным свойством, отличающим SGs от Р телец является то, что SGs содержат факторы инициации трансляции и 40S рибосомальные субъединицы35,70-74. Более того, некоторые белки обнаруживаются исключительно в SGs, такие как eIF3 и eIF4G, cytoplasmic poly(A)-binding protein-1 и Ras-GTPase-activating SH3-domain-binding protein (Table 2). Напротив, DCP1, DCP2 и GW182 обнаруживаются исключительно в Р тельцах, указывая тем самым, что SGs и Р тельца функционально отличны35,70,71.
Несмотря на эти различия динамическая связь между SGs и Р тельцами очевидна35,70,71, и некоторые белковые компоненты и виды мРНК общи в этих структурах. Белки RCK/p54, CPEB, XRN1, eIF4E, Fas-activated serine/threonine phosphoprotein (FAST) и tristetraprolin (TTP) присутствуют в Р тельцах, но перемещаются в SGs в клетках в условиях стресса35,70,71. T-cell intracellular antigen-1 (TIA-1) и TIA-1 related (TIAR) белки обнаруживаются преимущественно в SGs, но небольшая фракция обнаруживается также в Р тельцах35,70,71. Важно, что тесная ассоциация и слияние событий между Р тельцами и SGs наблюдается в живых клетках35,70. Наконец, окружение Р телец крупными SGs наблюдается в клетках, которые избыточно экспрессируют CPEB, это представляет доказательства обмена компонентами между этими телами70.
Удивительным общим свойством Р телец млекопитающих и SGs является то, что они диспергируются с помощью химических соединений. которые стабилизируют полисомы (напр., cycloheximide), а их количество и размеры увеличиваются с помощью соединений, которые освобождают рибосомы от мРНК (напр., puromycin)8,9,19,20,22,35,70,71, это подтверждает мнение о том. что мРНК д. выходить из цикла трансляции, чтобы вступить в SGs или Р тельца. Так как мРНК в SGs, но не в Р тельцах ассоциированы с факторами инициации трансляции, то разумно предположить, что мРНК, которые высвобождаются из полисом в клетках в условиях стресса, сначала направляются в SGs35. После освобождения клетки от стресса эти мРНК могут снова активно транслироваться или становиться предметом для дальнейших ступеней ремоделирования, на которых рекрутированные факторы трансляции и PABPC1 удаляют мРНК и белки, которые специфицируют деградацию мРНК и локализацию Р телец.
Сегодня неясно, имеются ли SGs у S.сerevisiae, но наблюдение, что образование Р телец у S.cerevisiae усиливается при некоторых стрессовых условиях19 указывает на то, что Р тельца дрожжей могут представлять собой родоначальные структуры с ролью как в случае присутствия, так и отсутствия стресса. Во время эволюции Р тельца у многоклеточных организмов могли приобрести дополнительные компоненты, такие как компоненты путей замалчивания РНК, которые отсутствуют у S. cerevisiae, и конституитивная и стрессовая функции этих телец могли сегрегировать в самостоятельные структуры.
Germ-cell mRNP granules. Во время оогенеза многие материнские мРНК транскрипционно репрессированы и транспортируются в различные места в ооците. Некоторые направляются к заднему полюсу, где они формируют полярные гранулы или зародышевые гранулы, которые являются важными детерминантами зародышевой линии у некоторых организмов71,72. В цитоплазме у насекомых, где происходит синтез материнских мРНК, во время транспорта некоторые материнские мРНК находятся в крупных mRNP гранулах разного внешнего вида и состава, такие как губчатые тельца и nuage (Table 2). Белки, которые ассоциируют с материнскими mRNP гранулами, которые также присутсвуют в Р тельцах, включают eIF4E, Me31B (CGH-1), двунитчатый РНК-связывающий белок Staufen и D. melanogaster и C. elegans белки Tral и CAR-1, соотв., которые очень схожи с RAP55 (Refs 12, 75-81) (Table 2). Staufen был первоначально идентифицирован как существенный компонент материнских мРНК в ооцитах D. melanogaster72,81. Затем было показано, что Staufen присутствует в стрессовых и нейрональных гранулах у млекопитающих82 и в Р тельцах соматических клетках D. melanogaster и человека (Ref. 71, A.E. and E.I., unpublished observations).
Недавно было установлено, что decapping ко-активатор DCP1 (но не the DCP2 энзим) также является компонентом локализованных в задней части mRNP гранул у D. melanogaster83. Отсутствие DCP2 в таких гранулах указывает на то, что DCP1 может играть др. роль помимо своей стимулирующей роли в decapping. Напротив decapping функция DCP1 может быть необходима только в раннем эмбриогенезе, когда деградируют материнские мРНК. Отметим, что у C. elegans имеется DCP2, которая локализуется в полярных гранулах84. Итак, очевидно, что материнские мРНК транспортируются с частично собранной, но неактивной кухней (machinery) деградации и это может облегчать деградацию этих мРНК при зиготическом переходе83.
Интересно, что хромотоидные тельца, которые являются околоядерными гранулами, локализованными в цитоплазме мужских зародышевых клеток млекопитающих, обладают общими компонентами с Р тельцами и D. melanogaster nuage, включая белки Argonaute, miRNAs и DCP1, это указывает на роль обоих типов телец в пост-транскрипционной регуляции85.
Neuronal granules. В нейронах и большинстве др. поляризованных клеток, мРНК транспортируются в специфические цитоплазматические места, напр., в аксоны или дендриты. Во время транспорта эти мРНК репрессированы и собраны в крупные частицы, которые в противоположность SGs и Р тельцам, как полагают, содержат крупные и малые рибосомальные субъединицы71,72,86. Учитывая функциональное сходство этих частиц с теми, что наблюдаются во время оогенеза (т.е., репрессия и транспорт мРНК), не удивительно, что они обладают общими компонентами, включая CPEB и Staufen81,82,87-90.
Было интересно определить, ассоциированы ли дополнительные компоненты Р телец с нейрональными mRNPs и, в частности, транспортируются ли энзимы деградации мРНК вместе со своим будущим субстратом. В самом деле, локальный распад мРНК вместе с локальной трансляцией мРНК, могут представлять собой важные механизмы, с помощью которых достигается асимметричное пространственное и временное распределение клеточных компонентов.
Decay of mRNAs with AU-rich elements
Наиболее убедительным примером интеграции пост-транскрипционной регуляции являются мРНК, которые содержат adenosine and uracil (AU)-rich elements (AREs). AREs являются цис-действующими РНК элементами, которые обычно локализуются на 3' UTR коротко-живущих мРНК, которые кодируют временно экспрессирующиеся белки, такие как cyclins, cytokines, ростовые факторы и прото-онкогены. Эти мРНК, как было показано, подвергаются быстрому распаду с помощью т. наз. (AMD) пути91. Эффекты AREs на период полу-жизни мРНК mRNA обеспечиваются с помощью нескольких ARE-связывающих белков. Некоторые способствуют быстрому распаду, такие как ARE-связывающий белок TTP и butyrate response factor-1 (BRF1); др. стабилизируют транскрипт, такие как HuR; и, наконец, один AU-binding protein (AUF1 или heterogeneous nuclear (hn)RNP D) могут стабилизировать или дестабилизировать транскрипт в зависимости от изоформы91. Некоторые исследования показали, что ARE-содержащие мРНК деградируют преимущественно в 3'→5' направлении с помощью экзосом92-94, но недавние исследования показали, что 5'→3' распад мРНК также выполрняет важную роль в деградации ARE-содержащих мРНК в клетках млекопитающих14,95,96, это согласуется с наблюдениями у S. cerevisiae97,98. Соответственно, деплеция XRN1 или LSm1 стабилизирует ARE-содержащие мРНК23,96.
В соответствии с ролью в 5'→3' пути распада мРНК в AMD, TTP локализуется в Р тельцах (и SGs) и взаимодействует с компонентами Р телец в клетках млекопитающих14,95,99. Также деплеция компонента Р телец eIF4E-T, который, как полагают, участвует в репрессии трансляции, ингибирует AMD23,96. Напротив. нокдаун GW182, который вызывает разрушение Р телец, не влияет на AMD96, это указывает на то, что энзимы decapping и 5'→3'-распада, которые присутствуют в диффузной цитоплазме, достаточны для AMD, которые следовательно, не нуждаются в присутствии видимых Р телец.
miRNAs, a, следовательно, белки Argonaute, также участвуют в ARE-обусловленном распаде мРНК100. Jing et al.100 показали. что комплексы RISC направляются на ARE-содержащие мРНК с помощью несовершенного спаривания оснований между miR-16 и AREs, и это косвенно стабилизирует связывание TTP. Хотя еще предстоит посмотреть, играют ли miRNAs роль в распаде всех ARE-содержащих мРНК, эта находка подчеркивает, как разные пост-транскрипционные клеточные процессы интегрированы и скооперированы, чтобы регулировать стабильность мРНК.
P bodies are dynamic and reversible structures
Многие компоненты Р телец взаимодействуют, чтобы сформировать мультимерные белковые комплексы. У S. cerevisiae, DCP1 взаимодействует с DCP2 (Ref. 24), в то время как в клетках человека найден комплекс, который состоит из DCP1, DCP2, Ge-1, RCK/p54 и EDC314. Pat1 взаимодействует с Dhh1, XRN1 и LSm1-7 комплексом28,29. GW182, RCK/p54, DCPs и белки Argonaute ассоциируют независимым от РНК способом33,34,62-66, a TTP и UPF1 ко-иммунопреципитируют с DCP1, DCP2, Ge-1 и EDC3 (Ref. 14). Эти взаимодействия показывают, что накопление белков и ассоциированных мРНК в Р тельцах может не быть результатом активного целенаправленного процесса, который использует специфические носители, а отражает из врожденное сродство др. к др.
Тем не менее, Р тельца вряд ли представляют собой неспецифические преципитаты RNP комплексов, т.к. их число и размеры меняются драматически в ответ на разные клеточные условия, и белки и мРНК может поступать и выходить из Р телец обратимым образом19,20,32,35,68,70. То, что Р тельца являются высоко динамичными структурами показано наблюдениями, что их количество и размер меняются в ходе клеточного цикла. Р тельца являются крупными и наиболее многочисленными в поздней S и G2 фазе, но отсутствуют в митотических клетках10,18. Сходным образом, количество Р телец является высоким в пролиферирующих клетках и низким в молчащих клетках18. У S. cerevisiae, сборка Р телец запускается рядом клеточных стрессов, включая устранение глюкозы, осмотические стрессы и УФЛ19,20.
Хотя многие детали, качающиеся сборки З телец (и разборки) ещё предстоит выяснить, возможно предвидеть некоторые механизмы для этих процессов. Сборка Р телец может быть облегчена с помощью межбелковых взаимодействий между компонентами Р телец, связанными с нетранслируемыми mRNPs. Абсолютная потребность в РНК для образования Р телец может быть объяснена, если действуют дополнительные взаимодействия поверхностей или сродство между компонентами Р телец, увеличивающие связывание РНК. Более того, многие компоненты Р телец являются крупными мультидоменовыми белками, которые могут связывать более одной молекулы РНК или RNP одновременно, сводя некоторые компоненты в тесную близость и тем самым давая основу для образования Р телец.
GW182 и Ge-1 являются прекрасными кандидатами на роль каркаса при сборке Р телец, т.к. их деплеция ведет к растворению Р телец, в то время как их избыточная экспрессия ведет к образованию крупных Р телец10,11,13,18. Соотв., уровни экспрессии GW182 параллельны присутствию Р телец в клетках млекопитающих: GW182 экспрессируется на высоком уровне в поздней S и G2 фазах и в пролиферирующих клетках и экспрессируется в небольших количествах в митотических или покоящихся клетках10,11,18. GW182 является фосфорилируемым белком10, это указывает на то, что образование ядра формирующегося Р тела может регулироваться. Тем не менее, нет явных ортологов GW182 у S. cerevisiae34, это указывает на то, что несколько механизмов возможно вносят вклад в сборку Р телец.
Помимо GW182 и Ge-1, деплеция LSm1, RCK/p54, eIF4E-T и белков. которые участвуют в процессинге miRNA, таких как Drosha и его партнер по связыванию DGCR8, приводят к потере Р телец у млекопитающих22,23,33,69. Как может отсутствие столь различных белков нарушать интеграцию Р телец? Возможно, что сборка Р телец может нуждаться в критической концентрации не транслируемых mRNPs (которые являются строительными блоками Р телец) в цитоплазматическом компартменте. В отсутствие LSm1, RCK/p54 или eIF4E-T, или в отсутствие функционального miRNA пути, концентрация репрессированных mRNPs в цитоплазме снижается ниже порога, который необходим для сборки Р телец. В самом деле, RCK/p54 (Dhh1) функционирует как общий репрессор трансляции в ооцитах S. cerevisiae, Xenopus laevis и клетках человека32,33,101,102. Сходная функция приписывается eIF4E-T22,23. Комплекс LSm1-7 играет роль в переходе мРНК от активной трансляции к деградации у S. cerevisiae29-31. Роль этого комплекса у высших эукариот не полностью понятна, но она возможно отличается от той, что у дрожжей, т.к. деплеция LSm1 в клетках человека ведет к дисперсии Р телец22,33, в то время как у S. cerevisiae, она увеличивает количество и размеры Р телец8,27.
Наблюдение, что блокирование miRNA пути ведет к разборке Р телец в клетках человека является неожиданным, т.к. оно указывает на то, что miRNA мишени представляют собой существенную фракцию репрессируемых mRNPs в этих клетках. Было бы интересно определить, может ли индуцироваться формирование Р телец независимо от пути miRNA, напр., при обработке Drosha-depleted клеток с помощью puromycin (чтобы генерировать репрессированные mRNPs независимо от пути miRNA).
Reinforcing commitment to repression or decay
Базируясь на наблюдении, что сборка Р телец нуждается в не-транслируемых мРНК и что рибосомы или факторы трансляции не присутствуют в Р тельцах, было предположено, что критической ступенью в пост-транскрипционном контроле является переход mRNPs из трансляционно активного состояния, ассоциированного с полисомами к трансляционной неактивному состоянию32 (Fig. 3; rev. 3). Выход из цикла трансляции возможно приводит к структурному ремоделированию mRNP, при котором факторы трансляции диссоциируют, репрессоры трансляции и decapping ко-активаторы рекрутируются22,28,31,32. Эти перестройки композиции mRNP могут быть облегчены с помощью РНК helicases, таких как RCK/p54 (Dhh1), пли путем рекрутирования белков. таких как Pat1, LSm1-7 или eIF4E-T22,23,32,33,101,102.
Репрессия во многих случаях обратима и mRNPs могут выходить из репрессированного состояния и повторно вступать в пул, в котором происхтодит активная трансляция20,32,68. Или mRNPs могут подвергаться дальнейшей перестройке, которая способствует связыванию дополнительных белков, которые готовят их для деградации (Fig. 3). Репрессированные mRNPs и mRNPs, маркированные для разложения, могут обладать врожденным сродством к др. и агрегировать, формируя Р тельца. Секвестрация этих mRNPs в Р тельцах возможно усиливает репрессированное состояние путем защиты mRNP от трансляционной кухни. Следовательно, скорее роль Р телец заключается не столько в установлении репрессии РНК, замалчивании генов или инициации распада мРНК, а скорее функция Р телец заключается в усилении и поддержании репрессированного состояния мРНК или необратимом предопределении мРНК для деградации.
Concluding remarks
Although P-body components have key roles in post-transcriptional gene regulation, an important question that remains unanswered is whether the environment of large, microscopically visible P bodies is required for regulation to occur or whether these processes take place as efficiently in the diffuse cytoplasm or in non-detectable sub-complexes. Recent studies have indicated that P-body integrity might not be required for RNA silencing and AMD in mammalian cells33, 96. Therefore, an important goal is to determine whether the spatial confinement of mRNA-decay intermediates and repressed mRNPs in P bodies is required for cellular functioning or rather reflects the consequence of cellular activity.
It seems clear that many details remain to be discovered regarding the interplay between P bodies and other mRNP granules and the mechanisms by which assembly and disassembly of these structures is regulated. A fascinating question is how common protein and RNP components are sorted and specific markers segregated among these granules. To address these questions, a quantitative assessment of the fractionation and flux of components among these structures in living cells is required. The composition of P bodies is more diverse in higher eukaryotes than in yeast, which raises the question of whether yeast P bodies represent ancestral structures. A better understanding of how P bodies evolved and additional mRNP granules emerged in multicellular organisms is also likely to provide important insights into the roles and relationships of these different mRNP granules.
A significant future challenge will be to unravel the remodelling steps that underlie the transition of an mRNP from the exit of translation to degradation. The complete repertoire of proteins that are involved in post-transcriptional regulation should be established, and their molecular functions and interactions determined, so that in the not too distant future it might be possible to predict the fate of an mRNP by knowing its complement of associated proteins.
