Посещений:
Дозовая Компенсация у Млекопитающих

Механизмы Инактивации Х Хромосомы

Dosage Compensation in Mammals
N.Brockdorf,B.M.Turner
Epigenetics. - Cold Spring Harbor (N.Y.) 2007.- p.321-340, Chapter 17

GENERAL SUMMARY
Human DNA is packaged into 23 pairs of chromosomes of varying size. One of each pair Is inherited from our fathers (the paternal homolog) and one from our moth-ers (the maternal homolog). Twenty-two pairs, collec-tively called the autosomes and numbered 1-22 in order of decreasing size, are the same in mates and females, whereas one pair, the sex chromosomes, differ between the sexes. Females have two copies of a medium-sized chromosome designated the X chromosome, whereas males have one X and one copy of a smaller, gene-poor chromosome designated Y. In males, the X chromosome is always inherited from the mother and the Y from the father, whereas in females one X is maternal (Xm) and one paternal (Xp). This chromosomal difference between the sexes Is common in mammals and many other organ-isms and is part of the biological mechanism by which sex is determined. However, it presents evolutionary prob-lems for the organism in that the two sexes differ in the number of X-linked genes they carry, with females having twice as many as males. This can lead to an imbalance in the amount of gene products (RNAs and proteins), which would in turn require differences in metabolic control and other cellular processes. To avoid this, dosage compensation mechanisms have evolved that balance the level of X-linked gene products between the sexes.
In mammals, the mechanism of dosage compensation involves switching off (silencing) of most genes on just one of the two X chromosomes so that there is only one active X chromosome in females, as there is in males. This radical proposal, generally referred to as X inactivation, was first made in 1961 by Mary Lyon in order to explain the patterns of expression of X-linked coat-color genes in mice, similar to the coat-color pattern of the calico cat illustrated. More than 40 years of intensive research since then has been devoted to trying to resolve the intriguing and complex mechanisms by which the process operates. We know that X inactivation occurs early in development, but in a complex way. Very early on, when the embryo consists of only a few cells, the paternal X is selectively inactivated in all cells. Xp must somehow be marked, "imprinted", for inactivation. Later, at the blastocyst stage (just prior to implantation) when the embryo consists of i 50-100 cells, in those cells that will go on to form the embryo itself (located in the inner cell mass, [ICM]), Xp is reactivated, so there are, briefly, two active Xs in females.
Then, either Xp or Xm is chosen at random for inactivation, and its genes are silenced. Intriguingly, in those cells of the blastocyst that will go on to form the extraembryonic tissues (placenta and yolk sac), Xp remains silent. How one X i$ "chosen" for inactivation in the ICM remains a fascinating unanswered question.
The X that is chosen for inactivation remains silent through all subsequent cell generations. This Is one of the most stable forms of gene silencing that we know about, and attempts to reverse it experimentally have been con-sistently unsuccessful. However, oocytes, the female germ cells, are able to reverse the inactiva^on process such that they have two active Xs through meiosis, and the single X in the mature, haploid ovum is also active.
Studies of the X-inactivation process have revealed new molecular mechanisms for gerte silencing. Initiation of silencing is driven by increased expression of a non-coding RNA transcribed from a gene designated XIST, from just one of the two female ^chromosomes. This RNA coats the X chromosome containing the XIST gene that is switched on, shown as the region of green stain-ing in the cell nucleus illustrated. This then initiates the silencing of genes all along that chromosome. XIST itself remains switched on. Following XIST coating, the inac-tive, silent X undergoes a series oа срhanges. The major DNA-packaging proteins, the histories, undergo a series of chemical modifications at functionally important sites. For example, levels of acetylatiort at selected lysine residues fall dramatically, while methylation at other lysines increases. These changes are put in place by spe-cific enzymes that are somehow targeted to the silent X. Furthermore, a histone variant, maсro-H2A, replaces a proportion of the usual H2A on the inactive X. Following these changes, there is DNA methylation of selected regions on the inactive X, Xi, a process often associated with long-term gene silencing. All these changes, and others, give the inactive X a very characteristic structure, often described as condensed, such that it is visible in the cell nucleus as a distinctive patch of dense DNA, now known as the Barr body. Over recent years, studies of X inactivation have provided crucial insights into fundamental epigenetic mechanisms of gene silencing and how patterns of gene expression are regulated through development. It can be confidently predicted that they will continue to do so.

Transient colocalozation of X-inactivation centres accompainies the initiation of X inactivation.
C.P.Bacher, M.Gugguari, B.Brors, S.Augui, P.Clere, P.Avner, R.Eils, E.Heard
Nature Cell Biol. - 2006. - V.8, No 3, P. 293-299

Локус Xic предопределяет сколько Х хромосом присутствует в клетке (счет) и какая Х хромосома будет инактивирована в женских клетках (выбор). Критические контролирующие последовательности в Xic включают некодирующие РНК Xist и Tsix и дальнодействующие хроматиновые элементы. С помощью FISH анализа было установлено, что два Xics временно колокализуются непосредственно перед инактивацией Х в дифференцирующихся эмбриональных стволовых клетках самок. Используя Xic трансгены, способные к импринтированной, но не случайной Х инактивации, было продемонстрировано, что колокализация Xic связана с функцией Xic при случайной Х инактивации. Как дальнодействующие последовательности, так и Tsix элемент, который генерирует антисмысловой транскрипт для Xist, необходимы для временного взаимодействия Xics. Предполагается, что временная колокализация Xics может быть необходима для клетки, чтобы предопределить количество Xic и гарантировать корректную инициацию Х инактивации.

The Polycomb group protein Eed protects the inactive X-chromosome from differenciation-induced reactivation S.Kalantry, K.C.Mills, D.Yee, A.P.Otte, B.Panning, T.Magnuson
Nature Cell Biol. V. 8, No. 2, P. 195-202, 2006


Polycomb group (PcG) кодирует ряд хроматин-модифицирующих белков. У эмбрионов мышей, кторые мутантны по PcG белку Eed инактивация Х хромосом нестабильна во внеэмбриональных тканях. Eed является компонентом гистон-метилтрансферазного комплекса, который участвует в стабильном молчании в недифференцированных клетках, благодаря своему накоплению на неактивной Х хромосоме в клетках ранних эмбрионов мышей и в стволовых клетках из внеэмбрионального клона трофэктодермы. Установлено, что неактивная Х хромосома в Eed-/- стволовых клетках трофобласта и в клетках трофэктодермы. происходящей из внеэмбриональной эктодермы, остается транскрипционно молчащей несмотря на отсутствие обусловленных PcG гистоновых модификаций, которые обычно характеризуют факультативный гетерохроматин неактивной Х хромосомы. Но обнаруживается реактивация неактивных Х хромосом, когда эти клетки дифференцируются. Эти результаты указывают на то. что PcG комплекс не нужен для поддержания транскрипционного молчания неактивной Х хромосомы в недиффенецировнных стволовых клетках, PcG белки, по-видимому, обеспечивают клеточную память путем предупреждения активации транскрипции факультативного гетерохроматина во время дифференцировки.


1 Introduction

1.1 The Advantages of Sexual Reproduction


Половое размножение общераспространено среди эукариот. Даже растения, которые могут реплицировать самих себя в точности путем поросли или отводков, часто имеют альтернативный способ половой репродукции. Довольно часто эволюция предоставляет возможное объяснение , что такое половое размножение вызывает необычайное увеличение генетического разнообразия, с которым может оперировать естественный отбор, делая возможными эволюционные изменения. Перетасовка аллелей, которая происходит в каждой половой генерации, может таким образом продуцировать популяцию, способную приспосабливаться к внешнесредовым сдвигам более эффективно, чем относительно гомогенная популяция, происходящая бесполым способом репродукции. Однако, пол усложняется у высших эукариот, приобретением онтогенетических путей, которые ведут к мужским и женским половым органам, а также к физиологическим и биохимическим аппаратами, необходимыми для мейоза, созревания зародышевых клеток, привлечения партнеров и спаривания (см Marshall Graves and Shetty 2001). Критической точкой и определенным измерением эволюционного успеха является то, что вариабельные популяции лучше способны избегать катастрофы окончательного исчезновения.

1.2 Methods of Sex Determination


Генетические механизмы для определения разных полов широко варьируют от одного организма к др. Простейшие системы используют одиночный локус, который является гомозиготным у одного из полов (гомогаметный пол) и гетерозиготрным у др. (гетерогаметный пол) (Fig. 1). Эта простая система используется разными способами, чтобы достичь разных уровней сложности у разных организмов. У некоторых действуют механизмы, которые супрессируют мейотическую рекомбинацию (кроссинговер) пол-детерминирующих аллелей у гетерогаметного пола (Fig. 1), степень, которая помогает предупредить генерацию смесей аллелей, приводящих к intersex состоянию. Во многих случаях неспособность рекомбинировать распространяется, включая часть или все гены одной хромосомы, что сопровождается потерей генетической информации. Эволюционное давление, которое управляет этой дегенерацией хромосомы всё ещё не понято, но конечный результат у многих видов заключается в том, что два пола обнаруживают различия не только по аллелям одного или немногих локусов, но по целым хромосомам. Это показано на простейшей диаграмме на Figure 1. У многих видов, включая наш собственный, самцы несут дегенеративную хромосому, хотя имеются и исключения.
Половая дифференцировка обычно запускается с помощью переключения on или off одного или небольшого количества критических генов во время развития. Продукты этих генов инициируют каскад генетических регуляторных событий, которые обеспечивают использование одного или др. пути детерминации пола (see Chapter 15 for details in Caenorhabditis elegans and Chapter 16 for details in Drosophila). У людей существует белковый продукт гена SRY на Y хромосоме, который запускает у ранних эмбрионов мужской путь полового развития (rev., see McElreavey et al. 1995). Механизм такого сорта не нуждается в крупных хромосомных различиях, чтобы оперировать успешно, так почему же все-таки такие различия часто возникают? Возможно, что



Figure 1. Evolution of the Y Chromosome Early in evolution the two sexes may have differed at only a single, autosomal locus with one sex (designated proto-male) being heterozygous at this locus and the other sex (proto-female) being homozygous. The "male determining allele" is shown in yellow. If mating requires one member of each sex, then individuals homozygous for the male-determining allele cannot arise. At this early stage, physiological differences between the sexes will be subtle, comparable to those that distinguish the two mating types in yeast. To prevent the formation of intersex states, crossing-over will be suppressed within and around the male-determining locus (the suppressed area is shown as dark). Mutations will accumulate within this region because suppression of crossing-over will reduce their ability to spread through the population and, hence, the selection pressure against them. The degenerate region in which crossing-over is suppressed will gradually expand ("Muller's ratchet") until the chromosome has lost most of its active, functional genes. A small, active region must remain that is homologous to the X chromosome in order to allow pairing and crossing-over at meiosis. This is the pseudoautosomal region (PAR). The autosome originally homologous to the future Y (A in the diagram) will itself evolve, largely through translocations from other autosomes, eventually forming the distinctive X chromosome. The X, like other chromosomes, is a mosaic of DNA fragments put in place at different periods through evolution; some of these are ancient and some are relatively recent. This is illustrated by the differently patterned patches on the proto-X and X chromosomes. On the human X, the more recent arrivals are enriched in genes that escape X inactivation.

они оказываются побочным продуктом супрессии кроссинговера, необходимой для предотвращения intersex состояний (Fig. 1). Математический анализ факторов, которые влияют на распространение аллелей в популяциях, показывает, что супрессия кроссинговера должна приводить неминуемо к постепенному накоплению вредных мутаций (вообще-то даже мутаций, которые вызывают дальнейшую супрессию кроссинговера). Это д. приводить к прогрессивной дегенерации одной из двух исходно гомологичных хромосом (Fig. 1). Процесс был назван "Muller's ratchet" в честь генетика, который впервые предложил его. Не существует отбора по этой возможности, он как раз происходит как следствие инициальной ступени адаптации двухполой стратегии репродукции (Chariesworth 1996 and references therein). Безотносительно эволюционного управления, лежащего в основе дегенерации хромосомы, остается фактом, что она происходит (и вполне возможно продолжается) как потребность коэволюции механизмов отлаживания с основными хромосомными различиями между членами одного и того жe вида. Это обеспечивается с помощью механизмов дозовой компенсации.

1.3 Chromosomal Methods of Sex Determination Create a Need for Dosage Compensation


У млекопитающих и дрозофилы самцы имеют по одной копии каждой половой хромосомы, X и Y, тогда как самки имеют две копии Х. В обеих группах организмов Y бедна генами и в основном гетерохроматиновая. Она содержит немногие гены, необходимые для развития и плодовитости самцов. Напротив Х крупная богатая генами хромосома. Двухкратное различие в количестве копий, если они остаются не скорректированными, д. давать в результате двухкратные различия во внутриклеточных концентрациях продуктов нескольких тысяч генов между полами. Это не является неожиданностью, что эволюция не может не реагировать на такие массивные различиям между членами одного и того же вида. Вместо этого она развивает пути элиминации различий посредством механизмов дозовой компенсации.
В обобщенных терминах существует три пути, с помощью которых уровни Х-сцепленных генных транскриптов могут выравниваться между гетерогаметным и гомогаметным полом. Возможно (1) выключение генов на одной из двух Х хромосом самок, (2) удвоение скорости транскрипции генов с одиночной Х самцов и (3) снижение вдвое скорости транскрипции каждой из двух Х хромосом самок. Конечный результат (2) и (3) способов один и тот же, гены одиночной Х хромосомы самцов транскрибируются вдвое быстрее по сравнению с эквивалентными генами двух Х самок, но используемые пути достижения этого состояния фундаментально отличны. Идентифицированы примеры всех трех механизмов. Млекопитающие используют первый, Drosophila второй (Chapter 16), a черви C. elegans третий (Chapter 15). Фактически используются три очень разных механизма дозовой компенсации, по-видимому, независимо, это подтверждает важность конечной цели, а именно выравнивание уровней Х-сцепленных продуктов генов между полами (for review, see Marin et al. 2000). Соотв. мутации, которые нарушают дозовую компенсацию у любого из этих организмов летальны у затронутого пола.

1.4 Identification of an Inactive X in Mammalian Females


В 1949, Barr и Bertram описали тельца полового хроматина, структуры, видимые при световом микроскопе в ядрах клеток самок (но не самцов) у разных видов млекопитающих (see title page figure). Структура оказалась пригодной при изучении половых аномалий (Ohno 1967), установлено, что эти структуры происходят из одной из двух Х хромосом самок. В 1961 Mary Lyon описала генетические эксперименты по экспрессии Х-сцепленных генов окраски шерсти у самок мышей. Для объяснения паттернов наследования этого изменчивого лоскутного (мозаичного) окраса шерсти у индивидуальных самок мышей Lyon предположила, что в каждой клетке самок одна из двух Х хромосом стабильно инактивирована в раннем развитии (Lyon 1961). Тельца полового хроматина, сегодня известные как тельца Барра, т.о., являются цитологическим проявлением неактивной Х хромосомы. Элегантные эксперименты с использованием кожных фибробластов от самок, гетерозиготных по полиморфизму Х-сцепленного энзима glucase-6-phosphate dehydrogenase (G6PD), показали, что только один из двух возможных аллелей экспрессируется в колониях, растущих из индивидуальных клеток (клоны), демонстрируя тем самым наследуемость неактивного состояния от одного клеточного поколения к следующему (Davidson et aL 1963) и подтверждая существование инактивации Х у женщин (Beutler et aL 1962). Дальнецшие исследования инактивации X у женщин с множественными копиями X (с таким кариотипами как 47XXX или 48XXXX) показали, что все избыточные Х хромосомы инактивируются. Это было обобщено в виде правила "n-1 rule," которое утверждает, что если индивид имеет несколько Х хромосом, то n-1 д. инактивироваться (Ohno 1967). Это правило объясняет необыкновенно слабые клинические симптомы, связанные с анеуплоидиями Х хромосом. Гипотеза Х-инактивации продолжает предоставлять объяснения для особенностей экспрессии Х-сцепленных генов в клетках самок и остается в основном неизменной с момента её выдвижения. Последние 40 лет или около того были проведены исследования молекулярных механизмов, с помощью которых она оперируют.

2 Key Concepts


2.1 X Inactivation Is Developmentally Regulated


Инактивация Х у самок млекопитающих регулируется онтогенетически. Обе Х хромосомы активны у ранних зигот (Epstein et al. 1978), a инактивация осуществляется по мере клеточной дифференцировки. Обычно существует равная вероятность, что клетка инактивирует материнского или отцовского происхождения Х хромосому (Xm и Xp, соотв.). Исключением из этого является импринтированная Х инактивация, которая происходит у сумчатых и у ранних преимплантационных эмбрионов мышей, когда всегда инактивируется Xp. В последнем случае импринтируемая инактивация Xp сохраняется в первых клонах, чтобы дифференцировать их, а именно в extraembryonic trophectoderm (TE) и primitive endoderm cells (PE), но неактивная X реактивируется в клетках inner cell mass (ICM), чтобы дать эмбрион. Реверсия инактивации Х также происходит в развивающихся primordial germ cells (PGCs), гарантируя, что Х хромосома снова активна в гаметах. Figure 2 иллюстрирует цикл инактивации и реактивации Х у самок мышей.

2.2 Chromosome Silencing Involves Multiple Levels of Epigenetic Modification


Молчание Х хромосомы достигается на уровне структуры хроматина путем модификации гистоновых хвостов, включения или исключения вариантов гистонов и метилирования ДНК богатых CpG островков, всё это вносит вклад в стабильную структуру гетерохроматина. Слои эпигенетической модификации устанавливаются прогрессивно в ходе онтогенеза (Section 4.4). Итак, они гарантируют стабильное распространение неактивной Х через многочисленные раунды клеточных длений.
Вклад индивидуальных модификаций варьирует как во времени, так и в разных клонах. Напр., высокие уровни H3K27me3 (trimethylation of histone H3 at lysine 27) необходимы на Xi во время раннего развития, но не позднее, в соматических клетках. Напротив, метилирование CpG островков необходимо только в позднем развитии или не нужно совсем в клетках трофэктодермы.

2.3 Some Genes Escape X Inactivation


Инактивация Х затрагивает большую часть Х хромосомы, но некоторые гены избегают молчания. Сюда входят гены внутри небольшой области на Х хромосоме, которая спаривается с Y хромосомой во время мейоза у самцов, обозначается как pseudoautosomal (PAR) или XY спаривающаяся область (Fig. 1). Гены, расположенные в этом регионе, не нуждаются в дозовой компенсации, т.к. обе копии присутствуют как у самцов, так и у самок. Др. исключения, как с, так и без Y-сцепленных гомологов, также были охарактеризованы. Недавнее исследование продемонстрировало, что приблизительно 15% генов на Х хромосоме человека избегает Х инактивации (Carrel and Willard 2005). Интересно, что многие из этих генов расположены на коротком плече хромосомы (обозначаемом как Xp), который был приобретен Х хромосомой сравнительно недавно в смысле эволюционного времени. Исследования мышей показали, что избегание может начинаться в уже инактивированных в раннем онтогенезе генов с прогрессивной реактивацией, происходящей в ходе развития (Section 4.6). У сумчатых большинство изученных генов избегает Х инактивации до определенной степени. Это может отражать неспособность поддерживать молчание в ходе онтогенеза, возможно это связано с отсутствием метилирования CpG островков на Xi у этих видов (see Section 4.7 for more detail).

2.4 X Inactivation Is Regulated by a Master Switch Locus, the X-lnactivation Center


Классические генетические исследования продемонстрировали, что инактивация Х обеспечивается с помощью одиночного цис-действующего локуса главного выключателя, обозначаемого как X-inactivation center (Xic). Xic как было установлено, необходим для молчания Х хромосомы в цис-состоянии и для гарантии корректной и соответствующей инициации случайной инактивации Х. Недавние исследования охарактеризовали Xic на молекулярном уровне. Локус продуцирует крупную некодирующую РНК, названную Xist (X inactive specific transcript), которая обладает уникальными свойствами связываться в цис-положении и накапливаться вдоль всей длины хромосомы, с которой она транскрибируется (see Fig. 3) (Brown et al. 1991, 1992; Brockdorff et al. 1992). Покрытие хромосомы Xist РНК обеспечивает запуск молчания Х хромосомы (Lee et al. 1996; Penny et al. 1996; Wutz and Jaenisch 2000). Исследования показали, что это происходит, по крайней мере частично, благодаря Xist-обеспечиваемому рекрутированию хроматин-ремоделирующих комплексов (Fig. 3).
Вторая некодирующая РНК, Tsix также располагается в Xic регионе (Lee et al. 1999) и играет ключевую роль в регуляции экспрессии Xist. Tsix перекрывается с геном Xist, но она транскрибируется в антисмысловом направлении, отсюда её название, которое означает Xist запись в обратном порядке!

3 Initiation of X Inactivation


3.1 Imprinted Versus Random X Inactivation


Решение инактивировать Х хромосому тонко регулируется. Мужские клетки д.б. лишены молчания на своей единственной Х хромосоме, а женские клетки д.б. лишены молчание обеих Х хромосом или обе Х д. удерживаться активными.



Figure 2. The Cycle of X Inactivation and Reactivation The X chromosome undergoes a cycle of X inactivation and X reactivation during development. Red arrows indicate X-inactivation steps, and green arrows indicate X-reactivation steps. Inactivation first occurs in early preimplantation embryos (imprinted X inactivation) and subsequently in cells of the epiblast at the time of gastrulation (random X inactivation). The inactive X is reactivated in inner cell mass (ICM) cells when they are first allocated at the blastocyst stage, and also in the developing germ cells.

Оперируют два разных способа регуляции. Импринтируемый способ Х инактивации заставляет молчать Х хромосому отцовского происхождения. При случайном способе инактивации каждая клетка обладает равной вероятностью инактивировать либо материнскую либо отцовскую Х хромосому. Metatherian млекопитающие (сумчаты) используют только импринтированный способ. Eutherian (плацентарные) млекопитающие, по крайней мере в некоторых случаях, используют импринтрированный способ во внеэмбриональных клонах и случайный способ в собственно эмбрионе (Fig. 2). Имеются некоторые указания, что у людей встречается только случайная инактивация X, но этот вопрос остается нерешенным.

3.2 Regulation of Imprinted X Inactivation


Инактивация отцовской импринтированной Х впервые обнаружена у сумчатых (Sharman 1971). Затем Takagi and Sasaki (1975) продемонстрировали импринтированное инактиврование Х во внеэмбриональных TE и PE клонах мышиных эмбрионов. Значит родительской происхождение Х, управляет её статусом; т.е. отцовская, но не материнские Х хромосомы инактивируются независимо от того сколько Х хромосом или наборов хромосом присутствует. Отметим, что одиночная X у XY самцов всегда материнского происхождения и следовательно, не инактивиаруется в импринтированной ткани.
Какова же природа imprint? Исследования экспрессии Xist, которая регулирует в цис-положении инактивацию Х, показали, что имеется репрессивный импринт на Xm аллеле у эмбрионов мыши (see Fig. 4). Этот импринт предупреждает экспрессию Xist, удерживая Х хромосому активной. Эксперименты по ядерному переносу продемонстрировали, что репрессивный Xist imprint устанавливается во время созревания ооцита (Tada et al. 2000). Молекулярная основа импринта неизвестна, но метилирование ДНК не нужно, что контрастирует со многими др. импринтируемыми генами (see Chapter 19 for details on genomic imprinting).
Одна теория предпочтительной инактивации Xp в зиготе заключается в том, что происходит перенос молчания с XY бивалента, которое устанавливается во время стадии пахитены мейоза у самцов (meiotic sex chromosome inactivation, MSCI) (Huynh and Lee 2003). Недавние исследования говорят против этого. Во-первых, MSCI как было показано является самостоятельным и Xist-независимым механизмом, который запускается в пахитене присутствием неспаренных хромосомных регионов как на половых хромосомах, так и аутосомах (Turner et al. 2005 and references therein). Во-вторых, анализ экспрессии ряда Х-сцепленных генов



Figure 3. Progressive Chromosome-wide Heterochromatinization Induced by Xist RNA When the Xist gene is expressed, the RNA binds to and coats the X chromosome from which it is transcribed (green clashed line). Xist RNA is thought to trigger silencing of the chromosome by recruiting chromatin-modifying activities (red and yellow circles). The initial wave of silencing in turn leads to recruitment of additional layers of epigenetic modification (gray circles), further stabilizing the heterochromatic structure. Establishment of these different levels of epigenetic silencing is achieved in a stepwise manner through development and ontogeny. Localization of Xist RNA along the X chromosomes is shown by in situ hybridization in both interphase and metaphase.

в ранних зиготах показал, что молчание Xp происходит de novo в ответ на экспрессию зиготической Xp Xist (Okamoto et al. 2005 and references therein).
Отцовская экспрессия Xist (и возникающее в результате молчание Xp), которая начинается с началом зиготической активации генов (на 2-4-клеточной стадии) указывает на то, что Xp Xist аллель готов к экспрессии (Fig. 4). Однако, в соматических тканях самцов Xist всегла репрессирован, отсюда следует, что зародышевые клетки самцов д. каким-то образом ремоделировать Xist локус. В согласии с этим наличие регион-специфического деметилирования CpG сайтов в промоторе Xist во время сперматогенеза (Norris et al. 1994).
У эмбрионов с анеуплоидией Х хромосом родительские импринты, управляющие экспрессией Xist, вызывают несоответствующие паттерны Х-инактивации во время раннего развития. Это происходит также у андреногенетических и гиногенетических (или партеногенетических) эмбрионов, у которых оба набора хромосом происходят или от отца или от матери, соотв. Хотя это в целом причиняет вред жизнеспособности эмбрионов, некоторые эмбрионы выживают, по-видимому, корректируя несоотв. паттерны Х-инактивации, чтобы гарантировать, что единственная активная Х хромосома будет присутствовать во всех клетках. Это как полагают осуществляется за счет преодоления (overriding) импринта с помощью механизма, который обычно регулирует случайную инактивацию Х (see below).
Ген Tsix, антисмысловой регулятор Xist, необходим для импринтируемой Х инактивации, т.к делеция главного промотора вызывает у ранних эмбрионов летальность, если передается с помощью материнской, но не отцовской гаметы (Lee 2000). Летальность, по-видимому, обусловливается несоотв. экспрессией Xm Xist; т.e., неспособностью поддерживать активную Х хромосому как у XmY, так и XmXp эмбрионов. Пока неясно, является ли экспрессия Tsix РНК первичным импринтом или функционирует позднее, поддерживая импринт.

3.3 Regulation of Random X Inactivation-Counting


При случайном способе инактивации Х клетки используют n-1 правило, когда все Х хромосомы за исключением одной инактивируются на диплоидный набор хромосом. Выбор, какая их X будет молчать (или сохранится активной) в основном случаен, хотя имеются факторы, которые могут влиять на это (see Section 3.4). Регуляция Xist при случайной инактивации Х тонко контролируется. Исследования показали, что XX embryonic stem (ES) клетки начинают дифференцироваться только , если экспрессируют одиночный Xist аллель, тогда как XY клетки никогда не инициируют его экспрессию.
При анеуплоидии Х хромосом и полиплоидии эмбрионов мышей исход случайной и импринтипрованной инактивации X различен. Простейшей иллюстрацией этого являются X0 эмбрионы. При импринтированной X инактивации, XmO эмбрионы нормальны, а XpO эмбрионы отстают, т.к. клетки пытаются инактивировать свою единственную Х хромосому, тем самым подвергают риску развитие внеэмбриональных тканей. При случайной инактивации Х клетки считают свои количества Х хромосом (подчиняясь n-1 правилу) и



Figure 4. Xist Gene Regulation in Early Development The figure illustrates current knowledge and models for imprinted and random Xist regulation in early XX mouse embryos. The Xm Xist allele arrives in the zygote with a repressive imprint, possibly mediated through the antisense Tsix locus (black square). The Xp allele is primed to be active and is expressed as soon as embryonic gene activation occurs at the 2-cell stage. From 2-cell up until morula stage, Xp Xist is expressed in all cells (expression indicated by open rectangle and arrow at 5' end). This pattern is maintained at the early blastocyst stage and subsequently in TE and PE cells and their fully differentiated derivative tissues. In the late blastocyst ICM, Xist expression is extinguished, possibly by an ICM-specific repressor factor (blue triangle). Xist expression then commences subsequently at the time of gastrulation. Here the blocking factor (black diamond) ensures that Xist expression cannot occur on one of the two alleles (counting).

сохраняют одну Х хромосому активной, независимо от того она Xm или Xp, и поэтому не повреждаются. При случайном способе инактивации Х необходимо. чтобы клетки имели способ определять количество присутствующих Х хромосом, что часто обозначается как "счёт". Популярная модель, объясняющая счет это Rastan's blocking factor модель (Rastan 1983). Она предполагает, что одиночный Xic (Xist аллель) блокируется во всех клетках тем самым оказывается активной Х хромосома. Дополнительные Xics (Xist аллели), там, геде они присутствуют, экспрессируются и т.о. индуцируют X инактивацию (Fig. 5). Модоль Rastan's указывает, что Х инактивация является default состоянием, что позволяет удерживать активной только одну Х хромосому. Хотя это кажется противоречащим смыслу, модель обладает существенными достоинствами по-видимому, объяснению большинства экспериментальных наблюдений. Природа блокирующего фактора, однако остается неизвестной.
Наше понимание механизмов, регулирующих экспрессию Xist и инициацию инактивации X существенно продвинулось после использования ES клеток, культивируемых in vitro. ES клетки, происходят из мышиных эмбрионов на стадии бластоциста, особенно из ICM (Fig. 4). Они остаются недифференцированными, если культивируются в сыворотке с добавлением leukemia inhibitory factor (LIF). Дифференцировка in vitro может быть запущена удалением LIF из культуральной среды и помещения клеток на чашки, сделанные из не слипчивого пластика. В этих условиях они округляются и агрегируют. чтобы сформировать эмбриоидные тельца, внутри которых они дифференцируются. спустя несколько дней, в различные типы соматических клеток. В недифференцированном состоянии XX ES клетки имеют две активные Х хромосомы. Когда клетки побуждаются к дифференцировке, то большинство клеток эмбриоидных телец подвергаются случайной инактивации Х. Напротив, экспрессия Xist и инактивация Х не происходят в дифференцирующихся XY ES клетках. ES клетки, т.о., представляют собой ценную модельную систему, т.к. они отвечают на генетические манипуляции по-видимому, генному таргетингу и могут быть изучены разные ступени процесса Х инактивации. Ключевым экспериментом явилась демонстрация, что делеция в 65-kb региона, локализованного непосредственно ниже Xist, приводит к тому, что аллель, экспрессируется Xist (и следовательно, инактивирует), даже в дифференцирующихся XY ES клетках (Clerc and Avner 1998). Значение этой находки в том, что делетированные последовательности необходимы для связывания предполагаемого блокирующего фактора. Дальнейшее вычленение области, ответственной за это, было достигнуто с использованием стратегии replacement targeting, позволяющей делетировать небольшие участки внутри 65 kb (see Fig. 6). Определение ключевых элементов и идентификация факторов, связывающих их, является главной целью будущих исследований.

3.4 Regulation of Random X Inactivation-Choice


При определенных условиях случайная инактивация Х может иметь отклонения. Это происходит или как результат отклонений в инициальном выборе, какая из Х будет неактивной ("первичная" неслучайная Х



Figure 5. The Blocking Factor Model for Random X Inactlvation The blocking factor mode) proposes that there is a factor (yetiow ckde) that blocks a single Xist allele (green box) in all cells such that at the onset of X inactivation that chromosome is protected from undergoing X inactivation. In male cells (o) there is only one allele present and the blocking factor always binds. In female cells (b) there is an equal probability that the blocking factor v^ bind either the Xm Xist allele (red) or the Xp Xist allele (blue). At the onset of X inactivation, only the unblocked allele will express Xist RNA (green dashed line). Different alleles of the X-inactivation center may have a greater or lesser affinity for the blocking factor such that in heterozygous females the factor preferentially binds one X chromosome. In some cases, this may underlie skewing in primary nonrandom X inactivation (see Fig. 7).

инактивация), или как результат выбора против клеток, которые сохраняют определенную Х активной ("вторичная" неслучайная Х инактивация) (Fig. 7). При первичной неслучайной X инактивации, на выбор влияют вариации цис-действующих последовательностей или мутации, которые затрагивают вероятность выбора данной Х в качестве активной/неактиной X у гетерозиготных животных. Согласно Rastan's модели блокирующего фактора, эти вариации могут проявлять свои эффекты путем изменения вероятности связывания блокирующего фактора с данным аллелем.
Прмером первичной неслучайной инактивации Х может служить X controlling element (Xce) у мышей. Xce является классически определяемым локусом, разные аллели которого, как было установлено, влияют на вероятность его Х хромосомы быть активной X у XX гетерозигот (Cattanach and Isaacson 1967). Эксперименты по генетическому картированию положения Xce показали, что он находится непосредственно ниже Xist (Fig. 6) и поэтому в правильном положении по отношению к затрагивающему связывание блокирующего фактора, что установлено делецией в 65-kb. Предстоит идентифицировать вариации подлежащих последовательностей.
Второй элемент, который может влиять на выбор у мышей является Tsix антисмысловой регулятор (Lee and Lu 1999). Предполагается, что это обеспечивается Tsix антисмысловой РНК, которая транскрибируется вдоль локуса Xist прежде инициации случайной инактивации Х (Fig. 6). Хромосома, несущая делецию промотора Tsix, предпочтительно инактивируется в XX клетках, подвергающихся случайной инактиваиции Х. Более слабые сдвиги от случайности наблюдаются в клетках с мутациями в энхансерных элементах (Xite элементы), которые могут управлять уровнями экспрессии Tsix. Хотя промотор Tsix расположен внутри области, определяющей предполагаемый сайт связывания блокирующего фактора, эксперименты по целенаправленным делециям не активировли Xist как default в XY ES клетках. Это указывает на то, что локусы не являются синонимными, но что делеция промотора Tsix делает сайты связывания для блокирующего фактора интактными.
Транскрипция Tsix сопровождается низко-уровневой транскрипцией Xist прежде инициации случайной инактивации Х, это указывает на то, что двунитчатая РНК (т.e., Tsix:Xist гибридные нити) могут оказывать влияние на выбор. В согласии с этим увеличение уровня смысловой транскрипции вдоль Xist промоторов противодействует репрессивному эффекту Tsix и дает в результате аллель, который менее вероятно будет активным X в гетерозиготных XX клетках (Nesterova et al. 2003). Итак, все разные Xic элементы, как известно влияющие на инициацию случайной и импринтированной Х инактивации, часто описываются в связи во своей способностью влиять на функции счета и/или выбора, как показано на Figure 6.

3.5 Switching Modes of Inactivation in Early Embryogenesis


Как ранние эмбрионы мышей побуждаются к переключению от импринтированного к случайному способу регуляции? До недавнего времени полагали, что в обоих случаях инициация Х инактивации связана с клеточной дифференцировкой (Monk and Harper 1979). Так, считалось, что клоны трофэктодермы и первичной энтодермы инактивируют Xp в ответ на родительские импринты на Xist, когда они впервые дифференцируются на стадии бластоциста, тогда как клетки ICM, которые дают собственно эмбрион, считалось первыми стирают Xist импринт и затем подвергаются случайной Х инактивации, когда они дифференцируются в три зародышевых листка на ст. гаструляции.



Figure 6. Genes and Regulatory Elements In the X-lnactivation Center Region The key region regulating X inactivation h shown In green. Flanking genes are shown m gray: Arrows indicate promoters for the Xist (sense) and Tsix (antisense) genes. The extents of the respective noncoding RNAs are indicated with dashed green lines. Regulatory elements controlling Tsix expression, Xite and DXPas34, are indicated in black. Regions and loci involved in X-chromosome choice and X-chromosome counting are indicated above.

Более недавние данные, однако, продемонстрировали, что инактивация Xp происходит до начала клеточной дифференцировки у эмбрионов ст. дробления и что это происходит во врех клетках, включая предшественников ICM (Mak et ai. 2004; Okamoto et al. 2004). Т.о., импринтированная инактивация X в трофэктодерме и первичной энтодерме является реликтовым паттерном Х инактивации, устанавливаемым у ранних дробящихся эмбрионов. ICM клетки тем самым побуждают программу ревертации этой инициальной волны импринтированной инактивации Xp, тем самым закладывается сцена для последующей случайной инактивации Х (see Fig. 4). База для реверсии инактивации Xp неизвестна, но она может использовать ICM-специфическую программу, которая репрессирует Xp Xist экспрессию (see Section 5).

4 Propagation and Maintenance of the Inactive Stele


4.1 Xist RNA, Gene Silencing, and Heterochromatin Assembly


Что же делает ген Xist? Имеются строгие доказательства, что ген Xist и его РНК продукт осуществляют как переключение, которое инициирует X инактивацию в цис-положении, так и средством, с помощью которого молчание распространяется по хромосому. Доказательства показывают: (1) Xist является уникальным в поддержании экспрессии только с Xi, (2) Уровни Xist РНК драматически увеличиваются у преимплантационных эмбрионов во время инактивации Х, (3) Позитивная регуляция Xist предшествует инактивации X, и, по-видимому, абсолютно необходима для её появления, (4) Xist РНК колокализуется с Xi в интерфазных ядрах и распределяется вдоль одной из двух метафазных Х хромосом (see Fig. 3), и (5) Xist-содержащие трансгены, если они вставляются в аутосомы, могут индуцировать, по крайней мере некоторые из признаков неактивного хроматина. (Избыточная)экспрессия приводит к покрытию аутосомы в цис-положении и параллельной адаптации сходной с гетерохроматином структуры транскрипционной молчащего хроматина (Heard et al. 1999 and references therein). Эти находки подтверждают, что Xist РНК необходима и достаточна для запуска образования гетерохроматина и транскрипционного молчания. Однако, продолжение экспрессии Xist не является необходимым для поддержания Х инактивации. Напр., human:rodent гибридах соматических клеток, где экспрессия Xist теряется на человеческой Xi хромосоме, которая сохраняется на генетическом фоне грызунов, молчание Х-сцепленных генов поддерживается (Brown and Willard 1994).
Важно отметить, что ассоциация Xist РНК с Xi избирательна. Она не обнаруживается вдоль PAR, которая остается активной и эухроматиновой, или на конституитивном (центрическом) гетерохроматине. Более того, анализ метафазных хромосом демонстрирует полосо-образную локализацию, которая, по-видимому, коррелирует с богатыми генами G-light дисками (see Fig. 3) (Duthie et al 1999). Эти наблюдения показывают, что Xist РНК покрывает только определенные области хроматина.
Механизм(ы), с помощью которых Xist РНК осуществляет изменения в структуре хроматина, и ассоциированное с этим молчание генов, всё ещё не понятны в деталях. Известно, что разные области Xist РНК молекулы ответственны за генное молчание и распределение вдоль Х хромосомы. Эксперименты с индуцибельной системой экспрессии Xist в ES клетках мышей, в которых функции Xist молекул, несущих определенные делеции, могут быть тестированы, показали, что молчание может быть приписано законсервированным повторяющимся последовательностям на 5' конце молекулы, тогда как покрываение Х обеспечивается за счет последовательностей разбросанных по остальной части молекулы (Wutz et al. 2002).

Figure 7. Models for Nonrandom X Inactivation Primary nonrandom X inactivation refers to skewing of the initial choice of which X chromosome is inactivated. Theoretically, this could occur in heterozygous females where there is a bias in the probability of the two alleles binding the blocking factor. In secondary nonrandom X inactivation, the choice of which X is inactivated is random, but cell selection events result in progressive loss of cells inactivating one of the two X chromosomes. For example, where there is a deleterious mutation on one X chromosome, cells that inactivate the other, wild-type X chromosome will be preferentially lost.

4.2 The Heterochromatic Structure of the Inactive X


С момента самых ранних исследований в световом микроскопе стало понятным, что Xi обладает признаками гетерохроматина. Подобно конституитивному гетерохроматину, найденному в и около центромер, Xi остается видимой и кажущейся конденсироанной в течение всей интерфазы (в виде телец Барра), а её ДНК обычно реплицируется позднее в S фазе. Xi скажем состоит из факультативного гетерохроматина. Однако, важно помнить, что ДНК конституитивного гетерохроматина обычно обогащена специфическими, повторяющимися сателлитными последовательностями, которые ответственны, по крайней мере частично, за её характерные свойства. ДНК Х хромосомы не обнаруживает такого обогащения, хотя она обнаруживает более легкие отличия в специфических повторяющихся элементах, которые могут играть роль в процессе инактивации (see Section 4.5). Кроме того, хотя Xi хроматин часто описывается как "конденсированный", но тщательный микроскопический анализ и трехмерная реконструкция Xa и Xi хромосом, меченных X-специфическими ДНК зондами, подтверждает, что различия между ними больше вопрос формы, чем количества хроматина на единицу объема (Eils et al. 1996).
Дальнейшие параллели между Xi и конституитивным гетерохроматином получены в результате использования непрямой иммунофлюоресцентной микроскопии для изучения распределения гистоновых модификаций и вариантов как вдоль метафазных хромосом, так и в интерфазных ядрах. Факультативный гетерохроматин неактивной X хромосомы в клетках мышей и человека истощается по ацетилированному гистону H4 (Jeppesen and Turner 1993), и тем самым напоминает конституитивный, центрический гетерохроматин. Это стало первой демонстрацией того, что неактивная Х хромосома маркируется специфического типа гистоновой модификацией. Последующие эксперименты в нескольких лаб. подтвердили эти наблюдения и показали, что ацетилированные изоформы всех 4-х стержневых гистонов (H2A, H2B, H3 и H4) истощены как в конституитивном. так и факультативном гетерохроматине интерфазных и метафазных клеток (O'Neill et al. 2003 and references therein). В частности, как центрический гетерохроматин, так и Xi истощены по ди- и три-метилированным H3 в K4 (H3K4me2 и H3K4me3). Общепринято, что подобно ацетилированию, существуют маркеры транскрипционно активного или потенциально активного хроматина.
Ситуация становится более сложной, если рассматривать появление маркеров. ассоциированных с транскрипционным молчанием скорее, чем с исчезновением тех, что ассоциированы с транскрипционной активностью. Напр., ди- и три-метилированные H3 по K9 (H3K9me2/3) соответствуют меткам транскрипционно молчащих генов и часто обнаруживаются концентрирующимися в центрическом гетерохроматине с помощью иммунофлюоресцентной микроскопии (Lachner et al. 2003). Однако, из-за комбинации технических и биологических причин, их обогащение на Xi неопределенно. По этой причине, важность специфичности антител, обеспечивающих реальную иммунофлюоресценцию, необходимо подчеркнуть. Напр., лизины 9 и 27 из H3 являются как частью тетрапептида ARKS, так и антителами, созданными против одного, но могущего перекрестно реагировать с др. Такая перекрестная реакция д. быть строго исключена прежде чем интерпретировать результаты с уверенностью. Кроме того, используемая процедура иммунизации и используемый immunogen, влияют на детальные специфичности антисывороток. Напр., антисыворотка к H3K9me3, полученная к перекрестно связываемому пептиду, соединяется более сильно с модифицированным гистоном, когда он находится внутри гетерохроматиновой области, чем когда он внутри эухроматина (Maison et al. 2002). Антисыворотки, приготовленные таким образом являются ценными реагентами для изучения гетерохроматина, но не идеальны для количественных сравнений гетерохроматина и эухроматина. Наконец, отмечено, что усиленное иммунофлюоресцентное окрашивание в интерфазе может быть результатом просто более высокой плотности нуклеосом внутри гетерохроматина (Perche et al. 2000).
Тщательный анализ распределений гистоновых модификаций вдоль Xi в культивируемых клетках человека предоставяет дальнейшую информацию о сложности системы (Chadwick and Willard 2004). H3K9me3 и H3K27me3 оба обогащены в определенных, не перекрывающихся областях вдоль Xi. Т.о., в отличие от потери ацетилирования гистона, обогащение такими модификациями является региональным, а не всеобщим, свойством Xi. Интересно, что такие области, обогащенные H3K27me3, обнаруживаются также обогащенными по Xist РНК и варианту гистона macroH2A1.2 (Costanzi and Pehrson 1998). Как macroH2A1.2 может ассоциировать с Xi, и его возможная роль в процессе инактивации обсуждается в Section 4.4. Напротив, такие области Xi, которые обогащены H3K9me3, также обнаруживают увеличенные уровни гетерохроматинового белка HP1 (как известно. соединяющегося с метилированнными H3K9) и H4K20me3 (метки, также ассоциированной с конституитивным, центрическим гетерохроматином). Важно, что иммуноокрашивание телец Барра в интерфазных клетках обнаруживает те же самые паттерны ко-окрашивания, это указывает на то, что разные домены сохраняются в ходе клеточного цикла.
Возникает картина из комбинаций гистоновых модификаций, гистоновых вариантов, негистоновых белков и Xist РНК, взаимодействующих, чтобы сформировать хроматин с определенными свойствами транскрипционного молчания, репликации в поздней S фазе, возникновению конденсации и (возможно) ядерной локализации, которые характерны для Xi. Однако, точное функциональное значение определенных хроматиновых доменов Xi ещё предстоит установить. Важным и дей1ствующим наблюдением является то, что частота наблюдаемых доменов широко варьирует от одной клеточной линии человека к др. (Chadwick and Willard 2004). Это может быть не более чем подтверждением известной перекрываемости (redundancy) в системе инактивации Х (напр., как отмечалось ранее, молчание поддерживается в зрелых клетках даже когда Xist РНК утеряна), но это также предупреждает о том, что культивируемые клеточные линии, в частности иммортализованные, не всегда в точности и аккуратно указывают на то, что происходит в первичных тканях и определенно не на ранних стадиях развития.
Гистоновые модификации, ассоциированные с эухроматином и факультативном и конституитивным гетерохромтаином суммированы в Табл. 1. Итак, лишь метилирование H3K27 и убиквитилирование гистона H2A по лизину 119 (H2AK119ub) обнаруживаются в большом количестве на Xi, но не в конституитисном гетерохроматине (Plath et al. 2003; Silva et al. 2003; deNapofes et al. 2004; Smith et al. 2004).
Все модификации, приведенные в Table 1, ассоциируют с общей, гетерохроматиновой конформацией неактивной Х хромосомы и были идентифицированы с помощью иммунофлюолрресцентного анализа или метафазных хромосом или телец Барра в интерфазных клетках. Однако, локальные изменения гистоновых модификаций могут также играть важные роли на разных стадиях процесса инактивации Х. Такие изменения могут быть идентифицированы с помощью высоко-разрешающей микроскопии или с помощью chromatin immunoprecipitatkm (ChIP), чтобы картировать модификации, рассмотренные в Chapter 10? внутри или по соседству с критической
Table 1. Histone modifications characteristic of constitutive and facultative heterochromatin


Histone modifications that are enriched (+) or depleted (-) in constitutive and facultative heterochromatin, relative to euchromatin, are indicated. The = symbol indicates that the level of the modification is not detectably different from that in euchromatin. (me) methylation.
aApplies to all acetylatable lysines.
bEnriched in local "hot spots" but not overall.
cEnrichment is transient in some cell types.

областью Xic. Напр., крупный домен, распространяющийся на более чем 340 kb 5' гена Xist характеризуется гиперметилированием H3K9 в недифференцированных ES клетках. Гиперметилирование снижается по мере дифференцировки клеток и и происходит Х инактивация (Heard et al. 2001). Та же самая общая область хроматина обогащена метилированными H3K27 в ES клетках самок (Rougeulle et al. 2004), a сайты внутри неё обогащены ацетилированными H3 и H4 (O'Neffl et aL 1999). С начала исследований установлено до какой степени эти локальные модификации гистонов а области Xic являются ранними каузальными событиями, управляющими процессом Х инактивации или нижестоящих событий, которые (возможно существенные) компоненты инициации процесса ремоделировани я хроматина.
Конституитивный центромерный гетерохроматин обогащен метилированной ДНК, преимущественно 5'-methylcytosine в CpG димерах (see Chapter 18). Это согласуется с его низким уровнем транскрипционной активности. Довольно неожиданно уровень метилирования CpG на Xi в целом не достоверно выше, чем в остальной части генома. Однако, специфические CpG островки, ассоциированные с молчащими генами высоко метилированы, а экспреиментальные доказательства подтверждают, что метилирование ДНК играет важную роль в стабилизации неактивного состояния. Т.о., мыши, лишенные энзимов, которые или метилируют ранее немодифицированные CpGs (de novo DNA methyltransferases, Dnmta и Dnmtb) или поддерживают модификации ранее модифицированных остатков (поддерживающий энзим, Dnmtl), инициируют и устанавливают случайную инактивацию Х нормальным способом (Sado et al. 2000,2004). Однако, гены на гипометилированных Xi у таких мутантных мышей более легко реактивируются, чем на Xi у животных дикого типа с нормальными уровнями метилирования (Sado et al. 2000).

4.3 The Enzymology of Histone Modifications on Xi


Энзимы, ответственные за деацетилирование стержневых гистонов (HDACs) во время Х инактивации или за деметилирование H3K4, пока неизвестны. Т.к. ингибитор деацетилазы trichostatin A (TSA) может предупреждать или, по крайней мере, задерживать, появление деацетилированных Х в дифференцирующихся ES клетках самок, то разумно предположить, что HDACs участвуют (O'Neill et al. 1999). Однако, мы не знаем, какой из 11 классов I и II HDACs скорее всего ответственен (энзимы класса III не ингибируются с помощью TSA). Мы также не знаем механизм. ответственный за удаление метилирования H3K4. Энзимы. способные к удалению метильных групп с H3K4 при mono- или di-methylated состояниях идентифицированы лишь недавно, а энзимы, способные деметилировать H3K4 tri-methylated состояние ещё предстоит открыть. На данной стадии мы не можем исключить, что метилирование H3K4 и/или деацетилирование гистонов исчезают из Xi за счет замещения гистонов или пассивно за счет репликации ДНК.
Сегодня мы знаем больше об энзимах, ответственных за пуск гистоновых модификаций в соотв. местах. Метилирование H3K27 осуществляется с помощью Ezh2/Enxl, гомолога Drosophila polycomb-group (PcG) белка, энхансера zeste (E(Z)) (Silva et al. 2003). E(Z) является гистоновой methyl-transferase (HKMT), которая функционирует в PRC2 PcG комплекса (see Chapter 11). PRC2 рекрутируется на Xi во время дифференцировки ES клеток с той же самой кинетикой, что и метилирование H3K27. Интересно, что PcG белки также участвуют в ubiquitylation H2A по лизину 119 на Xi. В особенности RinglA/RinglB белок, стержневой компонент PRC1 PcG комплекса, функционирует как E3 лигаза для H2A ubiquitylation. Делеция RinglA и RinglB ведет к потере H2A ubiquitylation как на Xi, так и по всему геному (de Napoles et al. 2004).

4.4 The Order of Events That Leads to X Inactivation; ES Cells as a Model System


ES клетки мышей представляют собой неоценимую модельную систему для изучения динамики инактивации Х хромосомы. Повышенные уровни Xist РНК и ею покрытие одной Х хромосомы являются первыми обнаружимыми в высокой пропорции клеток спустя 1-2 дня после дифференцировки. Имеются доказательства, что играют роль как транскрипционные, так и посттранскрипционные механизмы в усилении активности Xist (Panning et al. 1997; Sheardown et al. 1997; Rougeulle et aL 2004). Xist однако, транскрибируется с обеих Х хромосом в недифференцированных ES клетках самок и с одиночной Х в ES клетках самцов, но РНК продукт быстро деградирует и лишь небольшие количества обнаруживаются по соседству с Xist локусом. Получены доказательства, что по мере осуществления дифференцировки происходит стабилизация Xist РНК на одной из двух Х хромосом в клетках самок (Panning et al. 1997; Sheardown et al. 1997). Механизм, который лежит в основе этой ступени избирательной стабилизации РНК остается неясным, также как и его вклад в общее увеличение Xist РНК и покрытие хромосомы в цис-положении.
Ряд ступеней Х инактивации, как было установлено, происходит одновременно с началом накопления Xist РНК в дифференцирующихся XX ES клетках. Сюда входят рекрутирование PcG белков и ассоциированное метилирование H3K27, H2A monoubiquitylation, деацетилирование H3K9 и потеря метилирования H3K4 (Heard et al. 2001; Silva et al. 2003; de Napoles et al. 2004; Rougeulle et al. 2004). Глобальное деацетилирование гистонов относительно позднее событие, происходящее на 3-5 день в большинстве клеток и следовательно, скорее всего участвует в поддержании и/или стабилизации неактивного состояния скорее, чем в его инициации (Keohane et al. 1996). Такая интерпретация предполагает, что паттерны ацетилирования в промоторах индивидуальных генов, подвергающихся инактивации, отражает паттерн, определеяемый с помощью иммунофлюоресцентного анализа целых хромосом или крупных доменов. Инициальные исследования с помощью ChIP подтвердили, что это происходит в самом деле, но необходимы дальнейшие эксперименты для большого количества генов (O'Neill et al. 2003).
Накопление варианта гистона macroH2A1.2 на Xi происходит значительно позднее во время дифференцировки XX ES клеток (Mermoud et al. 1999). Этот вариант гистона имеет свяше 200 дополнительных аминокислот на своем С-теминальном хвосте и несколько аминокислотных замен по всей молекуле. Интересно, что экспрессия Xist РНК необходима для поддержания macroH2A на Xi в соматических клетках (Csankovszki et aL 1999), но недостаточна для рекрутирования macroH2A на ранних стадиях дифференцировки (Mermoud et al. 1999; Wutz et al. 2002).
Избирательное метилирование ДНК на Xi является даже более поздним событием в ES клетках. CpGs, которые, как известно, высоко метилированы на Xi в клетках взрослых, не становятся метилированными в ES клетках самок вплоть до момента более поздней дифференцировки, 14-21 день (Keohane et al. 1996). Это согласуется с результатами в собственно развивающемся эмбрионе (Lock et al. 1987)и с идеей, что метилирование ДНК ответственно за стабилизацию или запирания, неактивного состояния скорее, чем инициацию и распространение.
Т.о., возникает картина скоординированной и тщательно регулируемой последовательности событий, с помощью которых изменения хроматина на Xi возникают по ходу развития (summarized in Fig. 8). Удивительно, что некоторые из этих изменений, напр., деацетилирование гистонов и метилирование ДНК, происходят после того, как клетки начинают прогрессировать по разным отличающимся путям дифференцировки. очевидно, что программа, ответственная за завершение X инактивации осуществляется независимо от др. программ клеточной дифференцировки. Однако, важно отметить, что некоторые аспекты случайной инактивации Х могут происходить только после начала дифференцировки. Напр., переключение на экспрессию Xist трансгенов в недифференцированных ES клетках запускает различные модификации гистонов, ассоциированные с гетерохроматинизацией, а также переход к репликации в поздней S фазе (Wutz and Jaenisch 2000),



Figure 8. Layers of Epigenetic Silencing Accumulate on Xi through Differentiation The diagram shows how five different epigenetic changes associated with transcriptional silencing are put in place on the inactive X chromosome at different stages of development and differentiation in both the developing embryo and ES cells in culture. In some cell types, methylation of H3K27 is transient, being seen only at early stages of differentiation and not in mature cells.

но отсутствует обнаружимое включение macroH2A; только после того, как клетки оказываются индуцированными к дифференцировке macroH2A колокализуется с Xist РНК на хромосоме, содержащей Xist трансген (Rasmussen et aL 2001). Ассоциация macroH2A с Xist-покрытым хроматином зависит от продолжающегося присутствия Xist РНК (Csankovszki et aL 1999), но не нуждается в транскрипционном молчании, т.к. она наблюдается также и когда хромосомы покрыты мутантной Xist РНК, лишенной регионов, необходимых для молчания (Wutz et aL 2002). Т.о., X инактивация может рассматриваться как конечный результат серии параллельных процессов, только некоторые из которых независимы.
Важно подчеркнуть, что определенные ферментативные комплексы или гистоновые модификации могут выполнять критические роли на определенных стадиях процесса инактивации Х, но могут становиться менее важными или избыточными позднее, вообще-то после более долговременных механизмов молчания, базирующихся на метилировании ДНК. Напр., метилирование H3K27, катализируемое с помощью PRC2, важно для успешной инактивации Х в раннем онтогенезе, но, по-видимому, бесполезно позднее.
Необходимо также отметить, что др. порядок событий может возникать во время установления импринтируемой Х инактивации у преимплантационных эмбрионов. Отметим, что обогащение H3K27me3 не выявляется сплоть до 16-клеточной стадии, значительно позднее, чем начало экспрессии Xist (2- до 4-клеточной стадии) (Mak et aL 2004; Okamoto et aL 2004). Это может указывать на потребность в специфических онтогенетически регулируемых кофакторах, чтобы рекрутировать PRC2 PcG комплекс на Xi.

4.5 Spreading of Silent Chromatin


XIC является существенным для инактивации Х и предполагается, что молчание распространяется от XIC, с проксимальными генами, становящимися молчащими раньше, чем более дистальные. Единственное объяснение этому, что Xist РНК распространяется прогрессивно вдоль хромосомы от места её синтеза. Это д. согласовываться с результатами экспериментов, в которых Xist трансгены вставляются в аутосомы и где покрытие аутосом Xist РНК ведет к молчанию генов и изменениям хроматина (see above). Распространение неактивного состояния от XIC интенсивно исследовалось на естественно возникших транслокациях X:аутосома. В самом деле, такие транслокации были критическими для демонстрации существования XIC (Rastan 1983). Хроматин, несущий характерные маркеры факультативного гетерохроматина (напр., потеря ацетилирования гистонов, поздняя репликация и транскрипционное молчание), как было показано, распространяется с Xi на аутосомную часть гибридной хромосомы (White et al. 1998; Duthie et aL 1999; Sharp et al. 2002). Это выявило важный принцип, что факультативный гетерохроматин не является исключительны для Х хромосом, это согласуется и с результатами Xist трансгенов, экспрессируемых на аутосомах. Однако, распространение молчащего хроматина вдоль аутосомных хромосомных плеч варьирует у разных транслокаций и ограничено по степени.
Имеются две модели для объяснения ограниченного распространения молчания в цис-сцепленные аутосомы. Во-первых, аутосомы могут быть резистентны к инициальному распространению Xist РНК и к ассоциированному генному молчанию в начале инактивации Х. Альтернативно, инициальное распространение на аутосомы может быть эффективным, но молчание может слабо поддерживаться в процессе онтогенеза, что обозначается как "spread and retreat". Доказательства в пользу spread and retreat, но две модели не являются взаимно исключающими и необходимы дальнейшие исследования. Необходимо заметить, что те клетки, в которых происходит экстенсивное молчание аутосом, могут отбираться во время раннего развития, из-за потеря экспрессии критических аутосомных генов. При некоторых X:аутосома транслокациях распределение является прерывистым, кажется, что пропускаются определенные регионы и транскрипционно активные, эухроматиновые области окружены молчащими гетерохроматиновыми областями (Sharp et al. 2002). Распространение конституитивного гетерохроматина в соседние эухроматиновые области, что ведет к мозаичному (variegation) эффекту положения у Drosophila (see Chapter 5), может обнаруживать сходное поведение. Такие наблюдения легче примирить с ранним механизмом клеточной селекции, базирующимся на spread и retreat молчания, чем с непрерывным распространением стабильного молчания.
Считается, что существуют элементы, распределяющиеся вдоль Х хромосомы, называемые "way stations," которые служат в качестве точек сбора гетерохроматина и тем самым повышают шансы распространения и/или поддержания Х инактивации (описано у Gartler and Riggs 1983). Эти элементы д. быть менее распространены или распределены менее регулярно на аутосомах. Предполагается, что обычное семейство разбросанных повторов, long interspersed repeats (LINES), является прекрасным кандидатом на роль элементов путевых станций (Lyon 1998, 2003). Эти повторяющиеся последовательности обычны для геномов человека и мыши, но особенно часты вдоль Х хромосомы. Более того, LINE элементы наиболее распространены среди наиболее конденсированных, бедных генами, G-banded регионов геномов человека и мыши, это подтверждает, что они edebv-то образом способствуют конформации хроматина, ассоциированной с транскрипционным молчанием. Недавнее завершение расшифровки ДНК последовательностей Х хромосомы человека выявили распределение LINE элементов, что хорошо согласуется с возможной ролью в качестве путевых станций, но идея остается недоказанной.

4.6 Escape from X-Chromosome Inactivation


Как было рассмотрено выше, ряд генов избегает инактивации. В механистических терминах избегание Х инактивации приписывается редкости путевых станций по соседству с этими генами или присутствием пограничных элементов, которые блокируют распространение Xist РНК и/или др. silencing компонентов. Имеются некоторые доказательства, что гены, которые изегают инактивации являются молчащими, по крайней мере, до некоторой степени, в раннем развитии. Напр., в случае мышиного гена Smcx, избегание инактивации варьирует в зависимости от стадии развития и типа ткани (Sheardown et al. 1996). Это, следовательно, наиболее согласуется с идеей spread and retreat, рассмотренной выше в контексте молчания аутосомных генов при X;A транслокациях.

4.7 X Inactivation hi Marsupial Mammals


Дивергенция плацентарных и сумчатых млекопитающих произошла около 130 миллионов лет назад. Сумчатые, подобно плацентарным, используют XY (male):XX (female) систему предопределения пола и механизм дозовой компенсации, в котором одна из ld[ { хромосом самок инактивируется. Как упоминалось выше, неактивная Х у сумчатых всегда является отцовского происхождения гомологом (Xp). Дальнейшие различия относительно плацентарных млекопитающих заключаются в степени генного молчания индивидуальных локусов, часто варьирующее в разных тканях. Имеются также некоторые доказательства, что нестабильность молчания увеличивается в ходе развития и онтогенеза. Это снова напоминает модель spread and retreat для замалчивания аутосомных локусов у плацентарных. Интересно, что обогащение LINE элементами X хромосомы происходит после дивергенции плацентарных и сумчатых, так что возможно, что нестабильность молчания на Х сумчатых также связана с идеей путевых станций. Более того, отсутствие метилирования в CpG островках, ассоциируемое с Х-сцепленными генами у сумчатых, может вносить вклад дополнительно в нестабильность Xi.
Относительно мало известно о молекулярном механизме Х инактивации у сумчатых и к тому же не идентифицирован у сумчатых гомолог XIST. Отсутствие XIST гомолога не отвергает, конечно, существование негомологичных РНК, которые выполняют ту же самую функцию, что и инициатор Х инактивации, но они пока не найдены. Лишь два свойства, которые недвухсмысленно общи неативным Х у плацентарных и сумчатых, что обе реплицируются поздно в S фазе и что обе маркированы низкими уровнями ацетилирования гистона H4 (Wakefield et al. 1997).
Учитывая летальность самцов для мутаций, которые разрушают дозовую компенсацию у др. организмов, включая др. млекопитающих, довольно неожиданно, что такое нарушение дозовой компенсации допустимо у сумчатых. Одно из возможных объяснений вытекает из того факта, что Х сумчатых несет меньше генов, чем её аналог у плацентарных (Graves 1996; Marshall Graves and Shetty 2001). Лишь гены длинного плеча Х плацентарных присутствуют на X сумчатых. Гены на коротком плече распределены среди аутосом у сумчатых. Большая часть Х сумчатых бедна генами и конституитивно гетерохроматиновая. Вообще-то такое уменьшение количества генов делает возможным для некоторых типов клеток переносить ослабление дозовой компенсации, пока не станет достаточно большой, чтобы позволить организму обходиться без дозовой компенсации в целом. Кроме того, сумчатые могут заставлять молчать Xi более эффективно в раннем онтогенезе, когда различия в дозе скорее всего наиболее критические, также как и в случае импринтированных локусов. Возможны два объяснения.

5 X-Chromosome Reactivation and Reprogramming
<

5.1 Stability of X Inactivation m Somatic Cells


Множественные слои эпигенетических модификаций вносят вклад в молчание инактивированной Х и как результат репрессированное состояние довольно стабильно. Иллюстрацией этого послужили ранние эксперименты, в которых наблюдали за способностью 5-azacytidine (5azaC), ингибитора метилириования ДНК, ревертировать молчание Х хромосомы в линиях ХХ клеток (Mohandas et al. 1981). Спорадическая реактивация индивидуальных генов происходит с низкой частотой. Однако, анализ клеточных линий, в которых данный ген реактивируется, выявил, что др. гены в целом остаются неактивными, как это делает и вся хромосома на цитогенетическом уровне. Сходные данные были получены с использованием TSA, чтобы ингибировать type I histone deacetylases (Csankovszki et al. 2001).
Спорадическая реактивация индивидуальных Х-сцепленных генов наблюдается во время старения у мышей. Это происходит даже чаще у сумчатых, у которых инактивация Х не столь стабильна и прогрессиваня реактивация происходит во время онтогенеза.
Какова же роль Xist РНК? Данные, полученные с использованием клеточных линий человека, показали, что потеря области Х хромосомы, соответствующей XIST, не приводит к обнаружимой реактивации Х (Brown and Willard 1994). Эти результаты были подтверждены на линиях мышиных фибробластов с использованием нокаута аллелей Xist (Csankovszki et al. 1999). Было установлено, что потеря Xist приводит к делокализации варианта гистона macroH2A из Xi. Более недавние исследования продемонстрировали, что гистоновые модификации, катализируемые PcG комплексами, триметилированием H3 lysine 27 и H2A ubiquitylation также теряются в линиях клеток фибробластов с условным нокаутом Xist (Plath et al. 2004). Редкая спорадическая реактивация индивидуальных генов была выявлена и которая ещё больше усиливалась воздействием SazaC или TSA. Однако, снова не наблюдалось драматической по всей хромосоме реактивации. Т.о., удаление множественных эпигенетических маркеров молчания всё ещё недостаточно для устранения молчания во всей хромосоме.
Избыточность механизмов молчания Xi в соматических клетках часто обозначается как "belts and braces" (пояса и подтяжки). Это указывает на то, что индивидуальные уровни эпигенетического молчания само-поддерживаются и делаются устойчивыми посредством взаимосвязанных механизмов позитивной петли обратной связи. Сходные механизмы наблюдаются в др. эпигенетических системах; напр., связанное поддержание метилирования гистонов и метилирования ДНК в перицентрическом гетерохроматине (see Chapters 9 and 18).

5.2 X Reactivation in Normal Development


В то время как инактивация Х в соматических клеток очень стабильна, имеются условия в ходе нормального развития, при которых вся Х хромосома реактивируется. Наиболее изученным примером является реверсия инактивированной Х в развивающихся primordial germ cells (PGCs). У мышей PGCs специфицируются приблизительно на 7-8 день развития, вскоре после гаструляции. В это время клетки эмбриона уже подверглись случайной Х инактивации. Затем развивающиеся PGCs мигрируют вдоль области задней кишки эмбриона и достигают генитального гребня, структуры, которая дает взрослые гонады. Это является моментом. когда XX PGCs реактивируют свою Xi (Monk and McLaren 1981). Это событие происходит одновременно с более общим эпигенетическим репрограммированием, которое включает стирание родительских импринтов и деметилирование ДНК всего генома (for more detail, see Chapter 20).
X реактивация в PGCs может указывать на специализированный механизм реверсии мультислойной гетерохроматиновой структуры. Исчезновение экспрессии Xist РНК коррелирует с реактивацией Х, но учитывая, что молчание является Xist-независимым в XX соматических клетках, вряд ли это является причиной. Возможно, что PGCs неспособны устанавливать все метки, ассоциированные с молчанием и являются поэтому более чувствительными к реактивации. Согласуется с этим доказательство, что метилирование CpG островков не происходит на Xi в развивающихся PGCs у мышей (Grant et al. 1992).
Вьлоым примером реактивации Х является возвращение импринтированной Xp инактивации во время распределения ICM клона у эмбрионов ст. бластоциста (Section 3.5), которая снова ассоциирована с событиями широкого геномного репрограмирования. Эта реактивация также коррелирует с угасанием Xist РНК и с потерей многих эпигенетических меток, ассоциированных с молчанием.

S3 X Reactivation during Experimental Reprogramming


Реактивация Х также наблюдается при определенных экспериментальных условиях. Она происходит во время переноса ядер соматических клеток в неоплодотворенные ооциты (Eggan et al. 2000) и после слияния соматических клеток с тотипотентными типами клеток, такими как ES, embryonic germ (EG), или embryonal carcinoma (EC) клетками (Tada et al. 2001).
Эксперименты на мышах продемонстрировали (Eggan et al. 2000) быструю реактивацию генных маркеров на Xi при переносе ядер стадии дробления. Несмотря на это ядро сохраняло некоторую память, о том, что Х была инактивирована, т.к. у клонируемых эмбрионов на плодной стадии Xi донорских клеток также была Xi в трофэктодермальных клетках плаценты. Напротив, клетки собственно эмбриона обнаруживали случайную инактивацию Х (see Fig. 9). По-видимому, X реактивация и репрограммирование, которые происходят в развивающейся ICM дают эмбриону воторой шанс перестроить эпигенетическую информацию с донорского ядра.
X реактивация при слиянии между XX соматическими клетками и плюрипотентными эмбриональными клетками изучена плохо. Предположительно она также происходит как результат воздщей2ствия соматического генома на факторы, присутствующие в EC, ES или EG клетках. Реактивация, как было продемонстрировано, происходит довольно быстро, в течение приблизительно 5 дней после слияния, высокий уровень экспрессии Xist затухает в слитых клетках после долговременного культивирования. Причинная связь этих событий не установлена.

S.4 Lessons from Inducible Xist Transgenes


Ряд экспериментов с использованием индуцибельных Xist трансгенов в ES клетках существенно увеличил наше понимание стабильности в противовес обратимости инактивации Х. Во-первых, было продемонстрировано, что Xist РНК может устанавливать инактивацию Х в недифференцированных ES клетках и во время каждой очень ранней стадии дифференцировки, но не позже (Wutz and Jaenisch 2000). Это обозначается как "window of opportunity." Эта способность клеток отвечать на Xist РНК широко коррелирует с обратимостью инактивации Х. Т.о., молчание обратимо, когда трансген выключался в ES клетках или во время ранней дифференцировки, но не во время поздней дифференцировки или в соматических клетках. Возвращение к реактивации Х и репрограммированию, данные по индуцибельному трансгену предполагают, что при определенных клеточных условиях, а именно, в недифференцированных ES клетках, X


Figure 9. Regulation of X Inactivation in Cloned Mouse Embryos The figure illustrates an XX donor cell with the inactive X chromosome (A) coated with Xist RNA (green line). In this model, transcription from the donor nucleus, including Xist RNA, is repressed by oocyte factors until the 2-cell stage, resulting in X reactivation. Recommencement of Xist expression then occurs at the 2-cell stage. Xist is then reexpressed, again from the inactive X allele from the donor cell. This would be attributable to retention of a mark such as DNA methylation at the Xist promoter. This pattern is maintained in cells allocated to the TE and PE lineages but not in pluripotent epiblast where Xist expression is again extinguished, leading to a second reactivation event. In the ICM, erasure of the epigenetic marks governing donor Xist expression allows subsequent random X inactivation hi the embryo proper.

реактивация д. происходить, когда экспрессия Xist РНК затухает. Если мы учтем, что такие клетки, в которых реактивация Х безусловно происходит (напр., PGCs, ICM клетки, EG и EC клетки), все они сходны с ES клетками в терминах плюрипотентности и пластичности, тогда затухание экспрессии Xist может лежать в основе Х реактивации во всех случаях.

6 Summary and Future Directions


In recent years, there has been significant progress in our understanding of the molecular mechanism of X inactivation. To date, this progress has been fed by advances in related fields of epigenetic research and has, in turn, stimulated advances in other fields. An example of the latter is the growing evidence that some clusters of imprinted genes are regulated by ris-acting noncoding RNAs in much the same way that Xist regulates the X chromosome (see Chapter 19). There is every reason to think that this complementary progress will continue.
Many unanswered questions remain, however, and it is remarkable that despite over 40 years of research, we still do not understand, even in outline, the mechanisms involved in "counting" and "choice." The blocking factor hypothesis, now over 20 years old, provides an attractive conceptual guide, but the nature of the blocking factor itself, if it exists, remains elusive. Progress has been made in defining the c/s-acting sequences and trans-acting factors that regulate counting, and their further elucidation provides an exciting challenge. Similarly, although we now know some of the chromatin-modifying complexes involved in maintaining X inactivation, for example, the Polycomb-group complexes, the signal for establishing chromosome-wide silencing, triggered by Xist RNA, remains unknown. Possibly linked to this, we need to understand the mechanism of histone deacetylation and demethylation on the inactive X. Other key questions are to understand how silencing spreads across the chromosome and what role, if any, way stations (perhaps LINE elements) play in this process and in the stabilization/maintenance of the silent state. This may relate to the intriguing question of how X inactivation is reversed in some cell types and stages of development, but is essentially irreversible in others. This latter question relates to the wider and crucially important issue of understanding genome plasticity and reprogramming through development.
Сайт создан в системе uCoz