Сердце является первым органом, формируемым во время эмбриогенеза, а аномалии этого процесса вызывают врожденные пороки сердца, наиболее частая причина врожденных дефектов у людей³. Молекулы, обеспечивающие кардиогенез, особенно интересны из-за интереса к ним в отношении регенерации сердца^4,5. Предыдущие исследования показали, что растворимые ростовые факторы, такие как bone morphogenetic proteins (BMPs), fibroblast growth factors (FGFs), Wnts и ингибиторы Wnt обеспечивают тканевые взаимодействия. которые являются критическими для спецификации кардиомиоцитов^3,4. Мы полагаем, что могут существовать дополнительные растворимые факторы, которые модулируют развитие сердца и/или дифференцировку

P19CL6 клетки дифференцируются в кардиомиоциты с высокой эффективностью в присутствии 1% dimethylsulphoxide (DMSO)⁶. Мы культивировали P19CL6 клетки в культуральной среде, кондиционированной различными типами клеток в отсутствие DMSO, и скринировали кардиогенную активность кондиционной среды. Степень дифференцировки кардиомиоцитов оценивали с помощью иммуноокрашивания MF20 моноклональными антителами, которые распознают саркомерную myosin heavy chain (MHC). Среди нескольких типов тестированных клеток, культуральная среда, кондиционированная с помощью стромальной линии клеток OP9 мышей, индуцировала дифференцировку в кардиомиоциты P19CL6 клетки без воздействия DMSO (Fig. la, left and middle panels). Увеличение области MF20-позитивных клеток сопровождалось индукцией генов кардиальных маркеров, таких как αMHC, Nkx2.5 и GATA-4, и повышенными уровнями белка cardiac troponin T (cTnT) (Fig. la, right panel). Напротив, культуральная среда. кондиционированная с помощью COS7 клеток, эмбриональных фибробластов мышей, NIH3T3 клеток, HeLa клеток, END2 клеток (visceral endoderm-like cells), неонатальных кардиомиоцитов и фибробластов крыс не вызывали дифференцировки в кардиомиоциты клеток P19CL6 в отсутствие DMSO (Fig. la and data not shown). Следовательно, OP9 клетки секретируют один или несколько кардиогенных

Чтобы идентифицировать фактор, продуцируемый OP9, выделяли комплементарные клоны ДНК с помощью сигнальной последовательности методом ловушки из библиотеки кДНК OP9 клеток⁷ и тестировали на кардиогенную активность с помощью временной трансфекции. Среди тестируемых факторов кандидатов, IGFBP-4 индуцировал дифференцировку кардиомиоцитов из P19CL6 клеток (Fig. lb). Воздействие anti-IGFBP-4 нейтрализующими антителами ослабляло эффективность кардиогенной дифференцировки, индуцируемой OP9-кондиционной средой (Fig. lc). Эти находки строго указывают на то, что IGFBP-4 является кардиогенным фактором, секретируемым OP9

Т.к. IGFBPs охарактеризованы как молекулы. которые соединяются и модулируют действие IGFs, то проверяли может ли IGFBP-4 способствовать кардиогенезу или путем усиления или ослабления действия IGFs. Сначала обрабатывали клетки P19CL6 комбинацией anti-IGF-I и IGF-II-нейтрализующими антителами или нейтрализующими антителами против type-I IGF рецептора. Воздействие этих антител не влияло на эффективность индуцируемой IGFBP-4 дифференцировки кардиомиоцитов (Fig. Id and data not shown). Обработка P19CL6 клеток IGF-I и IGF-II также не индуцировала дифференцировки кардиомоцитов (data not shown). Более того, обработка с помощью IGFBP-4 мутантов (IGFBP-4-H74P; His 74 replaced by Pro)⁸, которые неспособны связывать IGFs, индуцировала дифференцировку кардиомиоцитов даже более эффективно, чем IGFBP-4 дикого типа (Fig. le). Это преимущественно обусловлено секвестрацией IGFBP-4 дикого типа, но не мутантного IGFBP-4-H74P с помощью эндогенных IGFs. В согласии с этой идеей, экзогенные IGFs ослабляли индуцированный диким типом IGFBP-4, но не индуцированный IGFBP-4-H74P кардиогенез(Fig. If). Всё это указывает на то, что IGFBP-4 индуцирует дифференцировку кардиомиоцитов IGF-независимым

Мы тестировали гипотезу, что IGFBP-4 может модулировать сигналы, активируемые др. секретируемыми факторами, участвующими в кардиогенезе. Было показано, что каноническая передача сигналов Wnt является критической для дифференцировки кардиомиоцитов^3,4. В P19CL6 клетках, воздействие Wnt3A активирует β-catenin-зависимую транскрипцию репортерного гена TOPFLASH и эта активация ослабляется с помощью IGFBP-4 (Fig. 2a). Передача сигналов Wnt/β-catenin передается с помощью рецепторного комплекса клеточной поверхности, состоящего из Frizzled и low-density-lipoprotein receptor (LDLR)-related protein 5/6 (LRP5/6)9, а IGFBP-4 ослабляет активность TOPFLASH, усиливаемую с помощью экспрессии LRP6 или Frizzled 8 (Frz8) (Fig. 2a). IGFBP-4 не изменял BMP-обусловленной активации BMP-responsive reporter BRE-luc (Supplementary Fig. lb). Эти находки указывают на то, что IGFBP-4 является специфическим ингибитором канонического Wnt пути. Инъекции мРНК Xwnt8 или Lrp6 вызывают образование вторичной оси, а инъекции одной Xenopus IGFBP-4 (XIGFBP-4) мРНК оказывают минимальные эффекты на формирование оси. Однако, Xwnt8-индуцированное или LRP6-индуцированное образование вторичной оси эффективно блокируется при ко-экспрессии с XIGFBP-4 (Fig. 2b, c), указывая тем самым, что IGFBP-4 ингибирует каноническую передачу сигналов Wnt in vivo. Чтобы исследовать механизмы ингибирования Wnt с помощью IGFBP-4, использовали метод анимальной шапочки Xenopus и TOPFLASH репортерный ген. IGFBP-4 ингибировал LRP6-индуцированную, но не β-catenin-индуцированную экспрессию генов мишеней для Wnt (Supplementary Fig. lc). Сходным образом, IGFBP-4 ослабляет Wnt3A-индуцированную или LRP6-индуцированую активность TOPFLASH, но не меняет Dishevelled-1 (Dvl-l)-индуцированную, LiCl-индуцированную или β-catenin-индуцированную активность TOPFLASH (Supplementary Fig. Id, e). Эти находки указывают на то. что IGFBP-4 ингибирует каноническую передачу сигналов Wnt на уровне рецепторов клеточной поверхности. Создавали кондиционную среду, содержащую Myc-tagged extracellular portion of LRP6 (LRP6N-Myc), Myc-tagged cysteine-rich domain (CRD) of Frz8 (Frz8CRD-Myc)и V5-tagged IGFBP-4 (IGFBP-4-V5). Immunoprecipitation (IP)/western blot эксперименты показали, что IGFBP-4 взаимодействует с LRP6N (Fig. 2d) и Frz8CRD (Fig. 2e). Метод связывания в жидкой фазе с ¹²⁵I-меченным IGFBP-4 и кондиционная среда. содержащая LRP6N-Myc или Frz8CRD-Myc продемонстрировали, что взаимодействие между IGFBP-4 и LRP6N или Frz8CRD является специфическим и насыщаемым (Fig. 2f, g). A Scatchard plot анализ выявил два сайта связывания с разным сродством связываниядля LRP6N (Fig. 2f, inset) и одиночный сайт связывания с Frz8CRD (Fig. 2g, inset). Сходный метод связывания с ¹²⁵I-меченным Wnt3A показал. что IGFBP-4 ингибирует Wnt3A связывание с LRP6N (Fig. 2h) и Frz8CRD (Fig. 2i), а Lineweaver-Burk plot показал, что IGFBP-4 является конкурентноспособным ингибитором связывания Wnt3A с Frz8CDR (Supplementary Fig. 2a). IP/western blot анализ с различными делеционными мутантами LRP6 и IGFBP-4 показал, что IGFBP-4 взаимодействует со множественными доменами LRP6 и что С-терминальный thyroglobulin домен IGFBP-4 необходим для связывания IGFBP-4 с LRP6 или Frz8CRD (Supplementary Fig. 2b-f). Было показано, что ингибирование канонической передачи сигналов Wnt способствует дифференцировке эмбриональных стволовых клеток в кардиомиоциты у эмбрионов кур, Xenopus и рыбок данио^{4,10, 11}. Эти результаты подтверждают, что IGFBP-4 способствует кардиогенезу путем противодействия пути Wnt/β-catenin благодаря прямым взаимодействиям с Frizzled и

Затем мы исследовали роль эндогенного IGFBP-4 в дифференцировке клеток P19CL6 в кардиомиоциты. RT-PCR анализ показал, что экспрессия Igfbp4 позитивно регулируется во время DMSO-индуцированной дифференцировки P19CL6 клеток (Fig. 3a). Экспрессия Igfbp3 и Igfbp5 также положительно регулируется на ранней и поздней фазе дифференцировки. соотв. Экспрессия Igfbp2 не меняется, а таковая Igfbpl или Igfbp6 не определяется. Когда IGFBP-4 был нокаутирован с помощью двух разных small interfering RNA (siRNA) конструкций, то DMSO-индуцированная дифференцировка кардиомиоцитов ингибировалась в обоих случаях (Fig. 3b). Напротив, нокдаун Igfbp3 или Igfbp5 не приводил к ингибированию DMSO-индуцированной дифференцировке кардиомиоцитов (Fig. 3b, right panel). Обработка с помощью anti-IGFBP-4 нейтрализующих антител также блокировала DMSO-индуцированную дифференцировку кардиомиоцитов (Fig. 3c). Секреция эндогенного IGFBP-4 , следовательно, необходима для дифференцировки P19CL6 клеток в кардиомиоциты. Иммуноокрашивание по IGFBP-4 показало, что кардиальные миоциты окружены IGFBP-4-позитивными клетками, указывая тем самым на преимущественно паракринный эффект IGFBP-4 на дифференцировку в кардиомиоциты (Fig. 3d). Важно, что те же самые результаты были получены на ES клетках (Supplementary Fig. 3d-g). Затем мы экспрессировали доминантно-негативный LRP6 (LRP6N) в P19CL6 клетках. Экспрессия LRP6N усиливала дифференцировку в кардиомиоциты клеток P19CL6 и обращала ингибирующий эффект нокдауна Igfbp4 на кардиомиогенез (Fig. 3e). Эти наблюдения указывают на то, что эндогенный IGFBP-4 необходим для дифференцировки в кардиомиоциты P19CL6 клеток и ES клеток и что кардиогенный эффект IGFBP-4 обеспечивается посредством его ингибирующего эффекта на передачу

Роль эндогенного IGFBP-4 в развитии сердца in vivo изучали также на эмбрионах Xenopus. Гибридизация in situ целых эмбрионов показала, что сильная экспрессия XIGFBP-4 выявляется на ст. 38 в передней части печени, соседствующей с сердцем (Fig. 4a). Нокдаун XIGFBP-4 с помощью двух разных morpholino (MO) конструкций вызывал кардиальные дефекты, более 70% эмбрионов имели маленькое сердце или не имели совсем (Fig. 4b). Специфичность MO подтверждена наблюдением, что одновременные инъекции MO-резистентной XIGFBP-4 кДНК устраняет MO-индуцируемые кардиальные дефекты (Fig. 4b, Supplementary Fig. 4c). Ко-экспрессия IGF-binding-defective XIGFBP-4 мутации (XIGFBP-4-H74P) или доминантно-негативного LRP6 (LRP6N) также устраняло кардиальные дефекты, индуцируемые с помощью нокдауна XIGFBP-4 (Fig. 4b), тогда как избыточная экспрессия Xwnt8 в сердце-формирующей области вызывала кардиальные дефекты. сходные с теми, что индуцировались нокдауном XIGFBP-4 (Supplementary Fig. 4d-f), подтверждая тем самым мнение, что кардиогенный эффект IGFBP-4 не зависит от IGFs, но обеспечивается за счет ингибирования пути Wnt/β-catenin. Временной профиль кардиальных дефектов, индуцируемых с помощью нокдауна XIGFBP-4 также проверялся с помощью гибридизации in situ с cardiac troponin I (cTnl) (Fig. 4c). На ст. 34, морфология сердца сравнима с контрольными эмбрионами и с MO-инъецированными эмбрионами. Однако, на ст. 38, когда XIGFBP-4 начинает экспрессироваться в передней части печени, экспрессия cTnl заметно ослабляется у MO-инъецированных эмбрионов; экспрессия cTnl снижается и не обнаруживается сердце-подобных структур на ст. 42. Т.о., сердце первоначально формируется, но его последующий рост нарушен в отсутствие XIGFBP-4, это указывает на то, что IGFBP-4 способствует кардиогенезу путем поддержания пролиферации и/или жизнеспособности эмбриональных кардиомиоцитов. Было показано, что канонические Wnt сигналы ингибируют кардиогенез у эмбрионов кур и лягушек и что антагонисты Wnt, такие как Dkkl и Crescent, секретируемые передней энтодермой или областью организатора противодействуют Wnt-обеспечиваемым ингибирующим сигналам и индуцируют кардиогенез в передней латеральной мезодерме⁴. Однако, IGFBP-4-обеспечиваемое ингибирование Wnt необходимо на более поздних стадиях развития, когда сердце уже сформировано в вентральной части и начинает расти и ремоделироваться, чтобы поддерживать эмбриональное кровообращение. Было показано, что передача сигналов Wnt/β-catenin имеет время-зависимые эффекты на кардиогенез в ES клетках: каноническая передача сигналов Wnt на ранней фазе дифференцировки ES-клеток способствует кардиомиогенезу, тогда как она ингибирует дифференцировку кардиомиоцитов на поздней фазе^10-12. В согласии с этим мнением то, что IGFBP-4 способствует дифференцировке в кардиомиоциты ES клеток только когда IGFBP-4 используется на поздней стадии после образования эмбриоидных тел. Сходные время-зависимые эффекты передачи сигналов Wnt/β-catenin на кардиогенез были обнаружены у эмбрионов рыбок данио¹¹. Более того, некоторые недавние сообщения подтвердили, что передача сигналов Wnt/β-catenin является позитивным регулятором пролиферации кардиальных клеток предшественников во вторичном поле сердца¹³. Следовательно, ясно, что каноническая передача сигналов Wnt оказывает разные эффекты на кардиогенез на разных стадиях развития: сначала каноническая передача сигналов Wnt способствует кардиогенезу во время гаструляции или спецификации мезодермы; затем она ингибирует кардиогенез во время, когда кардиальная мезодерма специфицируется в переднюю латеральную мезодерму; затем она способствует экспансии кардиальных предшественников во вторичном поле сердца; и наконец. она ингибирует кардиогенез на поздних стадиях, когда эмбриональное сердце растет. Интересно отметить, что IGFBP-4 экспрессируется преимущественно в печени. IGFBP-4 мышей также строго экспрессируется в тканях, соседних с сердцем. таких как фарингеальные дуги и зачаток печени на ст. (E)9.5 (Supplementary Fig. 3h). Эти наблюдения, а также результаты иммуноокрашивания IGFBP-4 P19CL6 клеток и ES клеток указывает на то, что IGFBP-4 способствует кардиогенезу паракринным образом. Вместе с предыдущим сообщением, что кардиальная мезодерма секретирует FGFs и индуцирует печеночные предшественники в вентральной энтодерме¹⁴, эти наблюдения подтверждают, что существуют реципрокные паракринные сигналы между сердцем и печенью, которые координационно способствуют развитию др.

IGFBPs представлены 6 членами, IGFBP-1 - IGFBP-6. Было установлено, что IGFBP-4 является наиболее мощным ингибитором канонического Wnt и что IGFBP-1, IGFBP-2 и IGFBP-6 также обнаруживают умеренную активность в ингибировании Wnt, тогда как IGFBP-3 и IGFBP-5 не обладают такой активностью (Supplementary Fig. 5a-c). В согласии с этим, IP/western blot анализ показал, что IGFBP-1, IGFBP-2, IGFBP-4 и IGFBP-6, но не IGFBP-3 или IGFBP-5 взаимодействуют с LRP6 или Frz8CRD (Supplementary Fig. 5d, e). Т.о., отсутствие кардиального фенотипа IGFBP-4-нулевых мышей или IGFBP-3/IGFBP-4/IGFBP-5 трижды нокаутных мышей¹⁵ может быть обусловлено генетическим перекрыванием между IGFBP-4 и др. IGFBPs, такими как IGFBP-1, IGFBP-2 и/или

Идентификация IGFBP-4 как ингибитора передачи сигналов Wnt/β-catenin может также иметь значение для биологии рака¹⁶. Было показано, что воздействие IGFBP-4 снижает клеточную пролиферацию некоторых линий раковых клеток in vitro, и что избыточная экспрессия IGFBP-4 ослабляет рост рака простаты in vivo. Снижение в сыворотке уровней IGFBP-4 ассоциирует с риском рака груди. Т.к. активация передачи сигналов Wnt влияет на некоторые формы злокачественных опухолей17,18, то возможно, что ингибирующий эффект IGFBP-4 на клеточную пролиферацию обеспечивается частично за счет ингибирования канонической передачи сигналов Wnt.