Пути молчания генов, обеспечиваемые РНК используют double-stranded RNA (dsRNA) для ингибирования генной экспрессии сиквенс-специфическим образом. При RNA interference (RNAi), dsRNA подвергается процессингу в small interfering RNAs (siRNAs), которые осуществляют процессинг комплементраных молекул РНК с помощью RNA-induced silencing complex (RISC) (1). Члены семейства белков Argonaute являются непосредственными партнерами по связыванию siRNAs и образуют стержень RISC (2, 3). Хотя RNAi преимущественно осуществляется в цитоплазме клеток, ядерные РНК также могут подвергаться целенаправленному воздействию siRNAs. Исследование Guang et al. of this issue описывает идентификацию белка Argonaute у червя Caenorhabditis elegans, которые необходим для импорта в ядро siRNA , а значит является важным для ядерной RNAi (4).

Посредством генетического скрининга Guang et al. установили, что мутации в гене nrde-3 (nuclear RNAi defective-3) вызывают у животных неспособность осуществлять ядерную RNAi (цитоплазматическая RNAi не изменена). NRDE-3 является одним из 27 белков Argonaute у C. elegans, но его функция не была охарактеризована. Авт. установили, что NRDE-3 исключительно соединяется с эндогенными siRNAs, классом малых РНК, которые регулируют генную экспрессию и нуждаются в функции экзонуклеазы ERI-1 и RRF-3, РНК-зависимой РНК полимеразы (5, 6). Значительная часть идентифицированных siRNAs возникает благодаря открытой рамке считывания E01G4.5. В самом деле, количество предшественников мРНК, соответствующее E01G4.5 увеличено у nrde-3 мутантных животных, это указывает на то, что NRDE-3 необходим для ядерного замалчивания эндогенных siRNA мишеней E01G4.5. Однако эндогенные siRNAs присутствуют также и у nrde-3 мутантов. Т.о., этот класс малых РНК может ассоциировать с др.белками Argonaute, поскольку зрелые малые РНК скорее всего нуждаются в ассоцииации с Argonaute для стабильности. У мутантных животных, которые дефектны по продукции эндогенных siRNA, NRDE-3 может ассоциировать с экзогенными siRNAs, указывая тем самым, что NRDE-3 взаимодействует с siRNAs независимо от их происхождения.

NRDE-3 содержит аминокислотную последовательность, которая кодирует nuclear localization signal, а слитые белок NRDE-3 и green fluorescent protein преимущественно локализуются в ядрах клеток C. elegans. Более того, ядерная локализация NRDE-3 нуждается в связывании siRNA, т.к. у nrde-3 мутантных животных, дефектных по связыванию siRNA, NRDE-3 не проникает в ядро. Это указывает на то, что только сигнала ядерной локализации недостаточно для

Nuclear interference. (Right) Endogenous siRNAs originating from distinct genomic loci in C. elegans guide cleavage of target RNAs by the Argonaute protein ERGO-1. Cleavage products serve as templates for RNA-dependent RNApolymerases (RdRPs) that generate dsRNAs, which are processed by the enzyme DCR-1. (Left) Exogenous dsRNA is processed by DCR-1 as well, but RDE-1 serves as the cleavage-competent Argonaute protein. NRDE-3 binds to siRNA products from both pathways and transports them into the nucleus, where an Argonaute protein with Slicer activity facilitates nuclear RNAi. RISC, RNA-induced silencing complex.

импорта NRDE-3 в ядро. Следовательно, разумно предположить, что связывание siRNA может вызывать конформационные изменения в структуре NRDE-3, которые делают возможной эффективное связывание с неизвестным рецептором ядерного импорта. И наоборот, мутации в nuclear localization signal NRDE-3 ведут к потере ядерной RNAi, указывая на то, что NRDE-3 содержит функциональный nuclear localization signal и что ядерная локализация NRDE-3 существенна для замалчивания ядерных РНК.

Крупный генетический скрининг у C. elegans показал ранее, что Argonaute белок RDE-3 ассоциирует преимущественно с siRNAs, которые непосредственно происходят из dsRNA (7). Многие др. Argonaute белки у C. elegans ассоциируют со вторичными siRNAs, которые генерируются с помощью РНК-зависимых РНК полимераз. Соотв., Guang et al. установили, что NRDE-3-связанные эндогенные siRNAs скорее всего продуцируется с помощью РНК-зависимых РНК полимераз, это указывает на то, что NRDE-3-обеспечиваемая ядерная RNAi является нижестоящей функцией по отношению к первичным RNAi событиям в цитоплазме (see the figure).

У многих организмов определенные Argonaute белки являются эндонуклеазами. которые расщепляют мишени РНК с высокой степенью комплементарности, чтобы связать siRNA (8). Структурные исследования показали, что три каталитических остатка в Piwi домене белков Argonaute являются важными для расщепляющей активности (8). Хотя NRDE-3 необходим для ядерной RNAi, эта каталитическая триада не законсервирована. Возможно, что NRDE-3 необходим только для импорта в ядро siRNAs, и что др. ядерные белки Argonaute (пока не идентифицированные) могут быть медиаторами ядерной RNAi. Этот сценарий д. использовать перенос siRNAs с одного белка Argonauteна др. в ядре. Такой процесс пока не наблюдался.

Ядерные функции siRNAs были описаны у др. организмов также. У людей siRNAs эффективно замалчивают РНК мишени, которые являются исключительно ядерными (9). Т.к. Argonaute белок Ago2 является единственно известной эндонуклеазой среди белков Argonaute у людей, то очень возможно, что Ago2 обеспечивает ядерную RNAi в клетках человека. Как Ago2 человека и C. elegans NRDE-3 импортируются в ядро и как эти пути импорта регулируются? Дальнейшие исследования в этом направлении не только приведут к лучшему пониманию механизмов лежащих в основе ядерной RNAi, но и смогут показать новые пути улучшения RNAi как инструмента для поисков и терапии.